Enzymové a jiné markery využívané v diagnostice vybraných patologických stavů Ústav patologické fyziologie LF MU Cíle a význam laboratorního vyšetření •laboratorní vyšetření informují o probíhajících procesech v lidském organizmu a jejich změnách •fyziologických i patologických •změny laboratorních hodnot mohou předcházet projevy nemoci •někt. změny se objevují v minutách od vzniku poškození •70 – 80 % lékařských rozhodnutí závisí na testech •nízké náklady (3 – 5 % celkových) •posledních 5 let nárůst •vyšetřování glukózy •molekulární biologie •cíle •určení diagnózy •stanovení aktivity onemocnění a prognózy •monitorování odpovědi na léčbu •screening •výzkum nemoci myoblobin je nejrychlejší - je ho hodne v cytosolu---je strašně nespecifický- po pádu nebo spréleženinama muze ho mit Rozdělení laboratorních vyšetření •z hlediska dostupnosti •základní •rychle dostupná •speciální •vysoce specializovaná •centralizované provádění •z hlediska požadavků na rychlost provedení •rutinní •statimová •do 60 minut od dodání vzorku •vitální indikace •do 30 minut od dodání vzorku •point-of-care testing •vyšetření na místě •ABR, kyslíkový metabolizmus, diagnostické proužky – krev a moč statim-urgentní vyšetření – dostupná po celých 24 hodin. Jsou určena pro závažné stavy a akutní změny stavu nemocných, kdy výsledky mohou rozhodujícím způsobem ovlivnit péči o nemocné, a jsou provedena přednostně.vitalni-v ohrožení života, urazy zhoršení stavu, pred naléhavoiu operací-ionty, glukoza,urea, kretainin, ABR – acidobazická rovnováha z tepny kapilárkou –poruchy ventilace a respirace-plícní a srceční onemocnění, ledviny, játra, otravy Obecné charakteristiky metody •stanovení požadovaného analytu může být prováděno řadou metod/postupů •různá výpovědní hodnota •spolehlivost metody •dána přístroj. vybavením, kalibrací, správným uchováváním materiálu, kvalitou personálu •parametry •správnost = odchylka výsledku od skutečné hodnoty (náhodné a systematické vlivy) •přesnost •těsnost shody mezi vzájemně nezávislými výsledky analýzy •robustnost (=spolehlivost při běžném používání) •míra kapacity analytického postupu zůstat netečný vůči malým změnám parametrů metod •selektivita – schopnost rozlišovat mezi stanovovanou látkou a ostatními složkami •citlivost – nejmenší zjistitelný rozdíl Validita testu •předpokladem pro validitu testu je analytická spolehlivost •hranice, od které můžeme považovat změnu koncentrace analytu za pozitivní nález •u většiny analytů překryv mezi zdravými a nemocnými •skupina zdravých s pozitivním testem (falešně pozitivní) •skupina nemocných s pozitivním testem (správně pozitivní) •parametry •senzitivita (Se) – pozitivní test = pozitivní diagnóza •Se = správně pozitivní/(správně pozitivní+falešně negativní) •vysoce senzitivní metody jsou dobré pro záchyt, ideálně u závažných léčitelných chorob, kde by neměl selhat screening •specificita (Sp) – negativní test = negativní diagnóza •Sp = správně negativní/(správně negativní+falešně pozitivní) •ideálně 1, v praxi >0.95 velmi dobré, >0.7 ještě použitelné •vysoce spec. metody s nízkou falešnou poz. – konečná diagnóza u závažných chorob (falešná pozitivita = trauma) •efektivita (Ef) = podíl správně určených ke všem vyšetřeným •Ef = správně pozitivní+správně negativní/všichni •zjednodušené vyjádření Příklad: Máme skupinu 10 mužů, z nichž je 8 zdravých a 2 mají nádor prostaty. U všech jsou změřeny hladiny PSA a na základě testů je posláno 6 zdravých mužů domů (SN), 2 zdraví muži (2FP) a 2 muži s nádorem (SP) na biopsii. Specificita testu: 6SN/(6SN+2FP) = 75% specificita Senzitivita testu: 2SP/(2SP+0FN) = 100% senzitivita Výsledek je že díky PSA stanovení jsme zachytili všechny pacienty s nádorem prostaty (100% senzitivita), ale bohužel jsme poslali zbytečně dva zdravé muže na biopsii (75% specificita). Zádný nemá 100% senzitivitu a specificitu,Senzitivitu a specificitu hodnotíme u všech testů včetně zobrazovacích metod (RTG, CT, MRi, etc.). Dokonce i jednotlivé příznaky (dušnost, erythema migrans, svědění, zvýšený bicipitový reflex apod.) mají svou senzitivitu a specifitu pro různá onemocnění.Specificita je pravděpodobnost negativního nálezu u osoby zdravé. Čím vyšší je specificita, tím méně je falešně pozitivních nálezů. Senzitivita je pravděpodobnost pozitivního nálezu u nemocné osoby. Čím vyšší je senzitivita, tím méně je falešně negativních výsledků. Diagnostické testy se zaměřují na vysokou senzitivitu – správný záchyt onemocnění. Referenční interval •raději než normální interval (co je normální?) se volí referenční interval hodnot u jasně definované referenční skupiny osob •co je referenční skupina? •zdraví, nebo spíše osoby bez takového zdrav. stavu, který přímo ovlivňuje / interferuje s měřenou veličinou •stanovení •historicky: x  2 SD •tj. 95% normálně rozložených hodnot •vlivy, které mohou ovlivňovat distribuci •věk, pohlaví, rasa, dieta, … •hodnoty mimo referenční interval •statistická/metodologická variabilita •biologická variabilita •5% zdravé populace mimo obr.1 normální rozložení –gausova křivka –málo metod to splnuje npř. minerály v séru (Na, K, Ca), Většina metod má však rozložení četností jiné; křivka, která toto rozložení znázorňuje, obvykle k vyšším hodnotám spadá pozvolněji, tj. medián je menší než aritmetický průměr. Tak je tomu např. při stanovení glukózy, močoviny, kreatininu, cholesterolu, enzymů AST, ALT, CK obr.2 bimodální distribuce hladiny testosteronu Průběh laboratorního vyšetření •preanalytická část •mimo laboratoř (příprava vyšetřovaného, odběr, uchování a transport biologického materiálu) i v laboratoři •méně kontrolovatelná než analytická část •až 60% chyb •analytická část •dodržování správné laboratorní praxe •interní a externí kontrola kvality – eliminace chyb •postanalytická část •interpretace výsledků Preanalytické vlivy na výsledek vyšetření •osoba pacienta •faktory neovlivnitelné •pohlaví, rasa, věk, cyklické změny •gravidita, současně probíhající jiná nemoc •faktory ovlivnitelné •fyzická aktivita, stres, kouření •vliv alkoholu, potravy a tekutin •léky, operace •odběr vzorku •transport vzorku •uchování vzorku •prvotní zpracování a příprava vzorku k analýze •hemolýza Neovlivnitelné faktory •pohlaví •hemoglobin, haptoglobin, železo •CK, GMT, AK, kyselina močová •rasa •granulocyty •enzymy •genová frekvence •dědičné poruchy metabolizmu •věk •v dětství je referenční rozmezí častěji nižší •vyšší v dětství •ALP, fosfor, lymfocyty •sezonní vlivy •bilirubin, TAG, cholesterol •cyklické změny •diurnální rytmus kortizolu •železo, močovina •gravidita •bílkoviny i jiné látky produkované trofoblastem nebo orgány plodu •α-fetoprotein, placentární ALP •ALP, amyláza, kortizol, cholesterol •současně probíhající jiná nemoc •biol. poločas stanovované látky •falešně negativní výsledek při nevhodné volbě testu •infarkt myokardu referenční intervaly- cokoliv u železa vyšší u mužů kvůli menstruaci-setře se to ve stáří, příjem železa se dá regulovat potravou, výdej ne- u žen je vyšší výdej, děti mají víc lymfpocytů, vyšší alkalickou fosfatázu a fosfor kvůli vývoóji kostrí-rozvíjí se specifická imunita Ovlivnitelné faktory •hmotnost •korelace cholesterolu, TAG, kortizolu, kys. močové s obezitou •stravovací návyky •vysokoproteinová dieta •nárůst močoviny, kys.močové, cholesterolu, fosfátů, kreatinu •kouření •zvyšuje cholesterol, TAG, kortizol, snižuje vitaminy B12 a C •alkohol •chronický abúzus •zvýšení ALT, AST, kortizolu •mírné dávky •přechodné zvýšení HDL •styl života •léky a drogy •vliv na biologické procesy (indukce enzymů, cytotoxicita), interference •fyzická zátěž •závisí na délce a intenzitě (CK, myoglobin) •zevní prostředí •nadmořská výška, teplota, cestování přes časová pásma •mechanické vlivy •svalové trauma – zvýšení ALT, AST, CK, myoglobin kys. močová a obezita-u metabolického syndromu, vysokoproteinová dieta- kreatinin z masa, fyzická zátež zyvšuje kratin-kinázu zvýšená po svalové námaza, myoglobin, nadmořská výška- mění acidobazickou rovnováhu,krvák Faktory ovlivňující preanalytickou fázi •odběr materiálu •označení vzorku, odběrový materiál, technika odběru •transport materiálu •skladování materiálu Příklady zkreslených výsledků Diagnostické markery •cirkulující •ionty •Na, K, Cl, … •metabolity •glukóza, cholesterol, TG, … •odpadní produkty •urea, kreatinin, bilirubin, … •nosiče či látky se specifickou funkcí (nejč. bílkoviny ) •albumin, IgG, fibrinogen, další srážecí faktory, CRP, … •enzymy •secernované •buněčné •markery abnormální proliferace a dediferenciace •mikrobiologické •tkáňové/buněčné •molekulární •proteiny •kvantitativní změna exprese •RNA •kvantitativní změna transkripce (genové exprese) •DNA •kvalitativní průkaz poruchy - např. mutace/polymorfizmy •velké – cytogenetika •malé - PCR •kultivace buněk in vitro •mikrobiologické Nukleové kyseliny Organelles in a cell. INTRACELULÁRNÍ •DNA - jádro, mitochondrie, „exclusome“ •RNA- mRNA a ncRNA (miRNA, siRNA) Hostitelské NK/Infekční částice Organelles in a cell. Liquid biopsy EXTRACELULÁRNÍ •cirkulující cell-free DNA •ncRNA •extracelulární vezikuly – exozomy, mikrovezikuly, apoptická tělíska – nesou gDNA, mtDNA, RNA, proteiny, lipidy Hostitelské NK/Infekční částice/Mikrobiom Nukleové kyseliny CTC- cirkulatin tumor cells, Cf Dna - fragments of nucleic acids present in many fluids of the human body, releas from autophagy an lysis – in plasma, CSF, urine, saliva, pleural fluid- most of is from hematopoietic system in healthy individuals,, exosome- plasmid , NETosis is a process that induces the neutrophil’s death after its contact with exogenous agents Enzymy •biokatalyzátory •snižují aktivační energii •neovlivňují rovnovážný stav reakce •bílkovina (ribozym - rRNA) •holoenzym = apoenzym + kofaktor •kofaktor •prosthetická skupina •koenzym •aktivní místo sedm skupin: oxidoreduktázy, transferázy, hydrolázy, lyázy, izomerázy, ligázy a translokázy (od roku 2018) - společnou katalytickou funkci enzym jednoduchá či složená bílkovina s katalytickou aktivitou, řídí vštšinu bioch.procesů v těle., kofaktor-nebílkovinný-cukry, ionty kovů pros. skupina se váže pevně, koewnzym volně ribozym-štěpi cukr fosfátovou kostru, tvorba pep.vazby, haipiny atd Formy výskytu enzymů •proenzymy (zymogeny) •izoenzymy •primární •sekundární •orgánově, tkáňově či subcelulárně specifické •příklady •laktátdehydrogenáza, kreatinkináza, ALP proenzym-prekurzor, izoenzym-katalyzuje tu stejnou reakci, má odlišnou struktur v jié tkání vnitropolulační izofotrmy-populační genetika Detekce izoenzymů •fyzikálně-chemicky •elektroforéza •chromatografie •imunochemicky •chemicky •stanovení reakční rychlosti za různých podmínek – pH, t, c substrátu Li Q et al. J. Biol. Chem. 1999;274:3764-3771 Lokalizace a vlastnosti enzymů •extracelulární •intracelulární •membránově vázané •cytosolické •organelové • •účinnost •specifita – reakční a substrátová •pracují za mírných podmínek •snadno regulovatelné •složitá struktura •rychlé opotřebování Ck- kreatin kináza –svaly kosterní, myokard, mozek ale i ledviny. rlzn´é izoformy Plazmatické enzymy Faktory ovlivňující koncentraci enzymů v plazmě •aktivita enzymu v buňce •lokalizace enzymu v buňce •propustnost cytoplazmatické membrány •míra poškození buněk •celková masa postižených buněk •rychlost eliminace enzymu •enzymový „vzorec“ orgánu •závisí na •specifické aktivitě enzymu •zastoupení izoenzymů •změna v průběhu ontogeneze •uvolnění enzymů – indikátor poškození SRDEČNÍ MARKERY Laboratorní diagnostika nekrózy myokardu •čím je molekula menší, tím rychleji uvolňována (clearance) •proteiny vázané na membránu jsou uvolňovány > než cytosolické > vázané na kontraktilní aparát •specificita pro myokard = troponiny 100% •klasicky •myoglobin •kreatinkináza (CK) •isoenzym CK-MB •troponiny I a T (TnI a TnT) •aspartátaminotransferáza (AST) •laktátdehydrogenáza (LDH) •nověji •heart fatty acid binding protein (HFABP) •natriuretický peptid B (BNP) •ischemií modifikovaný albumin (IMA) •ve zkoušení •karboanhydráza III •lehké řetězce myosinu (MLC) BNP- nejvic zvýšený u infarktu myokardu a srdečního selhání, ale taky u šoku!!!!§zvýšený u plícních chorob, endokrinních chorob, atdmarker prognozy, srceční selhání, Plazmatické hladiny BNP a NT-proBNP korelují s pokročilostí CHSS Dynamika srdečních markerů V prvních hodinách V horizontu dní Srdeční strukturální a funkční proteiny – časná diagnostika IM •myoglobin •intracelulární protein srdečních i kosterních svalových buněk účastnící se aerobního metabolismu •při poškození buněk se vyplavuje velmi rychle do krevního oběhu (za 0.5 až 2 h) •nejmenší ze srdečních markerů (~18kDa) - rychle se zvyšuje a velmi rychle se odbourává (normalizace do 24 hod.) •vzhledem k výskytu myoglobinu i v buňkách kosterních svalů je markerem nespecifickým •myopatie, úrazy, renální selhání •troponiny •troponinový komplex – součást strukturálních proteinů, které se podílí na kontrakci příčně pruhovaných svalů •heterotrimer složený z troponinů I, T a C •těsně spojen s kontraktilním aparátem – nízké koncentrace srdečních troponinů v oběhu •není-li srdeční sval poškozen, koncentrace TnI je prakticky nulová a to i při poškození kosterního svalstva = vysoká senzitivita •srdeční izoforma troponinu I (TnI) se strukturně liší od analogické izoformy v kosterním svalu – absolutní kardiospecificita Troponiny •výhody stanovení TnI •absolutní kardiospecifita •dlouhá doba vylučování – sledování průběhu •citlivost – detekce menších poškození •není ovlivněn chronickou renální insuficiencí •nevýhody stanovení TnI •pomalejší nástup než myoglobin (nespecifický) Srdeční enzymy •kreatinkináza (CK) •cytoplazma a mitochondrie •katalyzuje reverzibilní přenos fosfátu z ATP na kreatin •ATP + kreatin → ADP + kreatinfosfát •dimer – M (muscle) a B (brain) •3 izoformy •CK-BB – hladký sval, mozek, prostata •CK-MB – myokard (kosterní sval) •40% CK v myokardu •CK-MM – kosterní sval, myokard •CK-MB – diagnóza akutního infarktu myokardu a monitorování reperfuze v průběhu trombolytické léčby AMI •AST •aktivita i koncentrace •LDH Dynamika kardiomarkerů JATERNÍ MARKERY Laboratorní diagnostika v hepatologii •jaterní poškození je v praxi časté •významný vývoj v posledních letech •pokles akutních poškození (HAV, HBV) •nárůst chronických (HCV) •170 mil. osob (3% světové populace) •cirhóza – vzestup mortality •nárůst HCC (5. nejčastější malignita celosvětově) •hepatologie •velký význam laboratorních vyšetření (především biochemické a sérologické) Biochemická vyšetření jater •rozdělení testů •statické – hodnocení okamžité metabolické situace •ALT, AST, GMT, ALP, proteiny, lipidy, bilirubin, žlučové kyseliny •dynamické – určení funkční jaterní rezervy •bromsulfoftalein, galaktóza, lidokain, antipyrin •jaterní vyšetření obecně •často nespecifické •není žádný jednoduchý test, vždy kombinace několika •v počáteční fázi onemocnění – dlouhodobě falešně negativní výsledky •racionální postup a volba vyšetření •standardizace metod v laboratořích není optimální, postupy se liší i mění •opakované vyšetření v časovém horizontu je přínosnější než jednorázové (prognóza) Dělení biochemických vyšetření jater •ukazatelé poškození hepatocytů •ALT, AST, LDH •ukazatelé obstrukce žlučových cest •ALP, GMT •ukazatelé syntetické funkce jater •albumin, CHE, LCAT, PT •testy konjugace a jaterního transportu organických aniontů •bilirubin, urobilinogen Markery poškození hepatocytů •Alaninaminotransferáza (ALT) •L-alanin+2-oxoglutarát → pyruvát+L-glutamát •reverzibilní reakce •syntéza, odbourávání i přeměna aminokyselin •cytoplazmatický enzym •nejvíce je obsažen v hepatocytech, hladina zvýšena již při poruše membránové permeability •Aspartátaminotransferáza (AST) •L-aspartát+2-oxoglutarát → oxalacetát+L-glutamát •reverzibilní reakce •syntéza, odbourávání i přeměna aminokyselin •cytoplazmatický a mitochondriální izoenzym •játra, myokard, kosterní sval, ledviny a pankreas •Uvolnění cytoplazmatického izoenzymu při narušení permeability membrány, uvolnění mitochondriálního izoenzymu při nekrózu Interpretace ALT/AST •zvýšení aktivity ALT i AST u mnoha jaterních chorob •extrémně vysoké hodnoty (10-100x) u toxických a akutních virových hepatitid a šokových stavů •aktivita aminotransferáz v plazmě neříká nic o exkretorické či metabolické funkci hepatocytů •není vždy korelace mezi hladinou aminotransferáz a závažností jaterní léze •De Ritisův index = AST/ALT •méně než 0,7…dobrá prognóza •1 a více…špatná prognóza (nekróza) •za normálního stavu i u většiny jaterních chorob ALT > AST •výjimky - AST/ALT >2 •alkoholické poškození •postnekrotické cirhózy •glutathion-S-transferáza •indikátor hepatocelulárního poškození •vysoká cena a horší dostupnost Příklad Laktátdehydrogenáza (LDH) •tetramer -M (gen LDHA, ch.11) -H (gen LDHB, ch.12) •LDH1 (HHHH) 31-49% •srdce, erytrocyty •LDH2 (HHHM) 38-58% •retikuloendoteliální systém •LDH3 (HHMM) 5.5-16.5% •plíce •LDH4 (HMMM) 0-0.7% •ledviny •LDH5 (MMMM) 0-1.5% •kosterní sval, játra •LDH 1 a LDH 2 – přeměna laktátu na pyruvát ve tkáních s aer. metabolizmem •LDH 4 a LDH 5 – pyruvát na laktát ve tkáních s anaer. glykolýzou onemocnění kosterních svalů hemolytických anemií non-hodgkinských lymfomů a dalších hematologických chorob u testikulárních germinálních tumorů •příčiny zvýšení aktivity v séru •hemolýza (i arteficiální) •stoupá izoenzym H4 •infarkt myokardu •stoupá izoenzym H4 •onemocnění jaterního parenchymu •stoupá izoenzym M4 •onemocnění svalů •zvýšení není tak výrazně •další choroby •perniciózní anémie, tumory, leukémie, embolizace do plicnice Markery obstrukce žlučových cest •alkalická fosfatáza (ALP) •membránový enzym •hydrolýzu fosfátových esterů při alkalickém pH •tetramer, do cirkulace je z membrán uvolňovaný jako dimer •široce rozšířená •játra, střevo a kost (různé izoenzymy) •posouzení kostních a hepatobiliárních onemocnění •značná část jaterní ALP v membránách buněk výstelky žlučových cest – při cholestáze narušení membrán mechanicky a účinkem žlučových kyselin •kromě cholestázy zvýšená i u dalších stavů (tumory jater, cirhóza) •-glutamyltransferáza (GMT) •membránový enzym •játra, ledvina, pankreas, střevo a prostata •katalyzuje přenos  -glutamylu z glutathionu na aminokyselinu a umožňuje tak transport aminokyseliny přes buněčnou membránu. •vyskytuje se hlavně v játrech, ledvinách, tenkém střevě a v prostatě •posouzení hepatobiliárních onemocnění Markery syntetické funkce jater •albumin •tvořen v játrech, určení hladiny v séru •dlouhý poločas – neklesá u akutních poruch •vyloučení jiné příčiny poklesu (malabsorpce, snížený přívod bílkovin, onemocnění ledvin) – jde o jaterní poškození •výrazné snížení u alkoholických cirhóz •cholinesteráza •sekreční enzym produkovaný jaterními buňkami do krve •v plazmě katalyzuje hydrolytické štěpení esterů cholinu a některých dalších substrátů •syntéza cholinesterázy a s tím i její aktivita v plazmě klesá v případě poškození jaterního parenchymu nebo při nedostatku proteinů v dietě •nevratně je enzym inhibován organofosfáty Markery syntetické funkce jater •hemokoagulační faktory •tvořeny v játrech, krátký poločas – jejich změny jsou rychlé •Quickův test – vnější cesta aktivace koagulačního systému •hodnoty se mění u onemocnění jaterního parenchymu provázených poruchou proteosyntézy •nebo u obstrukčního ikteru s poruchou vstřebávání tuků a v nich rozpustných vitaminů Point of care testing (POCT) •zajišťuje testování v místě péče o pacienta •rychlá stanovení • - u lůžka pacienta (centrální příjem, jednotky intenzivní péče) - v ordinacích praktických lékařů a specialistů - sebetestování chronicky nemocných doma (Near patient testing) •diagnostické přístroje s jednoduchým ovládáním • •POCT analyzátory (miniaturizace v klinické diagnostice) - zařízení do ruky, stolní analyzátory či zařízení na jedno použití - konstruovány pro obsluhu pracovníky bez specializovaného laboratorního vzdělání - jednoduchý způsob obsluhy - vysoce rozvinutý systém autodiagnostiky - minimálním požadavky pro kalibraci, kontrolu a údržbu •jednorázové (kvantitativní/kvalitativní) nebo k opakovanému měření •plná venózní heparinizované krev nebo moč •nejčastější testy: parametry acidobazické rovnováhy, glukózu a ionty (Na+, K+ a Cl-), kardiální markery (troponin T, myoglobin, NT-proBNP), drogy atd. Výhody POCT •optimalizace úvodního vyšetření pacienta a cílené odebrání anamnézy •rychlá analýza z plné nebo kapilární krve (malý objem vzorku) •získání výsledku v době, kdy se lékař plně věnuje pacientovi •zkrácení analytického času odezvy (krátká doba čekání pacienta) •cílená změna péče v případě časného získání výsledku (rychlost může zachránit život) •možnost zlepšení kvality života pacienta •malá velikost, snadný transport, snadná instalace, snadná obsluha, minimální údržba •možnost využití v terénu a v zemích třetího světa • • • •omezené spektrum prováděných testů •většinou nelze vybrat jednotlivé testy, ale je třeba provádět celý panel vyšetření Nevýhody POCT POCT • diagnostické použky pro jeden nebo více analytů ( glukóza, chemické vyšetření moče) •imunoanalytické kazety - kvalitativní či kvantitativní (drogy, kardiomarkery, okultní krvácení) - kazety obsahují biosenzory - detekce založena na měření reflektance, fluorescence či optického signálu •POCT přístroje: stolní/do dlaně - k opakovanému měření - na jednotkách intenzivní péče, urgentním příjmu, operačních sálech - využívají senzory nebo diagnostické proužky - nejčastěji měří glukózu, laktát, ureu, krevní plyny - senzory bývají umístěny společně s kalibrátory a reagenciemi do jedné kazety -glukometr Accu-Chek Active (doba měření cca 5 s) -ABR analyzátory (využití senzorů, analýza derivátů hemoglobinu -založena na spektrofotometrii s měřením multi vlnové délky (60 a více) -Analyzátor AQT 90 Flex, Radiometer - stanovení kardiálních markerů vč. NT-proBNP, stanovení βhCG, CRP a D-dimeru – sendvičová imunoalanlýza (20min) -Koagulometr – CoaguCheck, Roche (domácí test při léčbe Warfarinem) -Accutrend Plus – stanovení cholesterolu, TG, glukózy, laktátu -Cholesterolmeter Easy touch - stanovení glukózy, kys.močové a cholesterolu jednorázové vs přístroje Nové markery Molekulární analýza sliny ̶ Slina jako diagnostické medium ̶ bohatý rezervoár peptidů, proteinů a NK ̶ složky slin se prokazatelně mění v reakci na určitá onemocnění a stavy ̶ více než 100 molekul detekovaných ve vzorcích slin je hodnoceno jako potenciální diagnostické nebo prognostické biomarkery pro různá onemocnění (např. zubní kaz, parodontitida, rakovina, cukrovka) https://doi.org/10.1111/prd.12099 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008058 ̶ Salivaomika  pojem zaveden 2008  spojuje znalosti o různých „omických“ složkách sliny (proteom, transktiptom, metabolom, mikrobiom, …)  využívá high-throughput technologie (genomika, transkriptomika, proteomika, metabolomika, lipidomika a mikrobiomika, …)  analýza sliny  identifikace biomarkerů Molekulární analýza sliny ̶ Slina jako diagnostické medium Výhody: ̶ odběr neinvazivní, snadný, bezbolestný, opakovatelný (trvalá dostupnost materiálu), i nevyškolený personál, lze u všech věkových kategorií ̶ vzorek o velkém objemu, stabilní v čase, zpracování rychlé, levné ̶ potenciál nahradit krev při screeningu, diagnostice a prognóze onemocnění https://doi.org/10.3390/ijms17060846 https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008058 Molekulární analýza sliny https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008058 https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9 https://www.aacc.org/cln/articles/2013/january/saliva ̶ Slina jako diagnostické medium Limitace: ̶ korelace hladin biomarkerů sérum/slina ↓↓↓ koncentrace analytů v porovnání se sérem  ↑ objem vzorku slin, detekční limit metody, deplece abundantních proteinů (PRPs, α-amyláza, albumin, muciny and sekreční IgA mohou tvořit až 80 %), osmolalita ̶ vysoká variabilita  horší reprodukovatelnost výsledků •technická (odběr, zpracování, použitá metoda) •inter- (věk, pohlaví, fyziologický stav) a intraindividuální (cirkadiánní, cirkanuální) •biologická (vliv stavu dutiny ústní, cirkadiánní rytmus, systémová onemocnění (Sjögrenův syndrom), léčiva, chemo/radioterapie)  objem a složení slin •rychlost a stimulace toku slin  koncentrace slinných biomarkerů •proteolytické enzymy (mikrobiom/hostitel)  stabilita určitých biomarkerů ̶ otázka standardizace  vztažení proteinových markerů k celkovému proteinu sliny (stejná osoba jako vzorek i kontrola)  standardizace používaných metod, validace protokolů  zohlednění všech proměnných (variabilita složení, místo odběru, rychlost toku, objem vzorku, stimulace, kontaminace krví, odběrové soupravy, integrita analytu)  otázka validace biomarkerů pro klinické aplikace •verifikace  stanovení biomarkeru různými technikami, dosažení podobných výsledků •validace  preklinická  definitivní akademická (prospektivní odběr vzorků, retrospektivní evaluace)  multicentrické studie Molekulární analýza sliny ̶ Slina jako diagnostické medium Tekutá biopsie (liquid biopsy) ̶ u nádorových onemocnění ̶ nahrazují tradiční tkáňovou biopsii ̶ testy detekují: cirkulující nádorové buňky exomy nádorovou DNA, nádorovou RNA a proteiny (šíříení do krevního řečiště nebo slin z primární léze) Table describing examples of commonly analyzed biomarkers in whole mouth saliva; CRP – C-reactive protein; HPLC – high performance liquid chromatography; IC – ion chromatography; LC-MS – liquid chromatography mass spectrometry; MALDI-TOF MS - matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry; RT-LAMP – reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification; AOPP – Advanced Oxidation Protein Products; TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances; TAC – Total Antioxidant Capacity; FRAS – Free Radical Analytical Systém. Klin. Biochem. Metab., 26 (47), 2018, No. 1, p. 21–26 https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9 Janšáková et at., Molekulární analýza sliny ̶ Slina jako diagnostické medium „Omiky“ ̶ DNA (genomika a epigenomika - rakovina) ̶ RNA (transkriptomika - biomarkery pro chronickou parodontitidu, Sjögrenův syndrom, rakovinu plic, vaječníků, prsu a slinivky) ̶ proteiny (proteomika - Sjögrenův syndrom, Downův syndrom, schizofrenie) ̶ metabolity (metabolomika – rakovina ústní dutiny, hepatocelulární a kolorektální karcinomy, parodontitida, chronické onemocnění ledvin) ̶ lipidy a mikrobiom (lipidomika, mikrobiomika)… ̶ souběžná analýza stovek analytů  přesná detekce malých změn ̶ vysoká citlivost, kvantitativní výsledky ̶ analýza souboru biomarkerů pro dané onemocnění ̶ zatím žádná v klinické aplikaci  snahy o „point-of-care“ testování https://doi.org/10.3390/bios11100396 https://doi.org/10.1007/978-3-030-37681-9 Molekulární analýza sliny ̶ Slina jako diagnostické medium – zubní kaz ̶ žádný diagnostický test ̶ testy náchylnosti k zubnímu kazu  mikrobiologická laboratoř  stanovení přítomnosti kariogenní mikroflóry  kvantitativní určení přítomnosti fermentujících mikroorganismů ve slině  stanovení pufrovací kapacity slin a rychlosti sekrece slin  kvantifikace kolonií plísně Candida albicans ̶ snahy o vztažení prevalence zubního kazu k fenotypu určeném ze sliny  rozporuplné výsledky Molekulární analýza sliny ̶ Slina jako diagnostické medium –biomarkery onemocnění ̶ autoimunitní onemocnění Sjögrenův syndrom – α-amyláza, karbonická anhydráza VI, laktoferin, β2-mikroglobulin ̶ neurodegenerativní onemocnění Alzheimerova choroba – celkový tau protein, fosforylovaný tau protein, amyloid-β a alfa-synuklein ̶ genetické onemocnění 2- cystická fibróza – Ca, PO4 , Na, K, Cl, ↓ objem slin, močovina, kyselina močová, prostaglandin E2 ̶ rakovina spinocelulární karcinom – IL-8, IL-6, IL-1β, IL-4, IL-1, VEGF, HER2, tissue polypeptide antigen (TPA) and EGFR, LDH, N-α-acetyltransferase 10 protein (Naa10p), carcinoembryonic antigen (CEA) protein, serum basic fibroblast growth factor (bFGF), transferin, cyklin D, Maspin, specifické mRNA r. prsu - HER2/neu (C-erbB-2), VEGF, EGF, specifické mRNA, autoprotilátky proti HER2 a MUC-1 r. slinivky – transkriptomické markery mRNA (KRAS, MBD3L2, ACRV1 a DPM1), specifické miRNA, laktoperoxidáza, Cyklofilin B, Cytokeratiny (14, 16 a 17) ̶ alergie potravinová alergie - IgE a IgG1 https://doi.org/10.1016/j.medntd.2022.100115 doi:10.7759/cureus.7708 Molekulární analýza sliny ̶ biomarkery onemocnění ̶ kardiovaskulární onemocnění CK-MB, myoglobin, troponin I, myeloperoxidáza, markery zánětu (CRP, TNF-α, MMP-9), markery adheze (rozpustný CD40 a ICAM-1) ̶ metabolismus diabetes melitus 2. typu – 1,5-anhydroglucitol, CRP, leptin, IL-6, TNF-α ̶ infekční onemocnění HIV – protilátky proti HIV viry – přítomnost protilátek IgM/IgA, virová RNA Kandidóza, amébiáza – přítomnost Candida sp., Entamoeba histolytica (protilátky) Hepatitida – přítomnost DNA viru HBV Peptidické vředy, gastritida, – přítomnost Helicobacter pylori (IgG protilátky, DNA H. pylori) ̶ hormonální nemoci Cushingův syndrom a Addisonova choroba – kortizol pohlavní hormony – syndrom polycystyckých ovarií, menopauza/andropauza, anovulace, hypogonadismus, hyperestrogenismus https://doi.org/10.1016/j.medntd.2022.100115 doi:10.7759/cureus.7708