Moderní metody analýzy genomu a význam pro hematologii CZ_zakladni logo_CELL_verze_02 Ing. Zuzana Vrzalová, Ph.D. •Přerov •1994 - 1997 Gymnázium •1997 - 2002 VŠCHT Praha - magisterské studium - biochemie a technologie v chemii a potravinářství •2003 - 2004 Univerzita Hohenheim – Stuttgart – stipendijní program •2005 - 2013 FN Brno – CMBG – Sekce metabolických nemocí •2010 - 2017 MU Genomika a proteomika – Ph.D. •2017 – dosud Centrum molekulární medicíny - CEITEC MU (Prof. Pospíšilová) • Centrum molekulární biologie a genetiky – IHOK FN Brno • (Prof. Pospíšilová, Prof. Doubek) • • • • • • • • • • •Centrum molekulární biologie a genetiky – IHOK FN Brno, • Centrum molekulární medicíny - CEITEC MU • Adobe Systems Genom ̶Veškerá genetická informace uložená v DNA konkrétního organismu ̶Jaderná DNA ̶Mitochondriální DNA ̶Plastidová DNA (pouze u ✿❀❁) • Související obrázek Výsledek obrázku pro nucleus electron micrograph Výsledek obrázku pro chloroplast electron micrograph Adobe Systems Velikost genomu Výsledek obrázku pro mycoplasma genitalium Výsledek obrázku pro amoeba polychaos dubium Výsledek obrázku pro base pair Související obrázek Adobe Systems Lidský genom ̶Jaderný genom 46 chromozomů: ̶22 párů chromozomů + pohlavní chromozomy XX (žena) nebo XY (muž) Image result for 23 chromosomes" kapradina Hadilka (Ophioglossum) - až 1260 chromozomů Ophioglossum closeup.jpg Drosophila melanogaster - side (aka).jpg octomilka (Drosophila melanogaster) 8 chromozomů Image result for arabidopsis thaliana" huseníček rolní (Arabidopsis thaliana) 10 chromozomů intron exon protein DNA řetězec Gen genom všechny exony = exom < 2 % celého genomu Lidský genom •genom = 3.2 * 109 bp •~ 20 000 genů •~ nekódující části, sekvence • •exom = souhrn exonů • ~ 1,5 % genomu • •proteom = souhrn proteinů •~ 10 000 proteinů • • proteom •lidský genom •= 3.2 * 109 bp •~ 20 000 genů • • •Počty genů – komplexita organismu •Exom = < 2 % lidského genomu •obsahuje ~ 85 % známých mutací podmiňujících onemocnění Lidský genom Adobe Systems Geneticky podmíněná onemocnění u člověka •Monogenní choroby •Chromozomové aberace •Genetické poruchy somatických buněk (nádory) •Choroby s nemendelistickým způsobem dědičnosti (např. nestabilní opakování trinukleotidů) •Polygenní choroby •Multifaktoriální choroby (geny + prostředí) • Adobe Systems Sekvenování – využití v diagnostice ØZejména 1. generace (Sangerovo sekvenování) •Zlatý standard •Sekvenování genů (resp. jejich částí) • Ø2. (nová) generace čím dál více rozšiřuje své uplatnění •Sekvenování velkého množství genů •Sekvenování jednoho genu více pacientů •Sekvenování exomu (DNA, která kóduje proteiny) •Sekvenování genomu (veškerá DNA v buňkách) ̶ Výsledek obrázku pro sanger sequencing Výsledek obrázku pro illumina nextseq Celý genom Konkrétní geny nebo tzv. „hot spots“ Exom 3 200 000 000 bp 30-50 x pokrytí 18 000 - 20 000 genů 100 x pokrytí < 100 genů > 1000 x pokrytí 2. generace NGS – flexibilita Sekvenační metody analýzy DNA odhalení příčiny nejrůznějších nemocí 1.Sangerovo sekvenování 2. Panelové sekvenování – target NGS 3. Celoexomové sekvenování 1. 4. Celogenomové sekvenování 1. 1. 1.Sangerovo sekvenování - klasické sekvenování Výsledek obrázku pro sanger sequencing -sekvenace nukleových kyselin, proteinů -1977 – biochemik Frederick Sanger -1980 – udělena Nobelova cena za chemii Ø slouží k detekci SNV a krátkých delecí a inzercí 1.Polymerázová řetězová reakce (PCR) 2. 2.Elektroforéza Výsledek obrázku pro sanger sequencing 3. Značící reakce 4. Sangerovo sekvenování 1.Sangerovo sekvenování - klasické sekvenování Nemocný člen rodiny s heterozygotní substitucí Zdravý člen rodiny Výsledek obrázku pro sanger sequencing Ověření pomocí Sangerova sekvenování v •pochopení struktury a fce NK a proteinů • •postupně nahrazeno přístupy NGS • •detekční metoda u geneticky podmíněných onemocnění: „krátké“ geny (talasémie), hot spot (specifické, cílové) oblasti •ověření každé pravděpodobné kauzální varianty z NGS • •detekce kauzální varianty u dalších příbuzných • Ø slouží k detekci SNV a krátkých delecí a inzercí Výsledek obrázku pro sanger sequencing 15 Kam směřuje Sangerovo sekvenování Sangerovo sekvenování významně posunulo možnosti v molekulární biologii a napomohlo k pochopení struktury a funkce nejen nukleových kyselin ale i proteinů. Nicméně v poslední době se stále více využívá přístupu sekvenování nové generace – NGS, které svou vyšší kapacitou překonávají omezení dané Sangerovém sekvenováním. Ale je důležité zdůraznit, že sekvenování podle Sangera se stále rutinně využívá jako detekční metoda u geneticky podmíněných onemocnění např. kdy se vyšetřují krátké geny (jako je u talasémie anebo charakteristické mutace v některých genech a dále pro ověření každé pravd. Kauzální varianty získané z NGS a pro detekci kauzální varianty u dalších příbuzných. Sanger slouží k detekci SNV a krátkých delecí a inzercí, proto vám zde představím doplňující a velmi používanou metodu, která je schopna detekovat ztráty a zisky v genech, na chromozomech. MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) •izolovaná DNA • •detekce CNV (variant v počtu kopií): parciální i rozsáhlé delece a duplikace •firma: MRC Holland, přes 300 komerčních kitů •multiplex PCR esej •kvantifikace – kapilární elektroforéza •online dostupný software Coffalyser •onemocnění: talasémie, hereditární hemoragická teleangelektázie 16 Zare et al., 2017 do plastid u rostlin do plastid u rostlin Adobe Systems Cytogenetika ̶Klasická cytogenetika – karyotypování ̶FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) ̶Čipy (array CGH) ̶ ̶ Image result for klasická cytogenetika" Image result for array cgh" Kazuistika rodiny • -dlouhodobá neplodnost -záchyt hemoglobinopatie u rodičů v roce 2016 u rodiče probandky Øgenetická analýza alfa a beta- talasémie Talasémie •geneticky podmíněná onemocnění vznikající poruchou syntézy globinových řetězců •narušení poměru alfa a beta řetězců v molekule Hb •postihuje 7 % celosvětové populace •Hemoglobinopatie •výskyt ve Středozemí a malarických oblastech • - selekční výhoda přenašečů před malárií •migrace do Evropy • • Charakteristika onemocnění talasémie •Dle typu postiženého řetězce: • - a-talasémie: minima, minor, choroba hemoglobinu H, choroba hemoglobinu Barts • - b-talasémie: minor, intermedia, major • - vzácné formy (g, d) •bezpříznakový průběh až těžká anémie (transfuzní léčba) •léčba: transfuze krve, transplantace kostní dřeně, genová terapie • - často záměna za sideropenii ref. 17 Charakteristika genů talasémie •geny HBA1, HBA2 a HBB (chromozomy 16 a 11) •3 exony, 2 introny, 5‘- a 3‘-nepřekládané oblasti před a za genem • Elektroforeogramy patogenních mutací nalezených u pacientů pomocí Sangerova sekvenování • Referenční alela; pacient I-1 Mutovaná alela; pacient II-2 c.118 C> T Varianta c.118C>T v HBB genu Varianta c.20delA v HBB genu Výsledky Sangerova sekvenování Označení vzorku HBB gen Probandka c.20delA (HT); c.9T>C (HZ) Manžel probandky c.118C>T (HT); c.9T>C (HZ) Matka probandky c.20delA (HT); c.9T>C (HZ) Otec probandky c.9T>C (HZ) Matka manžela probandky c.9T>C (HZ) a-3,7 delece Výsledky MLPA analýzy Pomocí MLPA analýzy jsme detekovali přítomnost rozsáhlé delece označené jako deleci α- 3,7 v HT i HZ stavu Delece α-3,7 zahrnuje oblast celého HBA2 genu a dále 5´- nepřekládanou oblast zahrnující regulační oblast HBA1 genu. Její rozsah je znázorněn na obrázku Šipkami jsou označeny všechny sondy z kitu MLPA a číslem délková velikost sondy. Komplexní genotypy analyzované rodiny • 1.alela: wt 2.alela: wt 1.alela: α-3,7 delece (HBA1 + HBA2); c.20delA (HBB) 2.alela: α-3,7 delece (HBA1 + HBA2) 1.alela: α-3,7 delece (HBA1 + HBA2) 2.alela: wt 1.alela: α-3,7 delece (HBA1 + HBA2); c.20delA (HBB) 2.alela: wt 1.alela: α-3,7 delece (HBA1 + HBA2) 2.alela: c.118C>T (HBB) I-3 II-1 II-2 I-1 I-2 I-4 Závěr kazuistiky •u čtyř z pěti pacientů – různé mutace pro talasémii •probandka (II-1) s partnerem (II-2) – zdravými přenašeči alel pro a- a b-talasémii •pro budoucí potomstvo: • - 100% šance přenosu minimálně 1 talasemické alely • - 25% šance vzniku b+-/ b0-talasémie •doporučeno podstoupení IVF (pro průkaz variant v HBB genu) • preimplantační genetická diagnostika pro stanovení α-3,7 delece není nutná 1.Sangerovo sekvenování 2. Panelové sekvenování – target NGS 3. Celoexomové sekvenování 1. 4. Celogenomové sekvenování 1. 1. Sekvenační metody analýzy DNA odhalení příčiny nejrůznějších nemocí -HBOC (Hereditary breast and ovarian cancer) -HNPCC/ Lynchův syndrom -familiární adenomatózní polypóza -neurofibromatóza 1. a 2. typu -xeroderma pigmentosum -Li-Fraumeniho syndrom -mnohočetná endokrinní neoplázie -hereditární retinoblastom -maligní melanom aj. 2. NGS panel BRONCO - NGS panel pro hereditární nádorové syndromy CEITEC MU + IHOK FNB 298 genů -predispozice k malignitám (onkogeny, nádorové supresory) - -zapojené do opravných drah DNA - - důležité u hematologických malignit The SureSelectXT Reagent Kits provide DNA library prep solutions with hybrid capture-based target enrichment. The kits are compatible with FFPE samples and high-quality libraries can be generated from 3 μg DNA input or lower 200 ng input. This kit provides high-complexity libraries for rare allele detection. -bioinformatický tým -in-house pipeline ANALÝZA Vyšetřeno celkem 1398 pacientů -Karcinom prsu (408)- 31% -Karcinom vaječníku (210)- 16% -Karcinom endometria a dělohy (C54- 99) – 7,5 % -Kolorektální karcinom (C18-59, C20-32, celkem 91)- 7% -Karcinom slinivky (43) – 3% -Karcinom prostaty (14)- 1% -Zhoubný melanom (21) – 1,2 % -Karcinom štítné žlázy (19) – 1,3 % -Ostatní (karcinom žaludku, neurofibromatóza, retinoblastom, osteosarkom, meduloblastom, onkologická zátěž v rodě aj.) (424) -32 % - MUDr. Trizuljak – FN Brno, ambulance IHOK (Obilní Trh) MUDr. Beharka – FN Jihlava, ambulance lékařské genetiky MUDr. Drábová (Šoukalová, Kalina) - ÚLGG Význam a využití -výběr optimální léčebné strategie v rámci personalizované medicíny -došetření ostatních zdravých členů rodiny -nabídnutí adekvátní profylaxe, screeningu a poradenství Olaparib (Lynparza) Adobe Systems Kazuistika Pacient, ročník 1995 •zralý novorozenec z III. gravidity , 3500g / 50 cm •po porodu zjištěna rozštěpová vada – rozštěp měkkého patra •PMV: průměrný až mírně opožděný – seděl v 7-8 měsících, chůze po 12. měsíci, první slova v 1.5 roce, dvouslovné věty až ve dvou letech •ve 2 letech plastická korekce rozštěpové vady •v 6 letech stomatologická operace •opakované luxace levého loketního kloubu Adobe Systems Kazuistika •v dětství opakované infekce v ORL oblasti - rhinitis, sinusitis, otitis media •po 10. roku života postupná ztráta sluchu – hypakuse, těžká nedoslýchavost vpravo, praktická hluchota vlevo (kochleární implantát) • •od 15. roku rozvoj epilepsie - záchvaty charakteru zatětí + současně myoklonie DKK, délka jednotlivých záchvatů cca 3 s, denně 1-2x, po záchvatu únava, bolesti hlavy, zavedeny antiepileptika (Lamotrigin) s dobrým efektem •mentální retardace: v popředí výrazná vývojová dysfázie expresivního, částečně i receptivního typu; mentální schopnosti celkově podprůměrné až hraniční, s disharmoniemi, slabší výkony zejména u verbalizovaných úkolů, lepší výkony v testech s jasnou vizuální podporou, dysgrafie Adobe Systems Nádorové onemocnění u probanda •ve 25 letech (1/2021) diagnostikován Schwannom akustiku • •nález pouze parciálně resekabilní, terapeutické pokusy 1/2021 vpravo, 3/2021 vlevo neúspěšné •residuální těžká paresa VII. l. dx Adobe Systems Rodokmen Mentální retardace Hluchota, epilepsie Bilaterální Schwannom GERD lymfom Zde vidíte rodokmen a šipkou je označen proband Adobe Systems Rodinná anamnéza •matka nar. 1960 – prodělala Lymeskou boreliózu matka matky- ca lymf. uzlin, zemřela otec matky- DM, zemřel • •otec nar. 1971 - žaludeční potíže matka otce – žaludeční vředy •otec otce - DM, potíže s játry • •sourozenci: bratr nar. 1985- astma bronchiale, sestra nar. 1990 zdráva • •v rodině jinak bez anamnézy vrozených vývojových vad, poruchy sluchu, dalších nádorových onemocnění Adobe Systems Fenotyp pacienta •výška 160 cm, váha 52 kg •pyknický habitus, hypotrofie svalstva, zploštělá hrudní kyfóza, zdůrazněna bederní lordóza, genua vaga • •mnohočetné fibromy kůže, pozměněny sekundárním akné, konglomata • •asymetrie obličeje z důvody parézy faciálního nervu, ptóza víček, divergentní strabizmus,, hypertelorismus, epikanty, široký kořen nosu, úzké rty, ušní boltce položené díže a dorsálně rotované, níže položená hranice vlasů • •sekundární pohlavní charakteristiky méně vyvinuté, gynekomastie, zevní genitál mužský Adobe Systems Vyšetření • •Karyotyp (1995): 46,XY; normální mužský karyotyp • •metabolické nemoci /DPM UDMP VFN Praha/: negativní výsledek screeningových vyšetření •syndrom Cornelia de Lange: /laboratoř pro studium mitochondriálních poruch KDDL, VFN Praha – izoelektrická fokusace séra s následnou imunofixací prokázala fyziol. spektrum sialovaných forem transferinu • •Rok 2023 - vyšetření BRONCO /NGS sekvenování, nádorový panel/: - detekce SNV: negativní sekvenční patogenní varianta pro nádorovou susceptibilitu nenalezena Adobe Systems •CNV analýza (digitální MLPA): heterozygotní delece CHEK2 genu • • • • • • • • • •MLPA analýza: heterozygotní delece NF2 genu • Vyšetření Adobe Systems Vyšetření • •Array CGH: rozsáhlá delece o velikosti 3.8 Mb: 22q12.1- 22q12.3 • • • • • • • Adobe Systems Rozdíly a shody u publikovaných případů •Delece NF2 genu - rozvoj oboustranného Schwannomu – medián nástupu příznaků byl 17-22 let. Penetrance onemocnění ˃95%. • •příznak velkých delecí 22q12 - rozštěp patra, rozštěp uvuly, vysoké klenuté patro nebo velofaryngeální insuficience. • •Delece 22q12 - rozvoj epilepsie. Všichni byli nositeli mutace v genu DEPDC5 gene (at the distal part of the deletion in present case). Ztrátové mutace DEPDC5 způsobují familiární fokální epilepsii charakterizovanou fokálními záchvaty vznikajícími v různých kortikálních oblastech. Adobe Systems de novo delece 22q12.1 – 22q12.3 Mentální retardace Hluchota, epilepsie Bilaterální Schwannom GERD lymfom de novo delece 22q12.1 – 22q12.3 delece nepřítomna delece nepřítomna Adobe Systems Obsah obrázku zařízení, nádobí Popis se vygeneroval automaticky. MUNI Innovation Award 2023 46 ̶všestranný nástroj určený pro diagnostické i výzkumné hematoonkologické laboratoře (CLL, ALL, AML, lymfomy) ̶umožňuje v jednom testu analyzovat různé typy molekulárních biomarkerů u nejběžnějších typů lymfoproliferativních onemocnění • (ČR: > 2000 lidí / rok) Obsah obrázku text, klipart Popis se vygeneroval automaticky. zdraví nemocní https://png2.kisspng.com/sh/cd1e252cc72171425e0412a2c08ea7a3/L0KzQYm3VcE3N6F8R91yc4Pzfri0kClzcZ9sfZ 9ybnroc8XwjB4udKpyfZ9taYPoccTsTgNmepDxh9lELXLvf7FrTcVibpQ6Tdc5MUa4RrS3TskxPWY5SKkAMUW1RoWBVsQ6PmEAS ac3cH7q/kisspng-syringe-injection-lyme-disease-serology-blood-5afc55e01656c0.9055407515264864960915 .png 2. NGS panel LYNX (LYmphoid NeXt-Generation Sequencing) diagnostic tool Adobe Systems MUNI Innovation Award 2023 47 Moderní laboratorní postup (NGS) https://png2.kisspng.com/sh/a1b54d2b361fa6c590f9ec90ec1ccd7e/L0KzQYm3U8A4N6d4j5H0aYP2gLBuTgRme6UyjO drZT3lfLF2hL11baR5RdR1b3BnPbTokwRwd58yTdNqMHG4c4m6WcY0OmUzSaUDM0G1QYK4VcIxPGg8TqY5MkO4QXB3jvc=/kiss png-test-tube-blood-test-blood-cartoon-5aa0a5c8396324.1383121115204776402351.png https://png2.kisspng.com/sh/cd1e252cc72171425e0412a2c08ea7a3/L0KzQYm3VcE3N6F8R91yc4Pzfri0kClzcZ9sfZ 9ybnroc8XwjB4udKpyfZ9taYPoccTsTgNmepDxh9lELXLvf7FrTcVibpQ6Tdc5MUa4RrS3TskxPWY5SKkAMUW1RoWBVsQ6PmEAS ac3cH7q/kisspng-syringe-injection-lyme-disease-serology-blood-5afc55e01656c0.9055407515264864960915 .png https://png2.kisspng.com/sh/c833c1b29d8a9e0060a370e4882e11da/L0KzQYm3VcAzN6h6iZH0aYP2gLBuTgBmeqR0hp 98aXzrf8bslQRmNZV0j9D1b3HnPbn8jfFvNadqeAZ4cj24cbaCVPI2QWk9UapvMT67Q4i6VskxOWI6Sqc7M0i5QYi8Vck2NqFzf 3==/kisspng-person-silhouette-download-human-vector-5ae94b598898f1.8373690115252386175595.png přestavby IG a TR translokace bodové mutace, inserce, delece AGTAATATGCCT ACCAATATAACT AG-ACCATATG-CT chromozomální abnormality Chráněno užitným vzorem (PUV 2020-37316) Adobe Systems Adobe Systems MUNI Innovation Award 2023 49 Nově vytvořený software Adobe Systems MUNI Innovation Award 2023 50 Praktické využití •Diagnostika a výzkum: > 400 vzorků • ⁃IHOK FNB: > 100 diagnostických vzorků ⁃vyšetřované diagnózy: lymfoidní leukémie, lymfomy, mnohočetný myelom, … ⁃materiál: krev, kostní dřeň, zamražená tkáň, parafinové bločky, … ⁃projekty: ⁃klonální evoluce chronické lymfocytární leukémie ⁃analýza volné DNA u pacientů s lymfomy ⁃a další 3. Celoexomové sekvenování (WES) u familiárních onemocnění krvetvorby Øvzácná a heterogenní onemocnění: variabilní klinická expresivita nekompletní penetrance fenotypu různý typ dědičnosti Ø •obtížné stanovení diagnózy – překryv klinických projevů, mírné formy •dospělý věk, těžší symptomy - orgánové dysfunkce, postižení tkání, rozvoj syndromů •přes 300 genů – některé geny predisponují ke vzniku hematologické malignity (AML, ALL, MDS) či solidních nádorů •molekulární základ – buněčný růst, checkpoint aktivace buněčného cyklu, biogeneze ribozómů, nerovnováha telomer, homologní rekombinace, procesy DNA reparace • 51 •diagnostika krevního obrazu: MCV (erytrocyty), počet retikulocytů, anemický syndrom • •anemický syndrom: -pokles koncentrace Hb ‹ 130 g/l u mužů, ‹ 120 g/l u žen -slabost, celková únava, bledost, dýchavičnost, tachykardie … •70 genů (produkce a struktura erytrocytů – změny v Hb, diferenciaci a proliferaci erytrocytů, bun. stěny, jejich enzymů) • • nekorelace mezi genotypem a fenotypem - AD, AR dědičnost • ütalasémie, Diamond-Blackfan, Fanconi A, Dyskeratosis congenita, aplastická anémie, hereditární sférocytóza, xerocytóza, stomatocytóza 1. Vrozené anemie Krevní destičky leukocyty erytrocyty https://www.practo.com/health-wiki/anemia-meaning-symptoms-and-types/93/article 52 2. Dědičné trombocytopenie (IT) •Nízká hodnota krevních destiček: mírná 100 – 150 ×109/L středně těžká 50 – 100 ×109/L těžká < 50 ×109/L → žádná - mírně zvýšená krvácivost – těžké stavy • •40 genů: megakaryopoetických a trombopoetických procesech Diferenciace a dozrávání megakaryocytů Produkce krevních destiček osteoblastic niche ------------------ vascular niche - Uvolnění krevních destiček do krevního oběhu, řečiště Staňo Kozubik et al., 2021 53 ü •Krevní obraz: poškozená maturace neutrofilních granulocytů (počet neutrofilů ‹ 2,0 x 109/l) vAD, AR, X-vázaná dědičnost v üsy, Fanconi A, GATA2 syndrom •sklon k infekcím, různé orgánové dysfunkce, •predispozice k leukémiím (MDS, AML), ke vzniku lymfomů •asociováno 24 genů: ELANE – těžká CN / cyklická CN HAX1 - Kostmannova nemoc (CNS, MR) SBDS - Schwachman-Bodian-Diamond sy GATA2 sy – mírná forma CN 3. Vrozené neutropenie (CN) 54 Welte et al., 2020 •podmíněné selháním funkce jedné nebo více hematopoetických linií •jedna nebo více abnormalit jiných orgánů • •zvýšené riziko rakoviny (predispozice k leukémii nebo solidním nádorům - krku a hlavy) • •BMFS ≈ dědičné cytopenie - odlišná klasifikace dětství •více než 60 genů üFanconi anemie üDysceratosis congenita üShwachman-Bodian-Diamond sy üDiamond-Blackfan anemie, ütěžká CN ü 4. Syndromy selhání kostní dřeně (BMFS) 55 Soulier et al., 2018 vindikace k vyšetření zárodečných variant: klinický genetik FN Brno - IHOK: prof. MUDr. Michael Doubek, CSc. MUDr. Jakub Trizuljak - lékaři z Ústavu lékařské genetiky a genomiky •žádanka k vyšetření, informovaný souhlas (FNB / CEITEC MU) • •odběr biologického materiálu – periferní krev (2 – 5 ml), bukální stěr - kostní dřeň, jiný odběr (při rozvoji malignity) •výběr pacientů + sdílení informací o projevech nemoci + výsledky z vyšetření „přesný fenotyp ® cílený genotyp“ - minimálně 2 postižení a 2 zdraví jedinci v rodině - trio-analýzy SouvisejÃcà obrázek Kudy vede cesta ke celoexomovému sekvenování ? Workflow pro metodiku WES •izolace DNA (vstupní koncentrace od 100 ng) •příprava sekvenační knihovny WES: KAPA HyperCap workflow 3.3 (Roche) - více vzorků najednou - laboratoř ~ 3 dny •vlastní proces sekvenování – CF CEITEC: sekvenátor „NextSeq 500“ - hloubka čtení 30 x (pro 90 % dat) www.sequencing.roche.com www.sequencing.roche.com Výsledek obrázku pro illumina nextseq 500 www.nextseq500.illumina.com Gerald Goh et al., 2018 -zisk hodnotitelných genových dat – soubor dat ve formátu MS Excell - - - DESÍTKY až STOVKY tisíc variant Bioinformatická analýza WES dat Gerald Goh et al., 2018 Výstup z IGV (Intergrative Genomics Viewer) 2/ varianty v počtu kopií – rozsáhlé delece, inzerce (CNV) 1/ jednonukleotidové záměny/krátké del, inzerce (SNV/ indel) Výstup z CNVkit Která varianta je ta, která způsobí nemoc? → komparativní přístup indivuálně nastavený dle případu rodiny •segregační analýza v rodinách - porovnání variant postižených pacientů a zdravých příbuzných • •předpoklad dědičnosti – autozomálně dominantní - autozomálně recesivní - X-vázaná - varianta „de novo“ •virtuální panely genů: 1/ virtuální panely podle diagnózy 2/ klinický exom (téměř 7000 genů) •hodnocení v rámci celého exomu (20 000 genů) • Hledání variant pro dané onemocnění Virtuální panel genů pro FHD (668 genů) Hodnocení a klasifikace WES variant •vybrané varianty hodnotíme v populaci: GmoAD, ClinVar, A-C-G-T české genomy (https://database.acgt.cz/) •in silico analýza variant pomocí nástrojů: • - prediktory (Align GVGD, REVEL, SIFT, ...) - softwary, databáze (Alamut, VarSome, HGMD, OMIM) - krystalografická analýza •klasifikace klinického významu variant (ACMG/AMP) Třída 1 – benigní Třída 2 – pravděpodobně benigní Třída 3 – VUS – varianty nejasného klinického významu Třída 4 – pravděpodobně patogenní Třída 5 – patogenní -klinicky významná zárodečná varianta -verifikace další nezávislou metodou Kazuistika – dědičná neutropenie u sourozenců ØProband: 3, ročník 1983 Øod 10 let sledován pro neutropenii Øopakované záněty středního ucha – ve 14 letech operace levého ucha, v 15 letech pravého ucha Øv 18 letech incize pro hýžďový absces I.sin. Øv 19 letech mononukleóza Øve 23 letech po terapii AIHA v důsledku epizod autoimunitní hemolytické anémie Ørecidivující infekty ORL oblasti Økariézní chrup, spodní můstky Ønekuřák ØWES analýza: obou sourozenců a jejich rodičů Ø Defektní chrup probanda - gingividita, stomatitida ØSestra probanda: 4, ročník 1979 Øod 12 let časté záněty středního ucha, kožní infekce a záněty dásní Østomatologické obtíže – kariézní chrup s nutností vícečetných extrakcí a náhrad implantátem ØKO: středně těžká až těžká neutropenie Kazuistika – dědičná neutropenie u sourozenců ØWES: segregační analýza - virtuální panel genů pro neutropenie segregační analýza - celý exom Ø -záchyt v SBDS genu: c.355T>C / c.536C>T SHWACHMAN-BODIAN-DIAMOND sy maternální alela / paternální alela (AR onemocnění – insuficience pankreatu, kostní malformace, anomálie jater) •pacienti: infekce, neutropenie •až 30 % riziko rozvoje hematol. malignit (MDS/AML) • varianta c.355T>C;p.(Cys119Arg) pravděpodobně patogenní varianta c.536C>T; p.(Pro179Leu) nová, raritní varianta typu funkční testování SBDS variant na úrovni proteinu Øupřesnění diagnózy Øpravidelné hematologické sledování na IHOKu: kvůli riziku rozvoje MDS či akutní leukémie Øanalýza rodinných příšlušníků – potomci jsou zdraví přenašeči této nemoci vrůzné diagnózy – genetická pracoviště: mentální retardace, svalové dystrofie, epilepsie, syndromy, neznámé příčiny onemocnění v analýza somatického exomu u pacientů s B-prekurzorovou akutní lymfoblastickou leukemií (standardní CELL chemoterap. protokoly, Blina-CELL, Pona-CELL) v v •vstupní vzorky: z data diagnózy x vzorku z remise (MRD negativní) • •nastavení metodiky pro rozšířené sledování pacientů s rozvojem ALL • • • Kde lze dále využít WES -projekt v letech 2022 – 2025 (ÚHKT / IHOK FNB / ÚLGG MU) 4. Celogenomové sekvenování Plan: 1,500 healthy Czechs from all regions Questionnaire and blood sample collection, DNA isolation Sekvenátory v naší flotile ACGTCGTACGT TAGCCCATGTA ATTCGGCGGCA TTTAAGCGCCC AATTGGCCAAT Plan: 1,000+ genomes sequencing Database of variant frequencies at individual positions in the genome (gnomAD-like browser) Analysis of Czech Genomes for Theranostics (A-C-G-T) Reality: 1,665 Reality: 1,325 1 2 3 30 to 55 years old, male & female Father comes from the same Czech region as mother Healthy (No genetic disorders) Výsledek obrázku pro healthy symbol Multicolor Map of Czech Republic with Regions | Free Vector Maps 4 5 6 NOT a transplant recipient NOT a recipient of blood transfusion (in last 6 months) NOT a pregnant woman Kritéria pro výběr dobrovolníků byla tato: Příprava knihoven •PCR-free (minimální technický bias, bez PCR chimér a chyb) •1000 ng DNA na vstupu •KAPA Hyperprep kit nebo Illumina TruSeq DNA PCR-free • •Kvantifikace pomocí qPCR (KAPA Library Quantification Kit) • •Elektroforéza produktu z qPCR Library preparation and sequencing •PCR-free library preparation (minimal technical bias) •Illumina NovaSeq •Paired-end 2×150 bp •Average coverage: 30x Sekvenátory v naší flotile Adobe Systems www.ACGT.cz Variant search F2:prothrombin mutation c.*97G>A A-C-G-T AF: 1.23% gnomAD AF v2.1.1: 1.24% F5: Leiden mutation c.1601G>A A-C-G-T AF: 6.00% gnomAD AF v2.1.1: 8.40% European '1+Million Genomes' Initiative (1+MG) | Health-RI Iniciativa „Milion evropských genomů do roku 2022“ tzv. „1+ Million Genomes“ & „Beyond 1 Million Genomes“ File:Flag of Europe.svg - Wikimedia Commons 10. dubna 2018 se ČR stala jedním z 13 zakládajících signatářů deklarace o spolupráci „Towards access to at least 1 million sequenced genomes in the EU by 2022“. Add user free icon K dnešku deklaraci podepsalo 22 členských států EU, Velká Británie a Norsko. Aktuálně se společnými silami připravují pravidla a technická infrastruktura, která od roku 2022 umožní sdílet hladce, legálně a bezpečně a celý 1 milion genomů. Cílem iniciativy je zlepšit genetickou diagnostiku v celé Evropě, a to nastavením jednotných pravidel a vytvořením podrobného referenčního souboru dat. V současné době např. pacientskou DNA můžeme srovnávat pouze s celoevropskou referenční databází, ve které je středoevropská populace jen velmi málo zastoupena. Dna free icon Error free icon Bohužel, průzkumy v jednotlivých zemích ukázaly, že genomů v Evropě nemáme osekvenováno dost – tedy pouze polovinu cíle. Například ČR dosud může přispět pouze cca 1 5000 genomy z projektu „A-C-G-T“. Proto byl zahájen mezinárodní projekt Genome of Europe, jehož cílem je přečíst půl milionu chybějících genomů. Budget free icon Očekává se, že každá z členských zemí se bude na projektu podílet proporčně dle počtu obyvatel. Pro ČR to znamená přečíst DNA dalších 16 775 lidí. Počítáme-li, že osekvenování genomu stojí cca 40 000 Kč (+ personální a provozní náklady), znamená to investici cca 750 milionů Kč. https://lh6.googleusercontent.com/EVMqPLCEoMd7QuyW4-Qxasa2kVwZzBLhzHgAoaLiku5v7cGogFUnzysXjHJaUlsLc BB3NBvv6x8D__KBqkcpPRXkmjNbk65BbdgUDST006-jGBrFJOBGDry9C0KUElxgU8A2popP Beyond One Million Genomes (B1MG) project Příklady sekvenování a financování v jiných státech: Litva: Dosud osekvenováno 1570 genomů, v novém projektu osekvenují dalších 1 500 genomů, podpořeno Ministerstvem zdravotnicví Litvy, financováno z RRF. Velká Británie: Již přečteno 100 tisíc genomů společností Genomics England (založena a vlastněna Ministerstvem zdravotnictví a sociální péče UK). Projekt byl financován z více zdrojů, zejména z NIHR a NHS England. Dánsko: Funguje zde tzv. „Danish National Genome Center“, což je instituce spadající pod Ministerstvo zdravotnictví. Do roku 2024 plánují osekvenovat 64 tisíc genomů. www.b1mg-project.eu Článek řetězu se souvislou výplní Honouring Gregor Johann Mendel legacy https://mskhistorieaja.cz/images/Mzg3eDB4MA==/Mendel_O_001.jpg Popis projektu • •Unikátní multidisciplinární spolupráce mezi laboratořemi archeologie, antropologie a genetiky Masarykovy univerzity za podpory Mendelova muzea, augustiniánského opatství a dalších subjektů. • •Projekt zahrnuje archeologickou a antropologickou dokumentaci, 3D skenování ostatků, obličejovou superprojekci, sekvenování genomu… • Adobe Systems Obsah obrázku text, interiér, pracovní stůl Popis byl vytvořen automaticky • Science for Society 2021 78 Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky Adobe Systems Ancient (starověká) DNA ̶izolovaný v laboratoři LBMA ̶lidská DNA ̶výtěžek v jednotlivých nanogramech ̶délka fragmentů aDNA koreluje s velikostí nukleozomů ̶ aDNA je většinou zachována v tvrdých tkáních – kosti, zuby Incisor2 isolated DNA Obsah obrázku interiér Popis byl vytvořen automaticky Adobe Systems 80 untreated Pre-CR treated Human genome enrichment WGS Adobe Systems mtDNA sekvenování •pro potvrzení totožnosti kosterních pozůstatků •pro kontrolu kontaminace vzorků Hair vs teeth Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky Adobe Systems mtDNA haploskupina Obsah obrázku mapa Popis byl vytvořen automaticky •Zděděno v mateřské linii • •Mitochondriální genom lze použít ke sledování našich předků • •Mendelův haplotyp: H1c • Adobe Systems • Použité sady a chemie • Vzorky izolované pomocí PrepFiler Forensic DNA extrakční soupravy • (ThermoFisher), koncentrované pomocí odstředivých kolon Amicon • Swift 2S, adaptéry UMI (IDT), EvaGreen qPCR (aby se zabránilo • přecyklování) • NGS panely: xGen Human mtDNA panel (IDT), obohacení celého • genomu MyBaits (Arbor biosciences) Science for Society 2021 83 Příprava knihovny WGS Obsah obrázku patro, interiér, mlynář Popis byl vytvořen automaticky Adobe Systems Analýza surových dat • • Mendel´s genome variants Healthy men´s genome variants • from ancient DNA from project ACGT • • ̶ •Intron variants in majority, ~30K variant in gene coding regions Adobe Systems Mendel´s variant evaluation Øsetting parameters for evaluation of variants: •variant coverage ≥ 3 reads •variant present in at least 2 unique DNA molecules •variant allele frequency (VAF) ≥ 30% •relevance in ClinVar, dbSNP (rs), PubMed •variant effect prediction software: Alamut, VarSome, etc. •disease related variants: HGMD, OMIM Adobe Systems •character: „silent, shy, timid, psychically unstable“ • Suffering from depressions? (DeCastro 2016) •prone to obesity, smoker (>20 cigars/day) •in his last years, he was suffering from „Bright‘s disease“ (a kidney disease in 19th century) •swelling of lower limbs (edema) •hypertension •cardiac hypertrophy proven by autopsy Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku text Popis byl vytvořen automaticky Mendel‘s medical condition His prescriptions include Digitalis and Cremor Tartari (as a diuretic), Salicylate, Morphium, Chinin, Potassium Autozomálně dominantní dědičnost •KCNJ2 gene: c.431G>C; p.(G144A): NM_000891.3 -heterozygous state -disease-causing variant associated with Andersen-Tawil syndrome -varying degrees of cardiac and muscle involvement, variable phenotype (cardiac arrhythmia, long QT syndrome) (Ballester LY et al. 2006, Hum Mutat) https://my.clevelandclinic.org/health/diseases/17183-long-q-t-syndrome-lqts Objev krevních skupin AB0 je všeobecně připisován vídeňskému vědci Karlu Landsteinerovi, který v roce 1901 objevil tři krevní skupiny A, B a C (dnešní A, B a 0).[4] Za tento objev dostal roku 1930 Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství. Ovšem roku 1921 americká lékařská komise dala přednost Janu Janskému, který sice krevní skupiny objevil později, ale na rozdíl od Landsteinera všechny 4................Jen tak pro zajímavost, že Mendel asi ještě neměl o krevních skupinách ponětí.... ABO Blood Group System •ABO gene (9q34.2) – 7 exons •O PHENOTYPE - deletion of guanine at nucleotide 261 of ABO gene •A/B POLYMORPHISM - several nucleotide differences between the alleles that code for the A and B glycosyltransferase enzymes O01 homozygot •RHD gene (1p36.11) •results: RHD gene without genetic variations was detected Rh positive Yamamoto et al., 1990, J. Biol. Chem. RH FACTOR → hair colour prediction: with probability 57.3% BROWN; 33.1% BLOND with probability 72.4% LIGHT HAIR → skin shade prediction: with probability 56.6% INTERMEDIATE skin (average amount of skin pigment) DNA-based hair and skin colour prediction •according to HIrisPlex-S Eye, Hair, and Skin Colour DNA Phenotyping Webtool (erasmusmc.nl) •the assay consists of 24 SNPs: 6 for eye colour prediction (not available → low coverage for HERC2 gene) 18 used for hair colour and shade prediction Adobe Systems Y – haploskupina Obsah obrázku mapa Popis byl vytvořen automaticky •Determined by variants in the Y chromosome •Y chromosome is one of two sex determining chromosomes •Inherited in the paternal lineage •Mendel‘s Y-haplogroup: R1a • Monument –,,peas“ by Jaromir Gargulak hrachovina??? Nevíme název v EN Jaromír Gargulák > Obsah obrázku text, osoba, patro, interiér Popis byl vytvořen automaticky > > Masaryk University at EXPO 2022 in Dubai > Obsah obrázku zeď, interiér, několik Popis byl vytvořen automaticky Děkuji za pozornost IHOK FN Brno – Centrum molekulární biologie a genetiky CEITEC MU – Centrum molekulární medicíny