Laboratorní diagnostika (molekulárně genetické metody) I. CMBG, IHOK, FN Brno Ing. Ivana Ježíšková, Ph.D. 29. 4. 2024 FN Brno_modra_obdelnik LEUKÉMIE •13/ 100 000 obyvatel, tj. 1 300 nových případů leukémií v ČR za rok •děti (0-18): 5 / 100 000 dětí, tj. 80 nových případů leukémií u dětí v ČR za rok Incidence Geryk E et al, Onkologie, 2013; 7(3) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling • Rozdělení dle průběhu •AKUTNÍ - rychle probíhající onemocnění - vývoj nezralých elementů (blok a ztráta diferenciace) - neléčené onemocnění způsobuje smrt nemocného v týdnech/měsících •CHRONICKÁ - probíhající pomalu, postupně - vyzrávající buňky se ztrátou apoptózy - neléčené onemocnění umožňuje přežití nemocného v řádech měsíců/ let LEUKÉMIE (C91-C95) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Charakteristika •heterogenní skupina maligních klonálních onemocnění •nepříznivé maligní onemocnění •charakterické proliferací a akumulací nezralých myeloidních prekurzorů v kostní dřeni (následné vyplavování do periferní krve) •prudká manifestace onemocnění (dny/týdny) •představuje 2-4% všech maligních tumorů •pětileté přežití 20-30% AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Incidence – vývoj v čase •3/ 100 tis. obyvatel AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Incidence – dle věkové struktury •s věkem stoupá AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Třídy mutací Chen JS., et al. Nature Genetics. 2013, 45: 586-7 AML - DIAGNOSTIKA Prognostická klasifikace pacientů s AML – ELN 2022 MOLEKULÁRNÍ MARKERY Fúzní transkripty •t(8;21) – RUNX1/RUNX1T1 (AML1/ETO) (6% všech AML), •inv(16) nebo t(16;16) – CBFB/MYH11 (7% všech AML), •t(*;11) – přestavby MLL genu, …. www.protein.bio.msu.ru KLASIFIKACE PACIENTŮ S AML Pacienti s příznivou prognózou •pacienti s aberacemi: t(8;21) – RUNX1/ RUNX1T1 (AML1/ETO) inv(16), t(16;16) – CBFB/MYH11 bialelická mutace CEBPA Grimwade et al., Blood, 2010 KLASIFIKACE PACIENTŮ S AML Pacienti s nepříznivou prognózou •pacienti se změnami: inv(3), t(3;3) – RPN1/EVI, t(6;9) – DEK/NUP214 t(*;11) – přestavby MLL genu, komplexní karyotyp -5 nebo del(5q); -7, abnl (17p) NUKLEOVÉ KYSELINY (NK) Extrakce nukleových kyselin •první krok molekulárně biologických analýz •cílem je získat NK v dostatečném množství a kvalitě www. info.gbiosciences.com •Friedrich Miescher, r. 1865 - z jader leukocytů vyizoloval směs látek bohatých na fosfor - nuklein Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling EXTRAKCE NUKLEOVÝCH KYSELIN Přístupy/ metody •tradiční přístup – fenol/ chloroformová extrakce vysolování (DNA) •výhody: vysoká výtěžnost a čistota, levná •nevýhody: časová náročnost, práce s nebezpečnými látkami •nové metody – adsorpce na kolonku se silikátem vazba na magnetické partikule •výhody: nenáročná, rychlá, bezpečná •nevýhody: finanční náročnost Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling AUTOMATIZACE EXTRAKCE NK Automatické izolátory •QIAcube (Qiagen) – silikátové kolonky •Maxwell (Promega) – magnetické částice Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Polymerázová řetězová reakce - PCR •jednoduchá metoda rychlého zmnožení určitého úseku DNA •objevitel – Kary Banks Mulis, 1983 (publikace 1985, Science) •1993 Nobelova cena za chemii, za objev techniky PCR Kary Mullis (*1944) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE Přístroje •amplifikace probíhá v termocyklerech Trio 48 (Biometra) T100 (Bio-Rad) GeneAMP 9600 (Perkin Elmer) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling DETEKCE FÚZNÍCH GENŮ RNA analýa – AMLplex •Mentype AMLplex QS CE-IVD (Biotype): 11 fúzních genů; 34 variant transkriptů ABI 3130XL (Applied Biosystems) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling SEKVENOVÁNÍ Historie •r. 1975 – F. Sanger a A. R. Coulsen vyvinuli biochemickou metodu sekvenování NK (dideoxy metoda) •sekvenování manuální – gely •r. 1986 – sekvenování automatizované (v kapilárách) – první fluorescenční sekvenátor (AB370A, Applied Biosystems) Fred Sanger (*1918-†2013) www.abrngood.com Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling SEKVENÁTORY PRVNÍ GENERACE •sekvenování - čtení pořadí jednotlivých nukleotidů v NK •čteny jsou úseky dlouhé max. 600 – 700 nukleotidů ABI 3130XL (Applied Biosystems) – 16 kapilár •fragmentační analýza – automatizovaná elektroforetická separace různě dlouhých fluorescenčně značených DNA fragmentů Možnosti SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS) Panelové DNA sekvenování •VariantPlex Core Myeloid (Archer/Invitae) – 37 genů C:\Users\60838\Desktop\nextseq.png NextSeq 500 System (Illumina) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS) Panelové DNA sekvenování •VariantPlex Core Myeloid (Archer/Invitae) – 37 genů Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS) Panelové DNA sekvenování •VariantPlex Core Myeloid (Archer/Invitae) – 37 genů •Analýza bulku Gen Klasifikace varianty Nukleotidová záměna Aminokyselinová záměna VAF FLT3 (ITD) patogenní NM_004119.2: c.1770_1771insCTC/1741-1770 NP_004110.2: p.(Phe590_Tyr591ins11) 2,7 % WT1 pravděpodobně patogenní NM_024424.3:c.1137_1140dup NP_077742.2:p.(Ser381Thrfs*5) 38,8 % RUNX1 pravděpodobně patogenní NM_001754.4:c.424_445dup NP_001745.2:p.(Ala149Glyfs*2) 28,0 % WT1 pravděpodobně patogenní NM_024424.3:c.1138_1142dup NP_077742.2:p.(Ala382Glyfs*69) 30,1 % NRAS pravděpodobně patogenní NM_002524.4:c.38G>A NP_002515.1:p.(Gly13Asp) 14,1 % FLT3 (TKD) pravděpodobně patogenní NM_004119.2:c.2505T>A NP_004110.2:p.(Asp835Glu) 6,9 % PTPN11 pravděpodobně patogenní NM_002834.4:c.205G>A NP_002825.3:p.(Glu69Lys) 2,1 % Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling SINGLE CELL SEKVENOVÁNÍ DNA scNGS •Sekvenování dílčích/ jednotlivých buněk Tapestri v2 (MissionBio) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling SINGLE CELL SEKVENOVÁNÍ DNA scNGS •Sekvenování dílčích/ jednotlivých buněk Identifikace: •klonální heterogeneity •vhodného markeru pro sledování MRD Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling SLEDOVÁNÍ MRD Minimální reziduální nemoc (MRD) Buckley SA, et al. Bone Marrow Transpl. 2013. REAL-TIME PCR Kvantitativní (RT) real-time PCR •průběžný monitoring množství amplifikovaného PCR produktu •součástí PCR reakce jsou fluorescenční barviva/ sondy •množstevní přírůstek je měřen jako zvyšující se intenzita fluorescenčního záření QuantStudio 3 (Applied Biosystems) Rotor gene Q (Qiagen) ABI7300 (Applied Biosystems) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling REAL-TIME PCR Absolutní kvantifikace •vzorky o neznámé koncentraci jsou porovnány se standardy o známé koncentraci. •koncentrace - vyjádřená počtem kopií analyzovaného úseku je intrapólována ze standardní křivky. www.sabiosciences.com AMPLIKONOVÉ SEKVENOVÁNÍ DNA aNGS •až pro 100% aberací detekovaných panelovým sekvenováním •také jako multiplexové reakce •nutno vyloučit „preleukemické“ mutace (DTA aberace) •senzitivita 0,05% VAF Predispozice k AML Tawana et al. Blood. 2015 FAMILIÁRNÍ VÝSKYT AML Gen CEBPA Tawana et al. Blood. 2015 GERMINÁLNÍ MUTACE 45 % nosičů mutace v genu CEBPA onemocní AML 10 % AML pacientů s mutací v genu CEBPA nese mutaci germinálního původu WHO klasifikace Döhner et al. Blood. 2017 GERMINÁLNÍ MUTACE •1 – 2 % všech případů AML je familiárního původu CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Charakteristika •klonální myeloproliferativní onemocnění; nádorové buňky nesou Filadelfský chromosom (Ph), tj. reciprokou translokaci t(9;22), důsledkem translokace je vznik fúzního genu BCR/ABL1 •fúzní gen kóduje trvale aktivní proteinkinásu BCR/ABL1 CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Incidence – vývoj v čase •1,1-1,5/ 100 tis. obyvatel CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Incidence – dle věkové struktury •75% nemocných je starších 50 let •mírná predispozice u mužů (1,4:1) CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Fáze onemocnění - tři klinická stádia onemocnění - až 95% nemocných je zachyceno v chronické fázi www.healtline.com -moderní přístup analýzy PCR amlikonů na gelech - systém QIAxcel (QIAGEN) - rychlá analýza bez nutnosti práce s nebezpečnými látkami - finančně náročnější CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Vstupní vyšetření – multiplex PCR soft Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Sledování MRD • kvantitativní analýza exprese fúzního transkriptu BCR/ABL1 - rutinně metodou real-time RT-PCR - předpokladem je znalost typu zlomu Sledování MRD - alternativa k real-time PCR - systém GeneXpert (Cepheid) – uzavřený, cartridge systém -automatizovaná platforma zahrnující všechno kroky analýzy exprese fúzního transkriptu BCR/ABL1 GeneXpert_lightbox m-xpert-bcr-abl 1-s2 vzorek reagencie -výsledky analýzy k dispozici za cca 2 hodiny od odběru CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Léčba tyrozinkinázovými inhibitory (TKI) -zavedení tyrozinkinázových inhibitorů do léčby pacientů s CML významně vylepšilo jejich prognózu CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Léčba tyrozinkinázovými inhibitory (TKI) -zavedení tyrozinkinázových inhibitorů do léčby pacientů s CML významně vylepšilo jejich prognózu CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Rezistence na léčbu (TKI) -mutace v kinázové doméně BCR/ABL1 (více jak 100 mutací) CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE Rezistence na léčbu (TKI) -nejzávažnější mutace: T315I Zdroj: de Lavallade et al., Oncology, 2016. METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Digital PCR (ddPCR) •amplifikace jednotlivých prostorově oddělených molekul NK •výsledek každé amplifikace se hodnotí zvlášť QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-RAD) Earlisest mutations occur in lamndscaping genes involved in regulation of epigenom Wheras late mutations occur primarily in proliferative genes involve in activated signaling CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE TKI-vedlejší účinky CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE TKI-vysazování -pacineti mohou benefitovat z vysazení TKI -formou klinických studií – FN Brno: studie HALF - DĚKUJI ZA POZORNOST