OPTICKÉ METODY Mgr. Alice Hoffmannová, Ph.D. OBSAH 1. Elektromagnetické záření 2. Optické metody - princip, rozdělení 3. Základní veličiny a vztahy používané ve spektrofotometrii – transmitance, absorbance, LambertBeerův zákon, kalibrační závislost 4. Absorpce, emise záření 5. Spektrofotometry (uspořádání) - zdroj, monochromátor, optické prostředí, detektor 6. Vertikální fotometrie 7. Turbidimetrie, nefelometrie ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ • složku magnetickou a elektrickou • vzdálenost mezi dvěma vrcholy vln se nazývá vlnová délka - λ, udává se v nm • vlnový i částicový charakter - foton VELIČINY POPISUJÍCÍ ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ • rychlost – c (m/s), ve vakuu 3x108 m/s • vlnová délka -  (nm) • Frekvence světelných vln, kmitočet (=počet vln za sekundu)  (Hz,s-1)   c = Rovnice č. 1 VELIČINY POPISUJÍCÍ ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ • energie fotonu světelného záření ε • Energie fotonu je přímo úměrná jeho kmitočtu, h je Planckova konstanta (6,625x10-34 J/s) • Světlo v UV a VIS oblasti má kmitočet (počet vln za s) 1014 - 1015 Hz • Vlnočet- počet vln připadající na délkovou jednotku (obvykle 1 cm)   c hh == Rovnice č. 2 DRUHY SVĚTLA ➢ polychromatické – skládá se z mnoha vlnových délek (sluneční světlo, světlo wolframové žárovky) ➢ monochromatické - světlo, které se skládá pouze z jedné vlnové délky (lépe velmi blízké vlnové délky); lze je získat z polychromatického světla pomocí různých monochromátorů (např. filtrů, hranolů nebo mřížek). DRUHY SVĚTLA ➢ polarizované světlo – je záření, jehož kmity jsou pouze v jedné rovině kolmé na směr šíření záření. Lze je získat různými způsoby (lomem, odrazem, dvojlomem). Nejčastěji používáme tzv. Nikolův hranol, který je z islandského vápence. NIKOL BAREVNOST LÁTEK • pokud absorbované záření má λ ležící v oblasti viditelné části spektra, látka se jeví lidskému oku jako barevná • barvu látky určují vlnové délky odraženého záření jsou to vždy barvy (vlnové délky) doplňkové k barvě absorbovaného světla • bílá barva – odráží záření všech vlnových délek • černá barva – absorbuje všechny vlnové délky • Doplňkové ( komplementární ) barvy – dvojice barev, které se vzájemně doplňují (tj. jejich spojením vznikne bílá barva) BAREVNOST LÁTEK OPTICKÉ ANALYTICKÉ METODY ➢ fyzikální metody, které získávají potřebné informace z měření optických vlastností a spekter zkoumaných látek. ➢ využívají interakce analytu se světlem výměna energie, změna optických vlastností molekul a atomů měřené soustavy ➢ může jít o změnu barvy či její intenzity, luminiscenci, fluorescenci, změnu optické otáčivosti nebo o změnu rozptylu světla při průchodu vzorkem OPTICKÉ METODY • jsou založeny na výměně energie mezi látkou a zářením A.) Spektrální: výměna energie mezi látkou a zářením • absorpční – sledují absorbci záření vzorkem (UV,VIS, IČ) • emisní – měření záření emitovaného vzorkem • luminiscenční metody: fluorimetrie,fosforescence, chemiluminiscence B.) Nespektrální: změna vlastností záření • turbidimetrie, nefelometrie – rozptyl záření • refraktometrie – otáčení roviny polarizovaného světla ZÁKLADNÍ VELIČINY A VZTAHY POUŽÍVANÉ VE SPEKTROFOTOMETRII Propustnost (transmitance): Množství světla určité vlnové délky, které prošlo vzorkem Kde I0 je intenzita světla vstupujícího do vzorku a I je intenzita světla ze vzorku vystupujícího 0I I T = Rovnice č. 3 ZÁKLADNÍ VELIČINY A VZTAHY POUŽÍVANÉ VE SPEKTROFOTOMETRII • Absorbance: Bezrozměrná veličina, definovaná na základě transmitance, udává jaké množství světla bylo pohlceno vzorkem. T I I A loglog 0 −== Rovnice č. 4 ABSORBANCE X TRANSMITANCE Transmitance nabývá hodnot od 0 do 1 (%). absorbance (A) – bezrozměrná veličinastupnici Udávají o kolik se snížila intenzita původního záření po průchodu zkoumanou látkou ZÁKLADNÍ VELIČINY A VZTAHY POUŽÍVANÉ VE SPEKTROFOTOMETRII Zákon Lambert-Beerův: I = I0 . 10-ε l c Intenzita světelného záření procházející absorbujícím prostředím klesá exponenciálně v závislosti na délce absorbující vrstvy a koncentraci absorbující látky Zákon byl nezávisle empiricky odvozen fyziky Bouguerem (1729), Lambertem (1760) a Beerem (1852). Lambertův-Beerův zákon platí pouze pro absorpci monochromatického záření. LAMBERT-BEERŮV ZÁKON ➢ Absorbance při dané λ je přímo úměrná: o tloušťce absorbující vrstvy l o koncentraci absorbujících částic ve vrstvě c o molárnímu absorpčnímu koeficientu ελ clA  = Rovnice č. 5 ZÁKLADNÍ VELIČINY A VZTAHY POUŽÍVANÉ VE SPEKTROFOTOMETRII molární absorpční koeficient ελ fyzikální konstanta, která udává jak daná látka při určité koncentraci absorbuje monochromatické záření určité vlnové délky ➢ takto lze zjistit koncentraci látek barevných, nebo látek absorbujících světlo v UV oblasti ➢ pokud látka v těchto oblastech neabsorbuje, je třeba ji převést na látku, která absorbuje více ➢ vztah mezi signálem ( absorbancí) a koncentrací určuje kalibrace KALIBRAČNÍ ZÁVISLOST Praktické využití Lambertova-Beerova zákona Provedení: • změříme obvykle 5 standardních roztoků o známé vrůstající koncentraci při určité vlnové délce • všechny roztoky se měří za stejných experimentálních podmínek (spektrometr,kyveta,pipety,doba inkubace..) • blank = slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky KALIBRAČNÍ ZÁVISLOST Sestrojení kalibrační křivky • naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y • hodnoty koncentrace na ose x Pokud je závislost lineární, je možné změřit absorbanci a vypočítat koncentraci neznámého vzorku KALIBRAČNÍ ZÁVISLOST Vzhledem k tomu, že poměr cst/Ast je pro měřenou sérii konstantní používáme ho pro změřenou sérii jako kalibrační faktor, kterým vynásobíme naměřené hodnoty absorbance vzorků o neznáme koncentraci LOD-dolní mez detekce LOL- horní mez detekce LOQ-mez stanovitelnosti LIMITACE LAMBERT-BEEROVA ZÁKONA ➢ Odchylka ελ při vysokých koncentracích (>0,01 mol/l) vlivem elektrostatických interakcí ➢ Částečný rozptyl světla na částicích přítomných ve vzorku ➢ Fluorescence nebo fosforescence vzorku ➢ Nedokonale monochromatické záření ➢ Nekoherentní světelné záření Nejpřesnější výsledky jsou získávány v rozsahu absorbancí 0,2- 2,0 . Od hodnot absorbance >výrazně narůstá chyba měření OPTICKÉ METODY-ROZDĚLENÍ A.) Spektrální: výměna energie mezi látkou a zářením • absorpční – sledují absorpci záření vzorkem (UV,VIS, IČ) • emisní – měření záření emitovaného vzorkem • luminiscenční metody: fluorimetrie, fosforescence, chemiluminiscence B.) Nespektrální: změna vlastností záření • turbidimetrii, nefelometrii – rozptyl záření • refraktometrie – otáčení roviny polarizovaného světla ABSORPCE VS. EMISE ZÁŘENÍ • Emise záření: přechod z vyššího energetického stavu do stavu s nižší energií, provázen vyzářením fotonu, atomová emisní spektrofotometrie • Absorpce záření: atom (resp. molekula) přejde do vyššího energetického stavu, foton je pohlcen, atomová absorpční spektrofotometrie SPEKTROFOTOMETRY • Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra • Slouží pro měření absorpce světla vzorkem • Absorbance je měřena při různých vlnových délkách USPOŘÁDÁNÍ SPEKTROFOTOMETRU 1. Zdroj světla 2. Monochromátor nebo filtr: k výběru určité vlnové délky 3. Optický systém: štěrbiny, zrcadla, čočky 4. Absorpční prostředí: kyveta s měřeným vzorkem 5. Detekční systém: zařízení k měření světelného záření, které prošlo vzorkem 1) ZDROJE ZÁŘENÍ A JEJICH POUŽITÍ • Halogen - wolframová žárovka – měření absorpce ve viditelném spektru • Deuteriová (vodíková) výbojka - měření absorpce v UV spektru • Xenononová výbojka- měření absorpce v oblasti VIS UV spektru • Rtuťová výbojka – měření v oblasti spektra 200-400 nm HALOGEN - WOLFRAMOVÁ ŽÁROVKA – VIS OBLAST SPEKTRA • Skleněná baňka naplněná inertním plynem obsahující páry jódu • Uvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem • Oblast spektra: 330-900 nm DEUTERIOVÁ VÝBOJKA – UV OBLAST SPEKTRA • Nízkotlaké, produkují světlo o vlnové délce 160-375 nm • Wolframová cívka upevněna na tenkostěnnou křemennou výbojku, naplněna deuteriem , elektrický výboj disociuje D2 a následně dochází k emisi záření XENONOVÁ VÝBOJKA – BLÍZKÁ UV OBLAST NEBO IČ OBLAST SPEKTRA • Vysokotlaká (pevnější plášť), výboj vzniká mezi dvěma wolframovými vlákny, vysoký výkon záření • Produkují světlo: 180-2500 nm • Použití ve fluorescenční a luminiscenční spektrofotometrii 2) FOTOMETRICKÉ FILTRY • Slouží k vymezení určitého ( co nejužšího) pásu monochromatického světla ze spojitého záření. • Charakteristikou filtru je tzv. spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v polovině maximální propustnosti filtru (je odvozena z křivky propustnosti). Čím je rozsah pološířky filtru užší, tím je filtr lepší. • Fotometrické filtry dělíme na dvě základní skupiny: barevné absorpční a interferenční 2) FOTOMETRICKÉ FILTRY Spektrální pološířka filtru (h, nm) - odpovídá intervalu vlnových délek záření v polovině maximální propustnosti filtru – transmitance je odvozena z křivky propustnosti. transmitance Křivka propustnosti transmitance 2) FOTOMETRICKÉ FILTRY Barevné absorpční filtry - mají nižší spektrální čistotu filtrovaného záření, jejich pološířka je 30-80 nm • Pevné - skla vyrobená z oxidy kovů, nebo pokrytá vrstvou želatiny s organickým barvivem • Kapalné – obvykle kyvety s roztoky anorganických solí 2) FOTOMETRICKÉ FILTRY - INTERFERENČNÍ FILTRY ➢ Interferenční filtry využívají mnohonásobnou interferenci záření mezi hraničními plochami s výbornými odrazovými vlastnostmi, mají užší šířku pásma a vyšší pík transmitance (lepší propustnost) než barevné absorpční filtry. Nejvíce rozšířený je kovový Fabry-Perotův filtr. a, c – polopropustné vrstvičky b – vrstva dielektrika o tloušťce /2 d, e – krycí vrstvy 2) FOTOMETRICKÉ FILTRY - INTERFERENČNÍ FILTRY Na základní desce je mezi dvěma stříbrnými polopropustnými vrstvičkami vrstva průhledného dielektrika o tloušťce /2, přičemž  odpovídá požadované vlnové délce. Mnohonásobnými odrazy od zrcadlových ploch filtru a po vícenásobné interferenci dopadajících paprsků různé vlnové délky, vznikají velmi úzká maxima s pološířkou 8 – 10 nm. 2) MONOCHROMÁTORY ➢ Optická zařízení pomocí kterých se ze spektra polychromatického světla mechanicky vymezí pouze jeho určitá část. ➢ Slouží pro kontinuální výběr různých vlnových délek. 2) MONOCHROMÁTOR Monochromátor se skládá: • vstupní štěrbiny • pomocné optiky (zrcadla, čočky) • disperzního prvku - mřížka,hranol • výstupní štěrbiny 2+3) MONOCHROMÁTOR - VSTUPNÍ A VÝSTUPNÍ ŠTĚRBINA Vstupní – vymezuje malou část světelného toku ze zdroje záření Výstupní štěrbina – slouží k výběru záření určité vlnové délky, čím je užší tím užší je šířka pásma (bandpass) a větší monochromatičnost záření. Poloha štěrbin je neměnitelná, požadovaná vlnová délka se nastavuje přímým otáčením disperzního prvku. 2+3) MONOCHROMÁTOR - POMOCNÁ OPTIKA ➢ Zrcadla - jsou to plochy odrážející záření, jsou potažena obvykle vrstvou hliníku • Rovinná – nejvíce používaná • Dutá, kulová , parabolická ➢ Čočky – optický zaostřovací systém ➢ Optická vlákna – skleněná, křemenná usměrňují transport světla ve stísněných prostorách (vertikální fotometry k měření mikrotitračních destiček), mají větší světelné ztráty než zrcadla ➢ Clony – používají se k omezení průřezu svazku paprsků, k odstínění okrajové oblasti čoček a zrcadel 2+3) DISPERZNÍ PRVEK - OPTICKÝ HRANOL ➢ rozkládá polychromatické světlo na principu lomu světla ➢ světelné paprsky o kratší vlnové délce (modré světlo) se lámou více než paprsky s delší vlnovou délkou ➢ Skleněný hranol - pro rozklad světla ve VIS oblasti spektra (400-800 nm) ➢ Křemenný hranol – pro UV oblast (do 200 nm) 2+3) DISPERZNÍ PRVEK – DIFRAKČNÍ REFLEXNÍ MŘÍŽKA • pracuje na principu odrazu světla • Je tvořena soustavou jemných rovnoběžných vrypů na skleněné destičce (nejkvalitnější až 1700 /1 mm) • Na vybroušených ploškách mřížky dochází k složitým optickým procesům-odraz, interference světla, které vedou k tomu, že z mřížky vychází jednotlivé vlnové délky pod rozdílným úhlem, který závisí na vlnové délce záření • Rozklad záření je lineární u všech vlnových délek • Má lepší rozlišovací schopnost než hranol 2+3) DISPERZNÍ PRVEK – DIFRAKČNÍ REFLEXNÍ MŘÍŽKA VÝBĚR POŽADOVANÉ VLNOVÉ DÉLKY Přesným pohybem disperzního prvku monochromátoru je vzniklé světelné spektrum nasměrováno na výstupní štěrbinu tak, aby jím prošlo záření požadované vlnové délky ☼ optické zrcadlo zdroj světla difrakční reflexní mřížka mikrometrický šroub kyveta detektor 4) ABSORPČNÍ PROSTŘEDÍ Kyveta s měřeným vzorkem Rozdělení: • dle velikosti: Makro- (1-2 ml), semimikro(<0,5 ml), mikro-(<100 μl) • dle typu: nalévací, průtokové • dle materiálu: skleněné, plastové (akrylátové, polystyrenové), křemenné (UV oblast) • automatických bioch. analyzátorech: • kyvety na jedno použití • trvalé – po změření se promyjí mycí stanicí 4) ABSORPČNÍ PROSTŘEDÍ SPEKTROFOTOMETRU zatavené kyvety z plastické fólie postup miniaturizace kyvet 400 µl 150 µl 80 µl 5) DETEKČNÍ SYSTÉM Je složen z detektoru záření a elektronického zařízení pro zpracování jeho odezvy Detektory Zařízení, které zprostředkovávají přeměnu energie záření na jinou formu – obvykle fotochemickou, elektrickou a) Hradlový selenový fotočlánek b) Fotodioda c) Fotonásobič d) Detektor diodového pole 5a) HRADLOVÝ SELENOVÝ FOTOČLÁNEK • Skládá se z polopropustné vrstvy stříbra nanesené na vrstvě selenu (polovodič) na kovovém podkladě • Světelné záření o vlnové délce λ dopadající na polovodič působí uvolnění elektronů, které přecházejí do vrstvičky stříbra • Tím vzniká elektrický proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření 5b) FOTODIODA (FOTONKA) Pracuje na principu fotoelektrického efektu: • Skládá se z fotosenzitivní katody (obsahuje Ag a různé alkalické kovy a jejich oxidy) a anody umístěné ve vakuu (nebo plynu) ve skleněné baňce • Fotokatoda uvolňuje při ozáření světlem elektrony, které jsou přitahovány anodou čímž vzniká el. proud, který je proporcionální intenzitě světelného záření 5c) FOTONÁSOBIČ •Elektrony z fotokatody jsou postupně přitahovány k sérii dynod, na které je vloženo postupně se zvyšující napětí •Když elektron narazí na dynodu uvolní z ní mnohem více elektronů, které jsou přitahovány k další dynodě •Obsahuje až 10 dynod, z nichž každá následující má až o 50 V vyšší napětí •Toto vnitřní zesílení signálu umožňuje převést i velmi slabé světelné záření na měřitelné hodnoty elektrického proudu 5c) FOTONÁSOBIČ 5d) DETEKTOR S DIODOVÝM POLEM • Je tvořen velkých množstvím miniaturních fotodiod na malé ploše destičky, na kterou dopadá světelné záření po průchodu absorpčním prostředím a následně je rozložené monochromátorem na jednotlivé vlnové délky 5d) DETEKTOR S DIODOVÝM POLEM • Rozdíl oproti klasickému spektrofotometru – monochromátor je umístěn až za kyvetou se vzorkem • Použití : v HPLC (UV/VIS detektor), automatické biochemické analyzátory • Usnadňuje tzv. bichromatické měření absorbance jednopaprkový (A) x dvoupaprskový spektrofotometr (B) KONTROLA KVALITY SPEKTROFOTOMETRU A) Linearita spektrofotometru – schopnost vykazovat lineární odezvu • měření postupně ředěného roztoku o známé koncentraci • Výsledkem je přímkový graf závislosti A (osa y) na c (osa x) • Měření se provádí při λ - 257, 341, a 630 nm KONTROLA KVALITY SPEKTROFOTOMETRU B) Rozptýlené světlo Světlo, které může dopadnout na detektor aniž by prošlo měřeným vzorkem (př. nedokonalé odstínění optického systému spektrofotometru) • Ověřuje se vložením neprůsvitného bloku do nosiče kyvety a sledováním odezvy detektoru C) Drift signálu Schopnost detektoru udržovat konstantní hodnotu • Sledování nulové linie VERTIKÁLNÍ FOTOMETRIE Spektrofotometrická metoda, s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru Využití : proměření absorbance v jamkách mikrotitračních destiček, které se používají hlavně pro imunochemická stanovení na principu ELISA (analýzy s navázaným enzymem za využití imunosorbce) VERTIKÁLNÍ FOTOMETRIE Provádí se ve speciálních nádobkách uspořádaných do tzv. mikrotitračních destiček. Každá destička obsahuje 96 jamek uspořádaných ve 12 řadách po 8 jamkách. Pro měření výsledného produktu detekční reakce se používají speciální vertikální spektrofotometry - ELISA readry mikrotitračních destiček: je uspořádán tak, že světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru. VERTIKÁLNÍ FOTOMETRIE Princip: světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr (podle požadované vlnové délky) do optických kabelů, •které zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů: 8 z nich vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu světla. •Devátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházejícího ze zdroje. • Ve zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), mikrotitrační destička se posune a může se měřit řada následující. VERTIKÁLNÍ FOTOMETRIE Součásti vertikálního fotometru: • zdroj záření: nejčastěji používá halogenová žárovka nebo xenonová výbojka. • Interferenční filtry: jsou umístěny v posuvném držáku filtrů,obvykle se používá 6 filtrů (pro λ 400-800 nm). • Optický systém: se skládá 9 optických kabelů (světlovodiče), štěrbin a zrcadel pro vedení světelného paprsku ze zdroje do optického prostředí (jamka mikrotitrační destičky). • Detektor: používají se fotodiody. Rychlost měření je 5s (celá mikrotitrační destička - 96 jamek). VERTIKÁLNÍ FOTOMETRIE • Vztah mezi změřeným signálem (absorpcí) a koncentrací se určuje kalibrací. Obvykle se změří absorbance 6-ti standardních roztoků o známé vzrůstající koncentraci a blank ( slepý pokus, obsahuje vše kromě stanovované látky) při určité vlnové délce. VERTIKÁLNÍ FOTOMETRIE • Při ELISA metodě se vyžaduje měření všech vzorků v duplikátech. • Poté software přístroje sestrojí kalibrační křivku (naměřené hodnoty absorbance standardů na ose y,hodnoty koncentrace na ose x), ze které odečte hodnoty koncentrací neznámých vzorků • Při vertikální fotometrii závisí dosažené výsledky měření pouze na přesnosti pipetování kalibrátorů, kontrolních materiálů a vzorků. TURBIDIMETRIE, NEFELOMETRIE TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE Patří mezi běžné analytické optické metody • v klinické biochemii se používají k stanovení velké skupiny bílkovin – tzv. „specifických proteinů“ • využívají rozptylu světla na heterogenních částicích v koloidních roztocích a mikrosuspenzích TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE Princip Tyndallův jev: „Rozptýlené záření na částicích má stejnou vlnovou délku jako záření dopadající na koloidní částice“. Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry. John Tyndall, fyzik, 19 st. TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE Tyndallův jev - dokonalý difúzní rozptyl • platí pro částice které mají velikost menší než 1/10 (př. IgG- 20nm) vlnové délky dopadajícího záření • U částice o velikosti větší 1/10 – 1 (400-1400nm) násobek vlnové délky dopadajícího světelného záření je maximum rozptýleného světla směřováno dopředu a málo dozadu vzhledem k dopadajícímu záření – eliptický rozptyl TURBIDIMETRIE • Princip je založen na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích při průchodu světelného záření prostředím s velkými molekulami (bílkoviny) • sleduje pokles intenzity záření procházející rozptylující vrstvou • Na částicích dochází k rozptylu záření a částečně i jeho absorpci • Závislost turbidance na koncentraci analytu je nelineární TURBIDIMETRIE • K turbidimetrickému měření zákalu se využívají absorpční fotometry a spektrofotometry - jednoúčelové turbidimetry se dnes v klinické biochemii nevyužívají • měření se provádí v přímém směru, v ose světelného paprsku TURBIDIMETRIE • měření stupně zákalu - turbidity • využívají se precipitační reakce mezi antigenem a protilátkou • ochranné koloidy - nejčastěji polyetylenglykol, nutno získat dostatečně stálou suspenzi měřené reakční směsi TURBIDIMETRIE • Na biochemických analyzátorech dosahují turbidimetrické metody reprodukovatelnost asi 5% • Je třeba snížit vliv interferujících látek na minimum – jakýkoliv vliv, který způsobí vznik částic odlišné velikosti (koncentrace činidel, teplota) • Hemolýza a ikterus ruší méně než při nefelometrii NEFELOMETRIE • zabývá se měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na částicích • Pro tyto účely slouží buď nefelometrický nástavec k fotometru, u nichž se difúzně rozptýlené světlo sleduje pod úhlem 90°, nebo jsou vyvinuty speciální přístroje - nefelometry NEFELOMETRIE Rozdělení dle použitého zdroje záření: 1. Laserový nefelometr 2. Konvenční nefelometry 1) LASEROVÝ NEFELOMETR Helium neonový nebo argonový laser • Tento zdroj monochromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti paprsku • Rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úhlem 5 až 90° (fotonkou nebo fotonásobičem) 1) LASEROVÝ NEFELOMETR LASER = Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation = zesilování světla pomocí stimulované (vynucené) emise záření Hlavní součásti laseru : a) zdroj excitační energie b) aktivní prostředí c) rezonátor LASER Hlavní součásti laseru : a) zdroj excitační energie (2) – budící zdroj působící elektrický výboj b) aktivní prostředí (1) -tj. látka obsahující oddělené kvantové energetické hladiny elektronů – může se jednat o plyn (nebo směs plynů), krystaly, polovodiče c) rezonátor – tvořen dvěmi zrcadly (3,4): 1. Koncové s odrazivostí 100% 2. Výstupní s odrazivostí 99%, tzn. částečně propustné, umožňující vyzařování světelného paprsku 2) KONVENČNÍ NEFELOMETRY Konvenční nefelometry • používají jako světelný zdroj žárovku nebo xenonovou výbojku • Monochromátor - interferenční filtr. • Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90o 2) XENONOVÁ OBLOUKOVÁ LAMPA • Poskytuje intenzivní světelné záření pomocí elektrického oblouku • Skládá se z oválné baňky vyrobené z křemenného skla ve které jsou proti sobě umístěné katoda a anoda v atmosféře xenonu • Teplota elektrického obloku se pohybuje okolo 6000 ºC • Produkuje vysoce energetické, spojité záření v UV oblasti NEFELOMETRIE Rozdělení podle typu měření: 1. Systém měření v end point režimu– po smíchání antigenu a protilátky proběhne měření po dosažení rovnovážného stavu možnost falešně negativní koncentrace antigenu. Proto je nutné nastavení systému tak, aby měření probíhala v oblasti lineární části křivky Měření v tomto režimu je o řád citlivější než turbidimetrie (0,1 mgl) NEFELOMETRIE Rozdělení podle typu měření: 2. Systém měření v kinetickém režimu - reakce je rychlejší, měří se přírůstek vzniku precipitátu v pravidelných časových intervalech, po dosažení rovnovážného stavu (desítky vteřin) se měření ukončuje PRŮBĚH IMUNOPRECIPITAČNÍ REAKCE Heidelbergova-Kendalova křivka LIMITUJÍCÍ FAKTORY IMUNOCHEMICKÝCH STANOVENÍ • Limitující faktor: precipitát se tvoří pouze při optimálním množství antigenu a protilátky, při nadbytku některé ze složek se precipitát začne rozpouštět. • tzn. JEDNA HODNOTA KONCENTRACE PRECIPITÁTU TAK ODPOVÍDÁ DVĚMA KONCENTRACÍM ANTIGENU – možnost vydání falešně negativního výsledku IMUNOPRECIPITAČNÍ KŘIVKA PODLE HEIDELBERGA A KENDALLA koncentrace signál DETEKCE NADBYTKU ANTIGENU Několik způsobů: • Kontrola přídavkem naředěného antigenu po proběhnuté imunoprecipitační reakci – následuje automatické opakování analýzy s vyšším ředěním. • Přídavek malého množství vzorku k činidlu před vlastní reakcí – je-li po krátké inkubaci překročen koncentrační práh zjištěný při kalibraci, vzorek se měří automaticky znovu při vyšším ředění • Na začátku reakce vyhodnocena rychlost nárůstu signálu – při překročení nastavených parametrů je výsledek označen chybovým hlášením DETEKCE NADBYTKU ANTIGENU 1. V případě zachování nadbytku Ab dojde další tvorbě imunokomplexů a nárůstu intenzity rozptýleného světla 2. Pokud byla protilátka již spotřebována, nevede přidání dalšího antigenu k tvorbě imunokomplexů a na detektoru nezjistíme žádnou odezvu – reakce se automaticky opakuje při vyšším ředění IMUNOCHEMICKÝ SYSTÉM - IMMAGE 800 • Analyzátor výrobce Beckman Coulter • využívá turbidimetrického a nefelometrického principu • Pracuje v kinetickém režimu - měří zvýšení intenzity světla rozptýleného částicemi v kyvetě v čase IMMAGE 800 - REAGENČNÍ ČÁST • Reagenční karusel pro 24 reag. kazet • Teplota 15°C • 4 lahvičky s pufry bez chlazení • Reag. kazety značené čárovým kódem • Otevřený systém • Softwarová kapacita - 50 metod • Kalibrační data - kal. křivka výrobce má 8 -12 bodů, provádí se pouze jednobodové ověření VZORKOVÁ ČÁST • Vzorky ve zkumavkách s čár. kódem • Vzorkový karusel pro 8 stojánků po 9 vzorcích ředící roztoky pro vzorky ředící segmenty pro ředění vzorků • Kapacita: 180 testů za hodinu, v sérii lze provést 12 metod REAKČNÍ ČÁST • Reakční karusel – 39 reak. plastových kyvet, 1 referenční – známá hodnoty rozptylu, nastavení optického systému • Teplota 37°C • Optika – zdroje záření, detektory TURBIDIMETRIE • měření stupně zákalu (turbidity) – v důsledku imunoprecipitační reakce • Měří se snížení intenzity světla při průchodu roztokem částic v kyvetě v důsledku rozptylu světla • Immage pracuje v kinetickém režimu – hodnotí rychlost nárůstu zákalu v čase • NIPIA= imunoanalýza na částicích v blízké infračervené oblasti TURBIDIMETRIE • Zdroj pro NIPIA: světlo emitující dioda – poskytuje monochromatické záření λ = 940 nm • Detekce záření: v přímém směru, v ose světelného paprsku zdroje v blízké IR oblasti (940 nm) • Vyžití: stanovení FLC (volných lehkých řetězců) NEFELOMETRIE • Zdroj: helium-neonový laser – dává monochromatické záření o λ = 670 nm • Detekce: detektor je umístěn v úhlu 90° ke směru laserového paprsku • Využití: stanovení specifických proteinů v séru, v likvoru a moči ŘEŠENÍ PROBLÉMU S IMUNOPRECIPITAČNÍ KŘIVKOU • Nutno provést taková opatření, aby nedošlo k omylu při odečítání vyšších koncentrací antigenu • IMMAGE : detekce nadbytku antigenu pomocí přídavku dalšího antigenu po ukončení reakce Jestliže nenavázaná protilátka … Přídavek dalšího antigenu bude mít za následek… Systém IMMAGE… Je přítomna Zvýšení poměrové odezvy Použije k výpočtu výsledku původní poměrovou odezvu Není přítomna Žádné zvýšení poměrové odezvy Vzorek automaticky zopakuje s vyšším ředěním s testem na přebytek antigenu dokud nezíská správný výsledek AUTOMATIZOVANÝ NEFELOMETR BN PRO SPEC • Výrobce: Siemens Healthineers • Max. provozní rychlost 180 analýz za hod. • Pracuje v režimu po vzorcích • K dispozici je více než 60 metod • Zdroj světla: LED dioda (840 nm) • Detektor – křemíková fotodioda je umístěn pod úhlem 13- 24 º AUTOMATIZOVANÝ NEFELOMETR BN PRO SPEC • Reagenční disk je temperován na 8ºC,v analyzátoru lze umístit 35 činidel • Reakční disk: 60 polystyrénových kyvet pro opakované použití • Měření probíhá při 37 ºC • Délka inkubace je 6-12 min. • Vzorková část: lze umístit až 100 vzorků, umožňuje používat primární, sekundární zkumavky a kepy ANALYZÁTOR ATELLICA NEPH 630 SYSTEM • Výrobce: Siemens Healthineers • Více než 70 metod • Rychlost analýzy 65 testů za hodinu • Reagenční disk má kapacitu 90 kyvet • Detektor umístěn pod úhlem 13 -24° NEFELOMETR ARRAY 360 • Výrobce: Beckman Coulter • Měření v kinetickém režimu • Rychlost 40-80 analýz za hod. • Zdroj světla: halogenová žárovka (400-620 nm) • Detektor: křemíková fotonka • K dispozici asi 60 metod • Nevýhoda: pracovní teplota pouze 26,7 ºC, velký mrtvý objem, stabilita kalibrace pouze 14 dní NEFELOMETR - DELTA • Výrobce firma Radim • Zdroj světla laser (670 nm) • K dispozici 100 metod • Rychlost 150 analýz za hod. (startovací čas 30 min., ukončovací čas 15 min. !) • Reagenční část: 54 pozic pro reagencie, chlazená • Reakční část:120 omyvatelných kyvet, temperovaných na 37 ºC • Vzorková část: pro 80 vzorků TURBOX PLUS • Jednoduchý manuální nefelometr • Výrobce: ORION Diagnostica • Lze měřit až 100 vzorků za hodinu • Zdroj světla je LED dioda (635 nm) • Detektor: 2 fotodiody • Tovární kalibrace je na magnetické kartě DĚKUJI ZA POZORNOST