Elektroforetické techniky David Zeman 2024 s využitím výukových materiálů prim. RNDr. Ludmily Nováčkové (1957-2011, FN Ostrava) a Mgr. Jany Gottwaldové (MOÚ Brno) Pojmy a definice • Elektroforéza = pohyb nabitých částic v elektrickém poli; 3 základní techniky: • Zónová elektroforéza: homogenní pufrovací systém - konstantní pH; migrační vzdálenosti během definované doby dělení odpovídají elektroforetickým mobilitám dělených látek; lze aplikovat na neamfoterní i amfoterní molekuly; difúze snižuje senzitivitu detekce i rozlišení • Izotachoforéza (ITP): dělení v diskontinuálním systému pufrů, ionizovaný vzorek migruje mezi vedoucím elektrolytem s vysokou mobilitou a terminálním elektrolytem s nízkou mobilitou; lze dělit buď pouze kationty nebo pouze anionty (ne obojí současně); všechny složky směsi se pohybují stejnou rychlostí; složky směsi jsou rozdělené podle svých elektroforetických mobilit • Izoelektrická fokusace (IEF): dělení v gradientu pH, lze použít pouze pro amfoterní látky řpeptidy a bílkoviny); molekuly migruji do svých izoelektrických bodů; samozaostřující (fokusacní) efekt brání difúzi • Kapilární elektroforéza (capillary electrophoresis, CE) Teoretické základy elektroforetických metod • P e = q • E ( q = z ■ e ) • Ffr = f c ' V • V rovnováze: Fe — Ffr q-E = fc-v v = — = u • E fc u je mobilita neboli elektroforetická pohyblivost nabité částice, tj. rychlost jejího pohybu v elektrickém poli o jednotkové intenzitě. Je to veličina charakteristická pro danou látku. V průběhu separace se dostávají dopředu nabité částice, Které mají větší pohyblivost, a opožďují se částice s menší pohyblivostí. Tím dochází k oddělení složek směsi. Elektroforetická pohyblivost částice u • Pro kulovitou částici platí: q z - e fc 6n • r\ • r • Peptidy a proteiny však nejsou kulovité. Mobilita uje u nich nepřímo úměrná molekulové hmotnosti podle vztahu — q (exponent ve jmenovateli je udáván různě mezi 1/3 a 2/3) U slabých kyselin a zásad je pro rychlost migrace rozhodující efektivní mobilita uef daná vztahem i Kde a, je stupeň disociace. Ten lze ovlivnit vhodnou volbou pH elektrolytu. nstrumentace - 3 základní komponenty: • Zdroj stejnosměrného napětí • Chlazení (termostat) • Elektroforetická vana/deska • Uspořádání - horizontální - vertikální Elektroforetické komory dle uspořádání vertikální • Gely ve skleněných trubičkách nebo mezi skleněnými deskami obklopeny pufrem • Vzorky se dávkují shora (aplikační jamky vytvořené pomocí hřebínků) horizontální • Gely na inertních fóliích, povrch není uzavřený • Vzorky se pipetují přímo do aplikačních jamek nebo do aplikátorů (event. na proužky filtračního papíru) • Na gel se aplikují proužky filtračního papíru s koncentrovaným pufrem • Lze použít tenčí gely na fóliích, které lze účinněji chladit než vertikální gely - rychlejší dělení s ostřejšími zónami Srovnání vertikálních a horizontálních systémů vertikální • Lze použít gely větší tloušťky, proto lze aplikovat větší množství vzorku • Chlazení z obou stran • Snazší blotting z gelů o větší tloušťce • Lze separovat paralelně na více gelech • Komplikovaná aplikace vzorku u tenčích gelů • Nevhodné pro IEF horizontální • Nelze použít gely větší tloušťky protože je lze chladit jen zespodu • Lze separovat jen na 1 gelu/přístroj • Univerzální pro nejrůznější metody ideální pro IEF • Stripy nasycené pufrem místo velkých objemů tekutých pufrů • Snadný provoz a čištění • Vyšší elektrická bezpečnost Průběh vertikální elektroforézy (Mini-PROTEAN Tetra Cell systém, Bio-Rad) začátek - aplikace obarvených vzorků do jamek v průběhu separace migruje k anodě nejrychleji barvivo Průběh vertikální elektroforézy Když barvivo doputuje k anodickému konci gelu, separaci zastavíme. Gel vyjmeme a barvíme. Stanovení fenotypu haptoglobinu v 7,5% polyakrylamidovém gelu (Mini-PROTEAN TGX Precast Gel, Bio- Rad), 150 V, 2,5 hod Horizontální elektroforéza SDS elfo v polyakrylamidovém gelu, aplikace obarvených vzorků ke katodě, elektrody položeny na katodickém (bezbarvém) a anodickém (modrém) gelovém stripu. V průběhu elektroforézy migruje bromfenolová modř (BPB), která je součástí vzorkového pufru, těsně před SDS. Když je BPB kompletně v anodovém stripu, separaci ukončíme. (Lépe: použít předobarvenou sadu markerů molekulové hmotnosti - když je marker 10 kDa těsně před anodovým stripem, STOP.) Zónová elektroforéza • Nativní - dělení bílkovin podle náboje, v gelech se sítovým efektem přistupuje faktor velikosti a tvaru molekuly • SDS-elektroforéza- dělení bílkovin podle velikosti molekuly (SDS = dodecylsíran sodný-váže se na bílkoviny v poměru 1,4 g SDS na 1 § bílkoviny, uděluje jim negativní naboj - všechny bílkoviny migrují k anodě, malé molekuly rychleji, velké molekuly pomaleji); v redukujícím prostředí (beta2-merkaptoethanol, dithiothreitol) se bílkoviny rozpadají na podjednotky a z SDS elfo lze dobře odhadnout M.h. • Kontinuální uspořádání - 1 gel, 1 puf r • Diskontinuální uspořádání (Ornstein a Davis, 1964) -koncentrace vzorku na startu pomocí koncentrujícíno gelu na izotachoforetickém principu - zlepšení rozlišení Zaostřující („stacking") gel má větší póry a obsahuje 0,125 mol/L Tris-HCI puf r o pH 6,8 Separačnígel s malými póry obsahuje 0,375 mol/L Tris-HCI pufr o pH 8,8 Elektrodový pufr obsahuje pouze glycin (pl 6,7 - při pH 6,8 téměř nenabity - nízká pohyblivost) V zaostřujícím gelu migrují bílkoviny na izotachoforetickém principu v pořadí podle svých mobilit. Na hranici se separačním gelem se prudce zvýší odpor pro velké molekuly bílkovin, glycin získá záporný naboj a „přeskočí"proteiny, které se v separačním gelu dělí podle náboje a velikosti Pozn.: pro bílkoviny s pl >7 je nutné použít jiný pufrový systém Média pro zónovou elektroforézu • Papír • Škrob • Acetylcelulóza • Agar • Agaróza • Polyakrylamid Agaróza (vlevo) a polyakrylamid (vpravo - znázorněn princip přípravy z a kry lam id u a N, AT- methylenbisakrylamidu) OH OH H' CH, 9 cwj S h ■ i ^—Cm ■i' w ■ CH .ynnírn um F+r;J.i»atí TEMED —CM—CHj— CH—CHj— CK—CHj—ÍW—Qri — Ml MH, Výhody a nevýhody agarózových a polyakrylamidových gelů Agarózový gel Polyakrylamidový gel Výhody Netoxické Jednoduchá příprava Ideální pro dělení vysokomolekulárních bílkovin (>500 kDa) Velké póry (150 nm u 1% agarózy) - do nich mohou difundovat imunoglobuliny proto je možný specifický průkaz bílkovin přímo v gelu pomocí imunofixace Velmi stabilní a průhledné Téměř žádná elektroendoosmóza Dobrý sítový efekt (malé póry - 5,3 nm v gelu s 5% T a 3% C; 3,3 nm v gelu s 20% T a 3% C) Jednoduchá manipulace s gelem po separaci Vhodné pro řadu barvicích metod Nevýhody Vždy přítomna určitá elektroendoosmóza Malý sítový efekt pro bílkoviny o M.h. <100 kDa Nejsou zcela průhledné Některá barvení (např. stříbření) jsou obtížně proveditelná (dochází k silnému zbarvení pozadí) Monomery jsou toxické Velikost pórů limituje velikost molekul, které lze dělit (proteiny o M.h. >800 kDa nevstoupí do gelu) Zásadité gely mohou být skladovány jen krátkou dobu (časem dochází k jejich hydrolýze) Detekce separovaných bílkovin • V gelu: • Fixace (chemicky - např. 20% TCA, teplem -sušení gelu - denaturace proteinů, zamezení difúze; použitím specifického antiséra s následným odmytím ostatních bílkovin) • Barvení: - Coomassie Blue - Amidočerň - Kyselá violeť - Stříbření - Fluorescenční barvení (např. SYPRO Ruby) Po od mytí přebytku barviva se gel suší. Elf q bílkovin séra - postup heslovitě: MIGRACE -SUŠENI - BARVENI - ODBARVENÍ - SUŠENÍ • Na membráně (nitrocel u lóžové, PVDF) po přenosu proteinů z gelu („western blotting") - Možnost imunodetekce s chromogenní, fluorescenční nebo chemiluminiscenční koncovkou (protilátka značená peroxidasou -> přídavek substrátu - bezbarvého chromogenu, který se v přítomnosti H202 oxiduje na barevný produkt, který musí být nerozpustný (např. diaminobenzidin; nebo: oxidace luminolu -> luminiscence) Izotachoforéza řecky isos = stejný, tachos = rychlost • Všechny ionty migrují stejnou rychlostí • Složky směsi jsou rozděleny v „iontovém vlaku" • Samozaostřovací efekt • Efekt regulující koncentraci (Kohlrauschova regulační funkce): kde cA = koncentrace analytu; cL = koncentrace vedoucího elektrolytu; /i = pohyblivost (mobilita) analytu (A), vedoucího elektrolytu (L) resp. protiiontu (Q) • Předpokladem ITP separace je diskontinuální pufrovací systém s vedoucím (leading, L) a terminačním (terminating, T) elektrolytem • U běžnější separace aniontů je L (příklad: Cl) na anodické a T (příklad: Gly) na katodické straně. Protiion je společný (příklad: Tris+) Izoelektricka fokusace (IEF) Focusing chamber pH 3456769 10 coon /< rJ»i coon r^/pf J£Sax* co^moh ^^-W Cathode H (+2) (0) (-2) Met charge Izoelektrická fokusace • Dělení amfoterních látek (peptidů, proteinů) podle jejich izoelektrického bodu Apl = rozlišovací schopnost D = difúzni koeficient bílkoviny E = síla elektrického pole (V/cm) d(pH)/dx = pH gradient du/d(pH) = směrnice mobility bílkoviny v izoelektrickém bodu Způsoby provedení IEF podle účelu • ANALYTICKÁ IEF (pro analýzu peptidů a proteinů) • agarózový gel • polyakrylamidový gel - s nosičovými amfolyty (oligoamino-oligokarboxylové kyseliny) - s imobilizovaným pH gradientem (bifunkční /nikoliv amfoterní!/ akrylamidové deriváty s pufrující skupinou /karboxyskupina nebo terc. amin/ navázanou na dusík aminoskupiny) • PREPARATIVNÍ IEF (cílem je získat relevantní množství daného peptidu/proteinu po jeho separaci ze směsi) • Dextranový gel s nosičovými amfolyty • Izoelektrické membrány (polyakrylamid s Imobiliny - každá membrána má příslušnou hodnotu pH) • Off-gel IEF: na IPG - proužcích (frakcionační rámeček s 24 komůrkami se přiloží na povrch IPG proužku) IPG-gely získáme při nalévání gelu kontinuální změnou mísícího poměru Immobilinů (podobně jako při nalévání gelu s gradientem velikosti pórů) - principem je acidobazická titrace, aktuální hodnota pH je definována Henderson-Hasselbachovou rovnicí: Je-li pufrujícím Immobilinem zásada: pH = pKB + log- CA • Je-li pufrujícím Immobilinem kyselina: CB pH = pKA + log--— CA ~ CB Nábojové vlastnosti AK a bílkovin • Při pH < pl jsou kationty • Při pH = pl jsou amfolyty navenek elektroneutrální • Při pH > pl jsou anionty • Disociační konstanty Kx a K2 jsou vyjadřovány logaritmicky jako pK = pH, při kterém se v roztoku nacházejí stejná množství protonovaných (asociovaných) a ne proton ováných (disociovaných) forem • pl = izoelektrický bod = pH, při které molekula existuje jako amfolyt s nulovým výsledným nábojem • pl = Yz [pKx + pK2]; u AK s ionizovatelnou skupinou v postranním řetězci uvažujeme hodnoty pK „na obě strany" od elektroneutrálního zwitteriontu (pl leží mezi hodnotami pK zwitteriontu a jeho konjugované kyseliny) • Při fyziologickém pH je většina bílkovin záporně nabitá Analýza titračních křivek: gel s amfolyty - po lEF (vytvoření pH gradientu) otočíme gel o 90° a do žlábku naneseme analyzované bílkoviny, necháme probíhat elektroforézu. Kde je pl hledané bílkoviny? obr. z: Westermeier R. Electrophoresis in practice. Wiley-VCH, Weinheim 2005 Vysokorozlišovací dvourozměrná elektroforéza • 1. krok: IEF na IPG-proužcích • 2. krok: SDS-PAGE Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) • je analytická a preparativní technika • metoda je schopná účinně separovat komplexní směsi bílkovin. • 2-DE je klíčovou technikou proteomiky Poprvé byla popsána již v r. 1975 (O'Farrellem a Klosem), rozšířena byla až s rozvojem proteomiky v posledních letech. Proteomika je obor, který se zabývá globálním hodnocením exprese genetické informace na úrovni bílkovin (proteomem), rovněž však zkoumá strukturu a interakce proteinů. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) Podstatou 2-DE je využití dvou odlišných fyzikálně chemických vlastností proteinů: • v prvním rozměru jsou proteiny rozděleny podle jejich izoelektrického bodu (pl) - pomocí izoelektrické fokusace (IEF) •v druhém rozměru se proteiny dělí v závislosti na jejich molekulové hmotnosti použitím elektroforézy v polyakrylamidovém gelu a SDS (SDS -PAGE). First dimension Second dimension Isoelectric Gel rod rebuffered SDS Polyacrylamide focusing in SDS buffer gel electrophoresis Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) Vizualizace: barvení 2-DE gelů • proteiny jsou vizualizovány některou z barvících či značících metod (chemických nebo radioaktivních). • Výsledné "mapy" proteinů lze porovnávat např. mezi experimentálním a kontrolním vzorkem nebo mezi vzorky odebranými od pacientů s konkrétním onemocněním oproti zdravým kontrolám a identifikovat tak odlišně exprimované proteiny, které mohou mít souvislost s patogenezí daného onemocnění. • Proto je třeba ověřit identitu těchto odlišně exprimovaných proteinů, nejčastěji pomocí "vyříznutí" oblasti gelu vykazující odlišnost a její následné analýzy pomocí hmotnostní spektrometrie. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) IZOELEKTRJCKÁ FOKUSACE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Komerčně dostupné elektroforetické systémy pro použití v klinické laboratorní diagnostice • Firma Sebia (založena 1967, • Firma Helena Laboratories nadřízená organizace: Montagu (založena 1966) Private Equity) . www.helena.com • www.sebia.com Elektroforetický přístroj Hydrasys2 (Sebia) - pro elektroforézu a izoelektrickou fokusaci Phast System™ t (GE Healthcare) Multiphorll t (GE Healthcare) s vysokovoltážním zdrojem, chlazený vodovodní vodou (nevhodné!) Elektroforetický přístroj Multiphor II t (uprostřed) se zdrojem (vpravo) a termostatickým cirkulátorem MultiTemp III (vlevo) Elektroforetický přístroj Flatbed Professional (EDC, uprostřed) se zdrojem (Consort, vlevo) a termostatickým cirkulátorem (Huber, vpravo) Elektroforetický přístroj HPE™ Blue Horizon System (Serva Electrophoresis GmbH; termostatický cirkuláror firmy Huber) - FN Brno Hodnocení elektroforeogramů („elektroferogramů") v gelech a na membránách • Převod signálu na digitální signál - Denzitometry (mobilní fotometry - viz dále; výsledný záznam = diagram s píky - denzitogram; plochy pod píky mohou byt kvantifikovány - např. detekce zón albuminu, al-, a2-, (31-, (32-, y-globulinů při elektroforéze sérových bílkovin - Videokamery (pro viditelné a UV světlo; chlazené CCD kamery mají velmi vysoké rozlišeni; výhoda: možnost akumulace signálu po určitou dobu -detekce slabých signálů) - Stolní scannery (levnější než denzitometry, rychlé, vysoké rozlišení, mohou skenovat v transmitancním i reflektančním módu) - Výsledky jsou zpracovány počítačově s pomocí vhodného softwaru -kvantitativně/kvalitativně Denzitometrie Kvantitativní hodnocení intenzity zbarvení Měření absorpce světla jednotlivými zónami (pásy) Pohyblivý světelný zdroj jlaser nebo lampa s bílým světlem s filtry) je veden nad gelem a na každém miste gelu je měřena a počítačově zpracována absorpce U jednorozměrných gelů získáváme křivku extinkce In L/1 (lQ= intenzita světla ze zdroje, I = intenzita měřená detektorem) podél elektroforetické stopy; u dvourozměrných gelů je extinkce zobrazena jako funkce povrchu gelu Neplatí zde Lambertův-Beerův zákon! (proč?) Závislost absorpce na koncentraci bílkoviny při extinkci >2,5 (lampa s bílým světlem) nebo >4 (laser) se stává hyperbolická nebo sigmoidní Slabé pásy/stopy jsou často nadhodnocené, proteiny ve vysoké koncentraci podhodnocené Denzitometrie Vyhodnocení elektroforeogramů - detekce a kvantifikace • Při denzitometrii se měří intenzita záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický záznam foto metrová néh o úseku. • Jednotlivé frakce dělené směsi tvoří na záznamu v ideálním případě souměrné křivky zvonovitého tvaru. • Plocha po křivkou těchto píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení jednotlivých frakcí v dělené směsi • doporučené jednotky (ČSKB): jedniny (př. al globuliny=0,03) • používají se % (př. al globuliny=3%) • přepočet na g/L z S-CB Vyhodnocení elektroforeogramů - detekce a kvantifikace • Elektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky (400 - 700 nm), v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření - to se projeví při dopadu na detektor. • Po zpracování signálu integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí. Barva Amax [nml Arnidočerň 10B 620 Coornassie Brilant Biu R-250 590 Coornassie Brilant Biu G-250 595 Fast Green 610 Acid violet Alcian Biu 630 Basic Fuschin 550 Methyl Green 635 Ethidiurn Bromide (Fluo rirnetrická detekce) Brorncresol Green Methylene Blue 665 Pyrinin Y 510 Toluidine Biu O 620 Denzitometrické vyhodnocení Normální nález „M" gradient Metody pro kvantifikaci M-komponenty • Odečet z elektroforézy - „Perpendicular drop": ohraničení kolmicemi k ose x v místech, kde M-komponenta „nasedá" na polyklonální pozadí - „Corrected perpendicular drop": ohraničení kolmicemi k ose x, v případě polyklonálního pozadí se pokoušíme toto pozadí kompenzovat zúžením měřené oblasti (velmi subjektivní) - „Tangent skimming": ohraničení M-komponenty zdola úsečkou spojující body, kde M-komponenta „nasedá" na polyklonální pozadí Další možností je odečet z kapilární elektroforézy po imunosubtrakci - zatím nelze používat v rutinní praxi Kvantifikace M-komponenty: 3 používané metody elektroforeogramy z kapilární elektroforézy Keren DF, Schröder L. Clin Chem Lab Med 2016 Albumin Total protein: 7.8 A'<3: 0.81 Fractions % g/dL AA g/dL (6.0-9.3] Ref. g/dL Albumin Ii, 4 L M-Spike 44.9 4.7 13.D 9.5 27.9 ie.a 3.50 0,37 1.01 0.74 2.18 1.47 3.43-4.84 0.21-0.44 0,54-0.97 0.65-1.03 0.70-1.47 Albumin Tote I protein: 7,6 g/dL (6.0-&3) A/G: 0.81 Fractions % g/dL Ref. g/dL Total p rotei n: 7, S g/dL (6.0-8.3) A/G10.B1 Fractions % g/cfL Ref. g/dL Albumin Dt, ár, M-Spike 44.9 4.7 13.0 27.9 14.8 3.50 0.37 1.01 0.74 2.18 1.15 3.43^t.84 0.21-0,44 0.54-0.97 0.65-1,03 0.70-1.47 Albumin Čt M-Spike 44.9 4.7 13.0 9.5 27.9 12.2 3.50 0.37 1.01 0.74 2.1 H 0.95 3.43-4.84 021-0,44 0.54-0,97 0.65-1,03 0.70-1.47 Kvantifikace M-komponenty vlevo: perpendicular drop vpravo: tangent skimming sebia Sample *: \ Depart: Date:7/9/2Q22 ID: S/9/1465 MÉM Serum protein electrophoresis Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 Betas 34,94 1,91 7A3 *A2 2,24 3,66 A/G Ratio :1,7B ID: 6/9/146S Serum protein electrophoresis Fractions 1,0 - 2,6 1,91 Alpha 2 L3..& > 7,2 - 11,6 7,43 Betal 8,1 5,6- S,i 4,42 Beta 2 4,1 2,2 - 5,7 2,24 Signature Signatare 28 Kvantifikace monoklonální komponenty vlevo: ohraničení kolmicemi k ose x (^perpendicular drop"): 4,2 g/L vpravo: ohraničení zdola úsečkou mezi body, kde M-pík nasedá na polyklonální pozadí („tangent skimming"): 1,6 g/L Ohraničení monoklonální komponenty - problém polyklonálního pozadí vlevo: ohraničení kolmicemi k ose x (^perpendicular drop"): 3,7 g/L vpravo: ohraničení zdola úsečkou mezi body, kde M-pík nasedá na polyklonální pozadí („tangent skimming"): 0,6 g/L M-komponenta v p2 frakci vlevo: perpendicular drop (26,1 g/L) vpravo: tangent skimming (21,0 g/L) - pro paraproteiny migrující v (3 frakci se nedoporučuje sebia sebfa Sample #: 7 Date:7/9/2022 ID: 6/9/14E9 Sample #: 7 Date:7/9/Z022 Serum protein electrophoresis Fractions % Ref. % Cone Ref. Cone. Albumin 48,2 < 60,3 - 72,6 44,34 Alpha 1 1,8 1,0 - 2,6 1,66 Alpha 2 7,9 7,2- 11,8 7,27 Beta 1 6,4 5,6 - 9,1 5,89 Beta 2 31,4 > 2,2 ■ 5,7 28,89 Gamma 4,3 < 6,2-15,4 3,96 Serum protein electrophoresis Alpha 1 Alpha 2 Beta 1 A/G Ratio:0,93 Signature Signature Clavijo A et al. Lab Med 2020 Automatizované (Helena SPIFE Touch) vs. manuální vyhodnocení M komponenty Figure 1 Serum protein electrophoresis and densitometric scanning: A, Low-level, broad-based monoclonal immunoglobulin Lab Med, Volume 51, Issue 3, May 2020, Pages 252-258, https://doi.orE/10.1093/labmed/lmz055 The content of this slide may be subject to copyright: please see the slide notes for details. C| OXFORD ? UNIVEBSlTY PHE5S Elektroforetické metody v klinické laboratoři Elektroforéza bílkovin séra a moče (agaróza, CE) - zejména screening monoklonálních gamapati Imunofixační elektroforéza bílkovin séra a moče jagaróza) NEBO imunosubtrakční elektroforéza (CE) - typizace monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů) SDS elektroforéza bílkovin moče - diferenciální diagnostika proteinurií (glomerulární, tubulární, postrenální) Elektroforéza hemoglobinů - detekce abnormních hemoglobinů Elektroforéza izoforem některých enzymů-ALP, LDH, CK Elektroforéza lipoproteinů Izoelektrická fokusace - detekce oligoklonálních pásů (zejm. IgG) v likvoru u chronických zánětlivých onemocnění CNS (zejm. roztroušené sklerózy); fenotypizace alfal-antitrypsinu Elektroforéza nebo izoelektrická fokusace s detekcí izoforem transferinu (průkaz likvoru v sekretech - v likvoru je přítomna kompletně desialovaná frakce, tzv. (32-transferin neboli asialotransferin; CE pro relativní kvantifikaci CDT-disialofrakce, popr. s mono- a asialofrakcí) Elektroforéza bílkovin se provádí s cílem zjistit abnormality bílkovin krevního séra. HP Bílkoviny jsou rozděleny podle svých elektroforetických pohyblivostí do skupin (frakcí), které vytvářejí charakteristický obrazec. (U Změny v tomto obrazci souvisí s různými druhy onemocnění nebo s různými patologickými stavy. Bílkoviny se dělí na 5 - 6 hlavních frakcí: + Albumin 56 - 66 % + al globulíny 2 - 3 % + a2 globulíny 8-12 % + P globulíny (pl, p 2) 7-10 % + y globulíny 10 -18 % Typ: Nosič: Nanášení: Denaturace: Barvení: Odbarvení: Hodnocení: Poznámka: ELFO na papíře chromatografický papír mikroskop, podložní sklo tepelná amidočerň 10B zředěná kyselina octová fotometrický dlouhá doba dělení První typ elektroforézy používaný v klinické praxi Elektroforéza na papírovém nosiči 4-Albumin ■ ^-Atfal globulíny <_Alfa2 globulíny <- Beta globulíny <- Gama globulíny Typ: ELFO na agaru Nosič: agaróza + agaropektin Nanášení: papír, hřeben, fólie Denaturace: kyselina octová Barvení: anionická barviva Odbarvení: kyselina octová Hodnocení: vizuálně Poznámka: elektroendoosmóza Typ: ELFO na agaróze Nosič: agaróza Nanášení: hřeben, fólie Denaturace: kyselina pikrová Barvení: anionická barviva Odbarvení: kyselina octová Hodnocení: vizuálně nebo denzitometricky Poznámka: automatizace HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 oif^'^ Sefaia -1 ^ 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ťTl Agaróza Agaróza je polysacharid z mořských řas. ^ Jde o lineární polymer galaktózy a 3,6 - a n hyd roga laktózy. ^ Rozpouští se v horké vodě a po ochlazení tuhne. Tvoří dvoušroubovice ve svazcích, které se spojují do trojrozměrné struktury. Vodíkové vazby. ^ Vysoké koncentrace agarózy generují gel s malými póry a naopak. 1% gel má póry 150 nm. Agarózový gel má větší póry než PAG - větší molekuly snadněji putují v agaróze. Přítomnost reziduálních nábojů generuje elektroendoosmózu (použít extrémně čistou) Typ: ELFO na acetylcelulóze Nosič: acetylcelulóza (celulóza + acetanhydrid) Nanášení: speciální tiskátko Denaturace: kyselina trichloroctová Barvení: anionická barviva Odbarvení: směs - metanol + kyselina octová Hodnocení: denzitometricky (po zprůhlednění) Poznámka: dovozové fólie Zprůhledňovací směs: Metanol s ledovou kyselinou octovou Cyklohexanol Typ: ELFO na polyakrylamidu H II H2C=C^C- NH2 + O H 1] ^C—C NH 'CH Acrylamide Methylenebisacrylamide persulfate s2ty 2 SO, CONH. CONH CH2—CH—CH2—CH 2 CH- sulfate free radical CH- I CONH CH. CONH —CH2—CH—CH2—CH—CH2—CH- CONH, CONH- Polyakrylamidový gel Tvořen polymerací akrylamidu a N,N'-metylenbisakrylamidu v pufru, zahájenou volnými radikály. Ty vzniknou při rozkladu persíranu amonného nebo při rozložení riboflavinu v přítomnosti 02. Fyzikální vlastnosti gelu a velikost pórů dány podílem polyakrylamidu v gelu a stupněm zesíťování. D Nejčastěji používané koncentrace polyakrylamidu jsou 5-10%. D Koncentrace N,N'-metylenbisakrylamidu je obvykle 5% celkového množství akrylamidu. D Podpůrná matrice je prakticky nenabita. barvičky: Amidočerň 10 B, Coomassie Brilliant Blue, Ponceau S, Bromfenolová modř, Kyselá violeť, barvení stříbrem (není kvantitativní, ale je 50x citlivější než Coomassie: Ag+ ionty se v proteinech vážou na -SH a -COOH skupiny) Coomassie Brilliant Blue R-250 Coomassie Violet R -150 1 2 34 5 6 789 10 11 12 1. prealbumin 8. Transferin 2. albumin 9. Beta-lipoprotein 3. a-lipoprotein, a-fetoprotein 10. C3 4. Al AT, o roso m u ko i d 11. IgAJgM, fibrinogen, „M", VLŘ 5. a1antichymotrypsin/ Gc 12. IgG, CRP, „M" VLŘ globulin 6. A2M,Hp 7. hemoglobin Bílkoviny, které reálně ovlivňují tvar a intenzitu zón elektroforeogramu sérových bílkovin zóna Bílkoviny podílející se na tvaru zóny Referenční meze (pro kity Hydragel ßl-ß2 firmy Sebia) albumin Albumin 60,3 - 72,8 % al-globuliny al-antitrypsin 1,0 - 2,6 % a2-globuliny a2-makroglobulin, haptoglobin 7,2-11,8% ßl-globuliny Transferin (+Hb u hemolyzovaných vzorků) 5,6-9,1% ß2-globuliny C3 (+ IgA) 2,2 - 5,7 % y-globuliny IgG (+ IgM) 6,2-15,4% Elektroforéza bílkovin séra (pozice 2, 5,7,9-11,13-16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30) a moče (pozice 1, 3,4, 6, 8,12, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29) - Hydragel 01-02 15/30 (Sebia) Paraprotein v pozicích 6 (moč), 16 (sérum), 20 (sérum), 22 (sérum), 23 (moč), 24 (sérum), 25 (moč - v beta frakci), 28 (sérum) a 30 (sérum); v sérech na pozicích 20, 22, 28 a 30 je patrná výrazná redukce polyklonálních gamaglobulinů; zvýšená frakce alfa2-globulinů v pozicích 2,10, 24, 30 (séra) K 4 b S ' v 5 10 tl 1» 13 14 IS ■l Elektroforéza bílkovin séra (pozice 1, 3, S, 7, 9,11,13,15,17,19, 21, 23, 25, 26, 28, 30) a moče (pozice 2, 4, 6, 8, 10,12,14,16,18, 20, 22, 24, 27, 29) - Hydragel pl-p2 15/30 (Sebia) Paraproteiny v pozicích 1, 3, 7, 9,11,13,15,19, 23, 26 a 28 v gama zóně, v pozici 21 v beta2 zóně. V pozici 9 je silně hemolytický vzorek s patrným zastřením alfa2-betal interzóny Hb-Hp komplexy, v této interzóně linie imitující paraprotein; výrazné zesílení betal-zóny volným hemoglobinem může rovněž mylně imponovat jako paraprotein Date 1, v séru <1; poměr A/D v sekretu s příměsí likvoru je vyšší než v séru. Elektroforéza hemoglobinu Hydragel 7 Hemoglobin(e), Sebia vzorky 1 a 2: frakce HbA2 > 15%, což značí pravděpodobnou přítomnost HbC nebo HbE vzorky 3-6: normální nález vzorek 7: kontrola 7 HEMOGLOBIN( E) 1 2 3 4 S S sebia Elektroforéza izoenzymů alkalické fosfatasy (Hydragel 15 ISO-PAL, Sebia) v pozicích 2, 4, 6,... je kostní izoenzym vyvázán přítomným lektinem blízko startu v pozicích 3, 4 je patrná střevní frakce (I) v pozicích 11,12 je výrazná druhá jaterní frakce (L2) \£- A iífi 15 iso-pAL sebte 6 7 b 9 10 11 12 13 14 15 I SDS-elfo vzorky smíchány s SDS (sodium dodecyl sulfáte - laurylsíran sodný), který se váže na bílkoviny za tvorby negativně nabitých micel (v poměru 1,4 g SDS na 1 g bílkoviny). Často se používají denaturační podmínky (inkubace vzorků s (3-ME nebo DTT, zahřátí - redukce disulfidových vazeb). SDS (0,1%) je i v gelu (zprav, polyakrylamidovém). Mezi log M a relativní pohyblivostí bílkoviny je pak v určitém rozsahu M přibližně lineární vztah. Obr.: Monomery o dimeryfLC, SDS-PAGE v neredukujících podmínkách/AlB, chemiluminiscencím'detekce (2018) IEF/AIB: typizace LŘ v Ig jako pomoc v diagnostice nemoci těžkých řetězců Kušnierová et al. Klín Onkol 2020; 33(4): 280-5 SDS elfo jako pomoc v diagnostice nemoci těžkých řetězců Kušnierová et al. Klin Onkol 2020; 33(4): 280-5 m Sir F SI S2 S3 S4 MfK MfL Sir F SI S2 S3 S4 MfK MfL F Sir F SI S2 S3 S4 MfK MfL Detekce multimerů vWF (SDS elfo v agarose, Sebia) • Multimery vWF jsou sníženy nebo chybí u některých případů von Willebrandovy nemoci (typ ii) • Na obr. vlevo nálezy bez hrubé patologie; vysokomolekulárni formy v gelu dole (migrují nejpomaleji) Co+ Co- Cl SI C2 S2 C3 S3 C4 S4 C5 S5 C6 S6 C7 S7 C8 S8 I Co+ Co- Cl SI C2 S2 C3 S3 C4 S4 C5 S5 C6 S6 C7 S7 C8 S8 IEF a detekce o-lgG: Metody Zeman D et aI. Ces Slov Neurol N 2019;82/115(l):68-75 • Agarosový gel, imunofixace v gelu (Hydrasys, Sebia) - AGA IEF/IF • Polyakrylamidový gel (Flatbed Professional, EDC), imunoblotting -PAG IEF/IB • Obě metody poskytly prakticky shodné kvalitativní výsledky Oligoklonální pásy • Pokus o definici: pásy (imunoglobulinových molekul, volných lehkých řetězců) produkované několika málo (oligo-) klony B lymfocytů, resp. plazmatických buněk • Detekovány po separaci bílkovin likvoru a paralelně vyšetřeného séra elektroforetickými metodami (preferovaná metoda pro o-lgG: izoelektrická fokusace) • Starší metody s nespecifickou detekcí měly potenciál detekovat oligoklonální pásy IgG, IgA i volných lehkých řetězců (bez možnosti rozlišení), ale také non-lg proteiny v alkalické oblasti (beta trace, gama trace aj.) • Metody se specifickou detekcí používané v běžné klinické praxi detekují pouze IgG (při použití protilátky proti Fc fragmentu IgG), popř. také volné lehké řetězce (při použití protilátky proti celé moleKule nebo Fab fragmentu IgG) • Metody se specifickou detekcí jiných imunoglobulinů/volných lehkých řetězců jsou používány vzácně a spíše výzkumně Klasifikace nálezů o-lgG - 5 typů podle mezinárodních doporučení Andersson M et al. J NeurolNeurosurg Psychiatry 1994;57:897-902 Freedman MS et al. Arch Neurol 2005;62:865-70 Typ 4 Typ 5 CSF S CSF S • Typ 1: jen „polyklonální" IgG v likvoru i séru • Typ 2: >2 IgG pásy v likvoru, jen „polyklonální IgG v séru • Typ 3: IgG pásy shodné v likvoru i seru + IgG pásy přítomné pouze v likvoru • Typ 4: IgG pásy shodné v likvoru i seru • Typ 5: monoklonální IgG v likvoru i seru Oligoklonální IgG - typy IEF nálezu: IEF/IF (Sebia) typ 1 - typ 2 - typ 3 - typ 4 - typ 5 dvojice likvor (vlevo), sérum (vpravo) lEF v polyakrylamidovém gelu (Pannewitz-Makaj K et al, Diagnostics 2021, 11(1): 37) OCB patterns Oligoklonální volné lehké řetězce (o-fLC) Zeman D et al., PLoS ONE 2016;ll(ll):e0166556 fKLC agarose PAG agarose Co+ Co- C1S1C2S2C3S3C4S4 PAG Oligoklonální volné lehké řetězce (fLC): agarózový vs. polyakrylamidový gel Zeman et al. Cesk Slov Neurol N 2019; 81/115(l):68-75 48 vzorků Výtečná shoda mezi separací v agarózovém a polyakrylamidovém (PAG) gelu (kappa > 0,8 pro všechna srovnání) Počet pásů poněkud vyšší v PAG Klinické korelace lepší v PAG (cut-off 6 o-fKLC pásů) Výtečná shoda mezi hodnotícími (kappa > 0,9 pro všechna 4 srovnání) Oligoklonální ficLC (vpravo IgG a ficLC) ÚKBLD VFN a 1. LF UK v Praze, 2002 metoda prof. K. Lamerse (1. Ab: anti-ficLC, 2. Ab/HRP: anti-(f+b)icLC) IEF/AIB FLC v monitorování pacientů s mnohočetným myelomem Pacient s MM (původní paraprotein: FLC lambda) FLC kappa 5.46 mg/L, FLC lambda 59.23 mg/L, FLCr 0.092 IF v séru a moči poskytla zcela konfúzní závěr a to nej důležitější - perzistující monoklonální FLC lambda - přesvědčivě neodhalila S - stopa IgG kappa (2x - 1 z linií odpovídá Isatuximabu); U - stopa FLC kappa IF IEF/AIB FLC (PAG24S) S - monoklonální FLC lambda; U - obtížně interpretovatelný oligoklonální profil FLC obou typů ELP G ■ A M K L ELP G A M K o-lgM u pacientky s RS při diagnostické LP (A), po 18 měsících bezprostředně před AHSCT (B) a po dalších 12 měsících (C) Oligoklonální IgA pH gradient 4-8, anodická aplikace, bez prefokusace pozitivní nález ve vzorku 3 (pacientka s CIS) Kapilární elektroforéza (CE) - princip (obrázek převzatý z https://www.creative-proteomicsxom/pronalys^ • Dělení v křemenných kapilárách • Dvě elektrody • Dva rezervoáry pro pufry • Zdroj vysokého napětí (+/- 30 kV) • On-column detektor V obvyklém uspořádání: Aplikace k anodě, detekce u katody; vlivem elektroosmózy migrují nakonec ke katodě i kladně nabité částice A C G G A CGA A aAaaa A/a a, time capillary "D o migration direction detecto letor j -®- n Ol T O CL source vial destination vial Kapilární elektroforéza Tenké křemenné kapiláry (vnitřní průměr 25 - 75 |im, délka 20 - 100 cm), na jejich povrchu jsou záporně nabité silanolové skupiny - způsobí elektroosmotický tok kladně nabitých iontů pufru ke katodě-všechny složky vzorku nakonec dorazí ke katodě, kde jsou detekovány Detekce nejčastěji UV/VIS (200 nm - peptidová vazba; 280 nm -aromatické zbytky) Capillary Anode- Source Vial Sample Vial High Voltage I'ower Supply Integrator or Computer Detector Buffer 1 1—1 Buffer Deitination Vial Cathode OKB FN Brno: Přístroj Capillarys 2 Flex-piercing využití: 1) stanovení HbAlc, 2) stanovení CDT (%) Přístroje pro kapilární elektroforézu firmy Sebia Volume of tests Low Medium High Configuration standalone Standalone Standalone Workcell On Track Instrument MINICAP FLEX-PIERCING CAPILLARYS 3 CAPILLARYS 3 CAPILLARYS 3 CAPILLARYS 3 OCTA TERA TERA MC 1, 2 or 3 TERA TLA Number of capillaries 8 12 12 to 36 12 Available menu HbAlc, Hemoglobin, CDT, Serum Protein, Urine Protein, Serum Immunotyping, Urine Immunotyping HbAlc, Serum Protein, Serum Immunotyping Odkazy na internetové stránky dvou hlavních výrobců • Sebia: https://www.sebia.com/solutions/instruments/ • Helena: https://www.helena-biosciences.com/en/clinical-electrophoresis/ Kapilární elektroforéza (CE) - metody metoda zkratka Dělení podle Aplikace Kapilární zónová elektroforéza CZE velikosti/náboje (mobility) Malé ionty, peptidy, proteiny Izotachoforéza ITP velikosti/náboje (mobility) Malé ionty, proteiny Kapilární afinitní elektroforéza ACE velikosti/náboje (mobility) Interakce ligandů Bezvodá kapilární elektroforéza NACE velikosti/náboje (mobility) Malé ionty s malou rozpustností ve vodě Micelární elektrokinetická chromatografie MEKC/MECC hydrofobicity/náboje Neutrální částice Kapilární gelová elektroforéza CGWE velikosti Proteiny, DNA Kapilární elektrochromatografie CEC chromatografická retardace Malé ionty a neutrální částice Izoelektrická fokusace CIEF náboje (izoelektrický bod) Proteiny Kapilární elektroforéza (CE) - detektory • Absorpční - UV-detektor - detektor diodového pole • Fluorescenční - excitace lampou - excitace indukovaná laserem • Hmotnostní spektrometr • Elektrochemický • Radioizotopový • Vodivost ní • Indexu lomu • Nukleární magnetická rezonanční spektrometrie Monitorování paraproteinů metodou hmotnostní spektrometrie v rutinní praxi - blížící se realita EXENT® solution - Thermo Fisher Scientific IVDR certifikovaný, plně automatizovaný systém pro měření, kvantifikaci a sledování endogenních M proteinů a terapeutických monoklonálních protilátek v séru Zahrnuje 3 integrované moduly: EXENT-iP 500 pro přípravu vzorků EXENT-iX 500 (MALDI-ToF MS) EXENT-iQ software Ve spojení s analyzátorem Optilite poskytuje přesnou kvantifikaci M proteinu Vítejte v EXENTové době - možná uvidíte i slony létat Literatura R. Westermeier: Electrophoresis in Practice. 4. přepracované a rozšířené vydání. Wiley-WCH, Weinheim, 2005. ISBN 3-527-31181-5 R. Westermeier, A. Görg: Elektrophoretische Verfahren. In: Lottspeich F, Engels JW (Eds.) Bioanalytik. 3. vydání. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 2012. Str. 269-302. P. Schmitt-Kopiin, C. Schwer: Kapillarelektrophorese. In: Lottspeich F, Engels JW (Eds.) Bioanalytik. 3. vydání. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg 2012. Str. 303-333. ISBN 978-3-8274-2942-1. Keren DF, Schröder L. Challenges in measuring M proteins in serum. Clin Chem Lab Med 2016, 54: 947-961 Engliš M. Interpretace elektroforézy plazmatických bílkovin vagarózovém gelu. Praha, Avicenum 1992. Tichý M. Laboratorní analýza monoklonálních imunoglobulinů (paraproteinů). FINIDR, Český Těšín 1997. Maisnar V, Tichý M. a kol. Monoklonální imunoglobuliny - výskyt, význam a možnosti jejich průkazu. Nucleus HK2012. Stern P. Základy instrumentální analýzy v klinické biochemii. Dostupné na: http://wwwl.lfl.cuni.cz/~kocna/biochem/textll.htm Přednášky Mgr. Jany Gottwaldové (t.č. v laboratoři Masarykova onkologického ústavu) - s poděkováním za laskavé svolení Internetové stránky výrobců • Firmy Sebia a Helena s dominantním podílem na trhu v oblasti rutinních klinických aplikací elektroforézy - viz výše • Serva Electrophoresis GmbH: https://www.serva.de/ • Cytiva Life Sciences: https://www.cytiyalifesciences.com/en/us/shop/protein-analysis/electrophoresis-and-isoelectric-tocusing • Bio-Rad: https://www.bio-rad.com/en-cz/category/electrophoresis-blotting?ID=1616a788-c555-4b35-a33d-2735Q71eM65 • Thermo Fisher Scientific: https://ww\A/.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/protein-biology/přotein-gel-electrophoresis.html • Electrophoresis Development & Consulting (Dr. Hanspeter Schickle, Wolfgang Gstrein): https://www.electrophoresis-development-consulting.de/inaex.html Reflexní fotometrie • měří záření odražené od homogenně zbarvené podložky • Matrice: impregnovaná vlákna nebo vícevrstvý (želatínový) film (homogenní matrice) • Zdroj světla: žárovka s halogenovou atmosférou, Xe výbojka s interferenčním filtrem nebo LED (světlo emitující diody) • Detektor: fotonásobič (citlivější) nebo fotonka, na níž je veškeré odražené světlo z reagenčního políčka fokusováno bílým kulovým reflektorem (vyduté zrcadlo - Ulbrichtova koule) • Vzorek: plná krev, sérum, plazma, moč • Suchá činidla aktivovaná vodou obsaženou ve vzorku • Použití zejména v glukometrech - suchá chemie • močová analýza • denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatogramů Reflexní fotometrie - testovací proužky („su chemie") https://www.dastacr.cz/dasta/hvpertext/JVABM.htm Průhledná Fólie Rtetänf zóna i Realďni lina 2 hranrbä sitka Sfi-paracfii vrstva .Vrsí^a pcrnocnycri miiide Transportní vritva Magneticky iccí Schéma konstrukce proužku pro Reffotron 71 Vertikální fotometrie - uspořádání absorpční fotometrie, při které paprsek prochází kyvetou vertikálně • Použití pro měření v mikrotitračních destičkách • Světlovody (skleněná vlákna) vedou světlo do více (zprav, osmi) jamek současně a další světlovody odvádějí prošlé světlo k detektoru • Při konstantní ploše kruhové základny je pro stejnou koncentraci konstantní součin absorbance a délky optické dráhy roztokem: A1-l1=A2-12 • Při krátké optické dráze (cca 3 mm) tak lze docílit solidních výsledků i navzdory malým nepřesnostem v pipetování multikanálovou pipetou Pojmy absorbance (A) a optická denzita (OD) • Absorbance (A) • A = log (1/T) • Zeslabení paprsku po průchodu reakčním prostředím způsobené absorpcí = pohlcením fotonu spojeným s excitací molekuly do vyššího energetického stavu • Ve zředěných roztocích platí pro A Lambertův Beerův zákon: A = s*c*l, tj. lze předpokládat lineární závislost A na koncentraci stanovovaného analytu • Optická denzita (OD) • OD = log (1/T) • Zeslabení paprsku po průchodu reakčním prostředím způsobené absorpcí, rozptylem světla aj. • OD je pojem nadřazený pojmu A • Pro OD obecně neplatí Lambertův-Beerův zákon, tj. nelze obecně předpokládat lineární závislost OD na koncentraci stanovovaného analytu =^> často třeba vícebodová kalibrace Kvantitativní ELISA-příklad: MRZ reakce detekce specifických IgG protilátek proti virům spalniček (measles), zarděnek (rubella) a varicella zoster v likvoru a séru k průkazu jejich intrathekální syntézy MRZ reakce - kalibrační křivka \M-14\5.14.DAT Printed on 5/14/2014 at 12:13:50 PM Plate ID: M-14.5.14 ______Measl_es_ OD Versus Concentration 1 000 3 162 10 000 31 623 100 000 316.228 1000000 3162.278 Concentration (arb.j.) ELISA - instrumentace Automatizace: ELISA analyzátor DSX (Dynex) DĚKUJI ZA POZORNOST.