Andrologie
Soňa Kloudová
sona.kloudova@med.muni.cz
16.4.2024
Speciální metody selekcespermií
• Metody založené na koncentraci spermií, na změnách v napětí spermií, morfologii, motilitě,
integritě membrán nebo integritě DNA
• Vývoj navazuje na pokroky v andrologické diagnostice
• Vyšší cenové náklady, vyšší nároky na vybavení laboratoře a na čas nutný ke zpracování vzorku
• Možnost indikace nejvhodnější techniky selekce spermií
• Diskutabilní výsledky – obvykle není jednoznačně prokázán pozitivní vliv na THBR (take home
baby rate); HFEA „semafor“
MACS
Magnetic activated cell sorting
- umožňuje selekci spermií na základě povrchových antigenů
MACS ART Annexin V system
• kit k odstranění apoptických spermií (fosfatidylserin – annexin V – drobná kovová
nanočástice/kulička → průchod zmagnetizovanou kolonkou) → zisk neapoptických spermií
• lepší funkční kvalita, nižší fragmentace DNA
• MACS lze kombinovat s předchozí
gradientovou centrifugací nebo se swim-
up
• Pozor na viskózní vzorky a želatinové
inkluze -existuje možnost ucpání kolony
• Nevhodné na nízké koncentrace (pod
milion/ml)
Mikrofluidnísystémy
• Napodobení přirozených bariér, kterými spermie pronikají in vivo
• Neobsahují krok centrifugace spermií, šetrné ke vzorku
• Rychlé, pohodlné zpracování
• Vyšší cena než u běžného zpracování
• Selekce na základě motility spermií (kanálky, membrány s póry) – praktické využití v IVF
(mikrofluidní čipy)
• Selekce na základě termotaxe, chemotaxe, rheotaxe
• Pasivní selekce (na základě velikosti a hustoty buněk)
• Selekce na základě pohlaví (využívá fotonické technologie rozlišující spermie nesoucí X a Y na
základě rozdílného obsahu DNA)
Pasivní mikrofluidní selekce
- selekce na základě velikosti a hustoty
buněk při průchodu spirálovým
mikrokanálkem, kdy větší buňky mají
tendenci migrovat k vnějšímu okraji
kanálku, menší buňky zůstávají blíže
středu kanálku
- spíše experimentální, vyvinuto na
spermie potkana
Microfluidics for sperm sorting: a review - Microfluidic Reviews - Elveflow
Kombinace mikrofluidiky s Ramanovou spektroskopií
- dynamické vysokorychlostní zobrazování
- rozlišení spermií s intaktní DNA
- digitální zobrazování přímo na čipu- 3D zobrazování bez
použití barvení –využití digitálního optoelektronického
senzoru
- Principem digitální rekonstrukce 3D obrazu je záznam
rozdílu interferenčního vzoru mezi referenční světelnou
vlnou a světelnou vlnou rozptýlenou vzorkem
- Zatím experimentálně
https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Health_Care/Li
fe_Sciences/Genomics/Raman_Analysis_of_Sperm_Nuclear_DNA_Inte
grity.pdf
Fertile(850 µl) Sperm Separation Device
850 µl ejakulátu se umístí pomocí tuberkulinky do
spodní komory čipu, odkud spermie migrují přes
membránu s mikropóry do média (750µl)
naneseného nad membránu. Čip se umístí v
petriho misce na 30 minut do 37°C. Následně je
tuberkulinkou staženo médium s vyselektovanými
spermiemi
-zisk populace motilních spermií s nižším podílem
spermií s fragmentovanou DNA a s nižším podíle
aneuploidií
- rutinně v praxi
-výhodou je, že se vzorek necentrifuguje!
Fertile ICSI
Čip obsahuje 5 kanálků – kanálky naplníme „menším
otvorem“ 15 µl média a další kapku média umístíme do
„většího otvoru“
Do menšího otvoru následně vpravíme 2 µl ejakulátu a
ponecháme 30 minut inkubovat v 37°C (v petriho misce).
Následně odebereme z většího otvoru médium se
spermiemi pro ICSI
- rutinně v praxi
Vazba spermie k hyaluronanu
• Vazba spermie na hyaluronan – zralost spermie, funkčnost
akrozomu, funkční kvalita, DNA fragmentace, fyziologický
princip (hyaluronan je hlavní složkou ECM kumulárních
buněk)
• zdlouhavější pro embryologa – selekce spermií probíhá po
běžné přípravě vzorku na andrologii až na speciální misce v
embryologické laboratoři těsně před ICSI
• PICSI a SpermSlow
•rutinně v praxi
•kombinovatelné s různými druhy zpracování spermií, pouze
je třeba dostatečný zisk spermií
•PICSI – (physiological itracytoplasmic sperm injection) speciální hyluronanem potažená miska, spermie
přilnou a vykazují specifický pohyb
• SpermSlow – imobilizační médium obsahující hylaluronan, přidává se přímo na ICSI misku v blízkosti PVP
(médium ke zpomalení spermií) a následně pomocí ICSI jehly jsou obě média propojena a embryolog vybírá
spermie zachycené v médiu s hyaluronanem
IMSI
• intracytoplasmic morphologically selected sperm injection
• 6000x
• MSOME- motile sperm organelle morphology examination
• Kombinace vysokého zvětšení a Nomarskiho interferenčního
kontrastu → výběr spermií s dobrou morfologií a s velmi nízkým
počtem vakuol
https://fertilitypedia.org/edu/therapies/msome
SelekcespermiípomocíZeta potenciálu
• Membrána spermií je negativně nabitá (silně negativně nabitý
povrch-maturované spermie s vyšší pravděpodobností intaktní
DNA)
• Principem metody je buď přilnutí nabité spermie ke stěně
zkumavky a nebo migrace v elektrickém poli
• V obou případech dochází k selekci spermií s vyšší integritou
DNA (v porovnání s gradientovou centrifugací nebo i s
metodou MACS)
• Pro aplikaci metody do běžné klinické praxe je nutné provést
další studie
Kizilay at Altay 2017
Zpracovánítestikulárnítkáně
Z varlete je vzorek nejčastěji získáván otevřenou biopsií.
Získaný vzorek je kontaminován různými buňkami a krví.
V průběhu zpracování je nutné rozvolnit semenotvorné kanálky a uvolnit vazby elongovaných spermatid
• Mechanické rozvolnění (WHO 2010): lze použít k vytlačení buněk ze semenotvorných kanálků tenké injekční
jehly, méně častý přístup je pak použít k rozvolnění tkáně v médiu krycí sklíčka- třeme tkáň, dokud nevytvoříme
jemnou hmotu
Další možný přístup je použít sterilní sítko s třenkou, kterou rozvoníme tkáň na sítku a vytlačíme obsah
semenotvorných kanálků, přes sítko pak provedeme oplach malým množstvím média a získáme tak suspenzi
buněk prostou větších kusů tkáně
• Enzymatické rozvolnění (WHO 2010): vzorek se inkubuje 1,5-2 hodiny v médiu s kolagenázou (37°C) a každých
30 minut je vortexován, následuje centrifugace vzorku 100g/10 minut a vyšetření sedimentu
http://brazjurol.com.br/september_october_2011/Esteves_570_583.htm
Zpracováníaspirátuz nadvarlete
• K aspiraci spermií z nadvarlete se přistupuje zejména při obstrukční azoospermii
• Umožňuje získat vzorek –aspirát- s relativně velkými počty spermií, který je současně minimálně
kontaminován jinými buňkami a krví.
• Pokud se ve vzorku nachází relativně vysoké počty spermií, je možné vzorek zpracovat gradientní
centrifugací.
• Pokud se ve vzorku spermií vyskytuje málo, volíme prostou centrifugaci vzorku
https://www.hindujahospital.com/hindujaivfcentre/services/surigal-retrieval-sperm.html
Retrográdníejakulace
Stav kdy při ejakulaci dojde k vypuzení ejakulátu z pohlavních cest
do močové trubice, odkud je ejakulát zpětně vypuzen do močového
měchýře.
U muže se tento stav projevuje jako aspermie (absence ejakulátu),
případně velmi nízký objem ejakulátu (v řádu několika set
mikrolitrů).
Příčiny mohou být vrozené i získané. Stav se potvrzuje vyšetřením
přítomnosti spermií v moči po ejakulaci.
Zpracování vzorků při retrográdní ejakulaci:
Před odběrem je třeba provést alkalizaci moči pomocí běžně dostupné jedlé sody – zvýšení pH moči zvýší
šanci spermií na uchování pohyblivosti a ostatních funkcí. Pacient by měl vypít roztok s hydrogen uhličitanem
sodným večer a ráno před odběrem vzorku.
Před odběrem ejakulátu by se měl pacient „částečně“ vymočit, ihned po masturbaci se pacient vymočí do
odběrové nádobky obsahující médium pro spermie (případně ještě i odevzdá odběrovou nádobku s
ejakulátem, pokud byl nějaký získán). Vzorek moči je pak centrifugován 500g /8 minut, sediment je naředěn
a dál zpracován prostou centrifugací vzorku nebo gradientní centrifugací.
Zpracovánívzorkůodebraných„asistovanouejakulací“
- muži s poruchou ejakulace (typicky při poranění míchy)
- penilní vibrostimulace nebo rektální elektrická stimulace
- muži s poruchami míchy mají často vysoké koncentrace spermií, nízkou pohyblivost a vzorek
bývá infiltrován červenými a bílými krvinkami
-efektivní je zejména gradientová centrifugace
Výběrživýchspermiíu imobilníchvzorků
Laser Assisted immotile sperm Sellection
- Laserový výstřel je aplikován do blízkosti špičky bičíku
spermie – živá spermie reaguje zkroucením bičíku , tzv.
„curling“
Chemická aktivace pohybu
- teofylin, pentoxifylin, papaverin
Sperm Mobile – teofylin – inhibice fosfodiesterázy →
zvýšení koncentrace cAMP → stimulace pohybu
https://fertilitypedia.org/edu/therapies/laser-assisted-
immotile-sperm-selection-1
• HOS test – hypo-osmotic swelling test –živé spermie v
hypoosmotickém prostředí „nabobtnají“, díky čemuž svinou
bičík
• MTT – mechanical touch test –při laterálním dotyku jehlou
by měl být bičík živé spermie „pružný“
• PLM – polarizační mikroskopie- hlavičky živých spermií jsou
při průchodu polarizovaného světla dvojlomné
Ke shlédnutí :
(131) SpermSlow™ - Approaching physiological ICSI – YouTube
(131) MACS: Getting good quality sperm for ICSI..Live demo – YouTube
(131) HOS - Hypo Osmotic Swelling is a Sperm Function Test / Measure of Sperm's Fertility Potential – YouTube
(131) HOS test for identifying live sperms in testicular tissue - YouTube