MUNI MED Úvod, historie kryokonzervace a kryoprotektiva doc. Ing. Michal Ješeta, Ph.D. Gynekologicko-porodnická klinika, LF MU a FN Brno Organizace předmětu EMKO0811p Kryoprezervace 1) Úvodní přednáška - základní metody kryoprezervace v biologii, historie technik kryokonzervace 2) Princip metod kryoprezervace tkání a buněk, kryoprotektiva a jejich užití v kryokonzervaci tkání 3) Vitrifikace embryí - způsoby, stádia mražení, doba uchovávání, požadavky SUKL 4) Vitrifikace oocytů - způsoby, efektivita, využití - dárcovský program, sociál freezing 5) Kryokonzervace spermií (podmínky skladování, typy nosičů, požadavky SUKL) 6) Kryokonzervace ovariální a testikulární tkáně 7) Legislativní a etické otázky spojené s kryokonzervaci a uchováváním lidských gamet a embryí, současné trendy metod ART využívající vitrifikace. Neonatologické výsledky ve vztahu k vitrifikaci embryí a gamet Zkouška: test otázky a,b,c maximální počet 30 bodů + 2 samostatné otázky za 5 bodů Maximální zisk 40 bodů, 37-40 A, 33-36 B, 29-32 C, 25-28 D, 21 -24 E, pod 21 F MUNI MED Literatura: pdf přednášek na IS MUNI Klinická embryológie mťadá frvnlu 2018 2018 Fertility cryopreservation Edited by Ri-cheng chian and Patrick Quinn 2010 Vitrification in Assisted Reproduction Second Edition Michael J Tucker Juergen Liebermann 2016 MM pt ELEONORA PORCU PATRIZIA MARIA CIOTTI STEFANO VENTUROLI Handbook of Human Oocyte Cryopreservation 2012 mil Cryopreservation in Eukaryotes Edited by Francisco Marco-Jimenez and Hufya Akdemtr 2016 MUNI MED Historie kryokonzeravce 1668 - Rober Boyle, zakladatel moderní chemie zveřejnil práci „New Experiments and Observations Touching Cold" irský filozof věřil, že některá zvířata lze zmrazit a opět oživit pokud se pomalu rozmrazí 1898 - ruský fyzik G. Tammann píše o tom, že molekuly sloučenin uhlíku mohou ztuhnout v podobě amorfního skla aniž by vytvořily krystaly 1940 - kniha „Life and Death at Low Temperatures" základ pro další rozvoj oboru a její autor švýcarský kněz B.J.Luyet se stal otcem oboru kryobiologie 1949 - práce „Revival of Spermatozoa after Dehydration and Vitrification at Low Temperatures" první efektivní použití glycerolu jako kryoprotektiva (Polge Christopher, Audrey Ursula Smith, and Alan Sterling Parkes) Historie krykonzervace v ČR w^íi- tes* i - 1952 založení Tkáňové ústředny v Hradci Králové (prof. Klen) - 1966 Ferox Děčín začal vyrábět kryokontejnery - 1969 Sekce pro biologii nízkých teplot (prof. Klen) v ČSBS - 1992 zahájen program kryokonzervace embryí (FN Brno) - 1993 první dítě po KET v ČR (FN Brno) FEROX - 2003 první dítě narozené po vitrifikaci oocytů (Pronatal Praha) M U NI MED Odborné společnosti Society Cryobiology -The Society for Cryobiology založena v roce 1964 *«* • •«• • ■ • • ESKO-SLOVENSKA BIOLOGICKÁ SPOLEČNOST, z.s . . - • • sekce pro biologii nízkých teplot v rámci České biologické společnosti, vznikla v roce 1969 M U NI MED Historie kryokonzervace v reprodukci 1775 - Lazaro Spallanzani se pokusil uchovat spermie ochlazením ve sněhu, první kdo popsal vliv nízkých teplot na spermie, první IUI u psa 1952 - první práce zaměřené na mražení býčího ejakulátu a jeho použití pro inseminace 1954 - technika mražení lidských spermií a jejich použití (J.K. Sherman, R. Bunge - University of lowa) 1972 - první myší mláďata narozená po kryokonzervaci embryí (lan Wilmut a DG Whitting) Historie kryoprezervace v reprodukci - člověk 1983 - první těhotenství po KET lidských embryí, mražení 8 dní po IVF (australští lékaři Trounson a Mohr) 1986 - úspěšné mrazení lidských oocytů, porod dvojčat (australský vědec Ch. Chen) 1999 - narození prvního dítěte po použití vitrif i kovaných oocytů (doktorka Lilia Kuleshova) Historie kryokonzervace v IVF E fakultní nemocnice brno History of cryopreservation in ART Ultrarapid H Vitrification with EM grids OPS Ultrarapid Vitrification i In ixij i it. * i li \ i 1 1 HCl II VTI Slow freezing of domestic animal embryos P M .. .i.-.-. Slow freezing of mouse embryos Slow freezing of human embryos Slow freezing of human oocytes Vitrification of mouse oocytes Vitrification of mouse embryos Vitrification of bovine blastocysts CryoLoop CryoTip Ultrarapid Vitrification 1935 1948 1972 1973/1974 1983 1985 1989 1993 1996 1997 1999 "It is more difficult to destroy a prejudice than an atom" Albert Einstein MUNI MED Historie kryokonzervace v IVF ^ fakultní nemocnice brno 1. Slow freezing (Equilibrium freezing) 1966 Human oocyte 1972 Mouse embryo Chen et el Whitttnoham at si. 2017 2147 OoR KET > OoR KET 2017 2017 2018 2018 2018 1268 LU 2019 2019 2019 Rok a metoda Cycle segmentation - freeze all "zmrazení všech" všech oocytů/embryí optimalizována stimulace vaječníku, včetně konečného zrání oocytů spouštěného agonistou GnRH v antagonistickém cyklu (nevýhodou je časný nástup luteolýzy) - všechny oocyty a/nebo embrya jsou kryokonzervovány (segment A) - přeneseny do receptivního endometria v následujícím cyklu (segment B) - touto strategií lze riziko OHSS téměř eliminovat - zlepšení klinické míry těhotenství při použití kryokonzervovaných ve srovnání s čerstvými embryi - kryokonzervace nemůže zaručit přežití všech embryí, ale tyto výsledky jasně podtrhují užitečnost kryo konzervace při zvyšování bezpečnosti IVF léčby MU NI MED Metody kryokonzervace - původní hypotéza byla založená na tom, že se snižující se teplotou se zpomalují biologické děje a že tedy při zamrazení dojde k zastavení dějů, které se následně po rozmrazení obnoví - bylo však zjištěno, že buňky během mražení a rozmražení odumírají - dochází k poškození buněk vlivem krystalizace ledu a každá buňka má svůj optimální postup mražení rozmražení. pokud je to příliš rychlé - krystalky buňku zabijí pokud příliš pomalu - vážné poškození dehydratací je obtížné mrazit orgány, kde je více typů buněk - nadějí se proto stala vitrifikace - molekuly vody vůbec nemrznou a nevznikají krystaly, jen prostě ztuhnou ve svém neuspořádaném stavu -solidifikace, zeskelnění - pro toto potřebujeme velice rychlé zamražení a velice vysokou koncentraci kryoprotektiv - vzorek je pak viskózni a nevzniknou ledové krystaly M U l\l I MED Krystal izace vody - maximální hustota vody je při 4°C - krystalizace na různých defektech (např. prachové částice) - destilovanou vodu lze zchladit na -15°C bez krystalizace - malý podnět způsobí její krystalizaci, Tg je -137 °C - krystalizace v hexagonální soustavě, lomenný tvar molekuly vody s úhlem 105° - uspořádávají do šestiúhelníkového tvaru tak, že na jednu molekulu vody se vážou celkem čtyři další vznik skla - vitrifikace - ztráta rotačních a translačních stupňů volnosti za zachování pouze vazebných vibrací uvnitř pevné molekulární struktury PNI MED Krystalizace vody v buňkách - buňky cca 90 % vody - nejprve krystalizace extracelulární tekutiny Dehydration - zvyšuje se koncentrace látek extracelulární nezmrzlé frakci a tím vzniká osmotický gradient mezi intra a extracelulárním prostorem - buňka se to snaží vyrovnat vypuzováním vody - dojde k buněčné dehydrataci vedoucí k strukturním změnám buněčné membrány - membrána je poškozená a buňka umírá O intracelulární krystalizace vede k poškození buňky pokud ovšem je ochlazení příliš rychlé, tak se buňka vody nezbaví a vzniknou intracelulární krystaly t3 w Supercooling and intracellular ice formation Poškození buněk při mražení EFAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO Kryoprotektiva - CPA • vznikají v tělech arktických a antarktických zvířat (hmyz, ryby, obojživelníci) aby minimalizovaly poškození mrazem během zimní periody roku • kryoprotektivum by mělo být vysoce solubilní, penetrující a minimálně toxické • cílem kryoprotektiv je oddělit maximální množství vody od buněk před samotným zamrazením • voda je v embryonálních buňkách nahrazována permeabilními roztoky kryoprotektiv na základě rozdílné koncentrace mezi extra a intracelulárním médiem - tím se redukuje vznik nitrobuněčných ledových krystalů • během výměny látek dochází k mírnému osmotickému smršťování, které ale nepoškozuje embryo •velmi dlouhé vystavení embrya hyperosmotickému roztoku může vést k silné dehydrataci a toxicitě III U M I MED Kryoprotektiva v přírodě některé druhy hmyzu hromadí kryoprotektiva ve svém těle před nástupem zimy larva drozofilní mouchy Chymomyza costataje pravděpodobně nejsložitějším organismem, který dokáže přežít ponoření do kapalného dusíku (-196 °C) v plně hydratovaném stavu. larva pakomára Chironomus například obsahuje nezmraženou tekutinu ještě při -32 °C parazitická vosa Brochon ceptisi vytváří glycerol, jehož koncentrace se v zimě zvyšuje. Glycerol snižuje bod tuhnutí na -17 ° C, aleje známo, že larvy přežily ochlazení až na -47 °C krev arktických ryb Trematomus zase obsahuje glykoproteinovou nemrznoucí směs, která je 200 až 500krát účinnější než sůl. Snižuje teplotu, za které se ledové krystalky zvětšuji m fakultní nemocnice ■ brno AFP - antifreeze proteins, AFGP - antifreeze glycopeptides snižují bod tuhnutí vody a zabraňují růstu ledových krystalů ve zmrzlém stádiu, brání rekrystalizaci lze nalézt v různých zdrojích, jako jsou ryby, kvasinky, rostliny, bakterie a hmyz AFP mají široké uplatnění při mrazení potravin, ochranu mrazových rostlin, kryochirurgii a kryokonzervaci buněk a tkání AFGP8 z aljašské tresky Boreogadus saida zlepšil kryotoleranci bovinních blastocyst a oocytů AFP/AFGP jsou testovány jako kryoprotektiva pro mrazení spermií Kryoprotektiva zmrazovací techniky jsou založeny na použití jedné, nebo více ochranných látek proti zmrznutí - kryoprotektiv (CPA) Způsoby působení: vážou vodu a tím redukují toxické vlivy vysokých koncentrací dalších sloučenin ochraňují buňky během pomalého mražení, kdy jsou buňky velmi dehydrované a jsou obklopeny koncentrovanými solemi ve vysokých koncentracích minimalizují poškození způsobené vznikem ledových krystalů pro procesy pomalého mražení se používají koncentrace kryoprotektiv okolo 1,5 M, pro vitrifikaci i více než 4 M Objev kry o protektiv: E fakultní nemocnice brno 1949- Christopher Polge realizuje své experimenty na kohoutích spermiích, kdy přidával glycerol do vzorků aby zvýšil viskozitu vzorků a studoval pohyb spermií, zároveň používal kapalný dusík pro sledování dalších vzorků a sledování jejich struktury, omylem dal vzorek spermií v glycerolu do kapalného dusíku (záměna lahviček v lednici) 11 Poté co vzorek zahřál byl překvapen, že se spermie stále hýbou. tak byl objeven kryoprotektivní efekt glycerolu, který zabraňuje tvorbě krystalů během mražení cestou dehydratace buněk M U NI MED Historie objevů kryoprotektiv Small molecules Macromolecules Glycerol Ethylene Glycol Propylene glycol DMSO Amino acid Trehalose Zwitterionic betaine L-carnitine, Proline 1949 1953 1954 1955 1959 1962 1965 1967 1985 1986 1990 2003 2009 2010 2015 2017 2019 2020 PEG PVP, Dextran Albumin HES AFP PVA FicoN® AFGP analogues Polyampholytes Hydrogel, Hyaluronic acid Polyproline, PMGS Zwitterionic polymers L-proline oligomers, Trehalose-based synthetic polymers MUNI MED jj ^ Kryoprotektiva - působení Kryoprotekce působí dvěma způsoby: má vliv na fázový přechod roztoku do pevného stavu obalí membránu buňky a chrání ji před mechanickým poškozením krystaly z extracelulárního prostoru Z hlediska vlivu na fázový přechod, resp. vznik krystalické fáze roztoku můžeme kryoprezervační materiály rozdělit: 1. třída: například, dimethylsulfoxid (DMSO), trehalóza, či sacharóza, které upravují termodynamiku procesu mražení 2. třída: například antifreeze proteiny (AFP), které se dokáží navázat na rostoucí krystal ledu a zamezit dalšímu růstu. Kryoprotektiva (x 10 J cm/min) e 12 1 10 41 O. C « í <- O 8 6 4 2 0 (42) Gly (9) n JL (1/) (12) □ Oocyte at 151 □ Oocyte at 251 ■ Morula at 151 □ Morula at 251 (20) n (20) a a nMSO PG BG AA OM Cryoprotcctant různorodá skupina látek, které se liší toxicitou, rychlostí přechodu do buňky a bodem tání (Tm) a bodem solidifikace (Tg) propustnost membrán pro kryoprotektiva se liší u oocytů, embryí a blastocyst, proto jsou pro mrazení jednotlivých stádií vhodná různá kryoprotektiva Chemická kryoprotektiva se dělí: • Penetrující: ovlivňují biochemické a strukturální vlastnosti membrán, čímž zvyšují toleranci k mrazu, stabilizují proteiny a DNA, minimalizují osmotické změny (ethylenglykol, DMSO, 1,2-propandiol) • Nepenetrující: fungují jako osmoticky dehydratační, minimalizují toxický efekt penetrujících, zvyšují osmoticky tlak okolí, dehydratují (trehalóza, sacharóza, PVP) I Kryoprotektiva Penetrující Glycerol, DMSO (dimethylsulfoxid), Ethylenglykol, 1,2-propandiol (CG exocytóza) (a) AQP3 Gty O (b) AQP3 EG O vysoká polarita, tvoří vodíkové vazby s molekulou vody (DMSO) ^IGi snadno pronikají do buněk osmózou přes akvaporinové kanály část intracelulární vody je nahrazena CPA (c) AQP3 některé zhoršují permeabilitu pro vodu - horší dehydratace o*. Other channels (d) O Water o Water AQP3 PG O V Water Způsobují zvýšení viskozity vedoucí k: zpomalení pohybů vody zpoždění jevu nukleace snížení rychlosti růstu ledových krystalů omezení velikosti krystalů mezi Tm a Tg zhoršení tvorby krystalů l-'igure 5.4 Schematic representation of the pathway for the movement of cell permeating cryoprotcctants and water in the presence of cryoprotcctants across the plasma membrane of mouse oocytes and morulac. Solid lines indicate the movement of water and cryo-protectants across the plasma membrane by facilitated diffusion via channel pathways, whereas dotted lines indicate the movement of water and cryoprotcctants by simple tl ■ 1 fusion, (a) I he movement of water and glycerol ((il\ I. (b) 'Ihc movement of water and ethylene glycol (EG), (c) Ihc movement of water and dimethyl sulfoxide (DMSO). (d) Ihc movement of water and propylene glycol (PG). "Other channels" refers to DMSO-permcable channels. Open circles represent water molecules; shaded circles represent cryoprotcctant molecules. (AQP3 - aquaporin 3.) (Modified from Kasai M, Kdashigc K. Fertility Cryopreservation. Cambridge University Press: Cambridge, 2010. p. 16-23.) M U lil I Kryoprotektiva MED Nepenetrující Sacharóza, Manitol, Sorbitol, Trehalóza vysokomolekulárni látky, Ficoll, polyvinylpyrrolidon (PVP) hyaluronan, dextran, polyethylenglykol polyvinylalkohol, sérum a jeho složky - vytváří osmotický tlak na membrány buněk - podporují dehydrataci buněk, netoxické - chrání membrány před poškozením extracelulárními krystaly - častou součástí rozmrazovacích médií, chrání před osmotickým šokem Teplotní bod solidifikace Tg 0 2 4 6 8 1 1.2 1.4 1.6 1 8 2 WQ' (Grams Unfrozen Water/Gram Soíute) Roztok glycerol u během mražení CPA - přehled Table i. Cryoprotective agents. Alcohols and Sugars & Sugar Polymers Sulfoxides & Amines Derivatives alcohols Amides Methanol Glucoseb Polyethylene glycol Dimethyl Proline*7 (PEG)C sulfoxide^ Ethanol* Galactose13 Polyvinyl pyrrolidone Acetamideb Glutamineb (PVP)b Glycerol Lactose3 Dextransc Formamideb Betaineb Propylene glycolc SucroseflC Ficollc Dimethyl acetamide* Ethylene glycol Trehalose11 Hydroxeythyl starchc Rafflnosec Serum proteins (complex mix)c Mannitolab Milk proteins (complex mix)ab Sorbitol3 Peptones1 MUNI MED Ochrana buněk při kryokonzervaci Poškození v důsledku: ■ použití CPA o příliš vysoké koncentraci nebo po příliš dlouhou dobu ■ použití nevhodných CPA ■ špatný postup zamražování ■ nevhodná teplota při mražení, uchovávání či rozmražení ■ špatný průběh ochlazování či zahřátí ■ kontaminace infekčním agens I.1UÍI1 MED o Dimethyl sulfoxid - DMSO S - významné polární rozpouštědlo u ° - bezbarvá, hydroskopická kapalina, prakticky bez zápachu či s lehkým česnekovým odérem, s nasládlou chutí - MW 78,13 g/mol, Tg -65°C, Tm 19°C - DMSO je běžné kryoprotektivum, v současnosti je nejčastěji součástí kryoprotektivních směsí, například s EG tvoří dobře rozpustitelnou směs, u které bylo dosaženo výborných kryoprotektivních výsledků u embryí - cytotoxické pro některé bunky (koncentrace nad 10 w/w%) - spojována s toxicitou na buněčných membránách - možný vliv na epigenetický profil buňky, snadno proniká kůží, narkotické účinky - kryoprotektiva s malou molekulou (jako DMSO), jsou obecně výhodnější, rychleji prostupují do buněk a zkracují expoziční dobu. Při rozmražení se DMSO rychle dostává z buněk, buňky mohou rychle nabýt na svém HUNI původním objemu a předejít osmotickému poškození ^ ^ CH2OH Sacharóza k en-ton lfo f! OH UM II - MW 342,3g/mol, Tg 60°C, Tm 186 °C - bílá krystalická látka se sladkou chutí, rozpustná ve vodě - běžně používaný kryoprotektant - velkou molekulu patří mezi nepronikající kryoprotektiva a její vlastností je osmoticky dehydratovat buňku a tím jí chránit před krystalizací, která by poškodila buněčné membrány - poživatelný sacharid, není toxická, nedráždí, není genotoxická MU NI MED 6CH.2OH H Trehalóza HO 4 H H OH H Oř Trehalosa or-D-glucopiranosil o-D-glucopiranósido - MW 342,3 g/mol, Tg 106°C !!, Tm 203°C - bílá krystalická látka se sladkou chutí, rozpustná ve vodě, ethanolu, benzenu a dimethyletheru - je více účinný kryoprotektant než běžně používané kryoprotektanty (sacharóza, matlóza) - velkou molekulu patří mezi nepronikající kryoprotektiva a její vlastností je osmoticky dehydratovat buňku a tím jí chránit před krystalizací, která by poškodila buněčné membrány - poživatelný sacharid, není toxická, nedráždí, není genotoxická - se zvyšující se koncentrací trehalózy se snižuje schopnost vody tvořit celistvé krystaly, vytváří se polyamorfní krystality lili U M I MED Ethylenglykol HO ethan-1,2-diol (nebo 1,2-ethandiol) MW 62,07 g/mol teplota varu 197,3°C teplota tání-12,9°C, Tg -85°C pro myší embrya a blastocysty je málo toxický a rychle difunduje skrz zona pellucida a přes membrány nejméně toxický pro buňky ze všech penetrujících CPA velice často používaná na embrya chladící kapaliny, sladká chuť, velice jedovatý pro člověka (příčinou toxicity není ethylenglykol samotný, nýbrž jeho metabolity), otrava častá (100 ml smrtelná dávka) po požití Fridexu podat otrávenému větší množství tvrdého alkoholu (např. vodky), tím utlumíme metabolismus ethylenglykolu, protože tělo bude přednostně odbourávat eř/?aM?U N I z vodky. MED Glycerol - první objevené kryoprotektivum - Tg -65°C, bod tání 17,8 °C, MW 92,1 g/mol - pomaleji prostupující než DMSO či propandiol - tříuhlíkatý cukerný alkohol - bezbarvá viskózni kapalina bez zápachu, sladké chuti - propan-1,2,3-triol - často v kosmetice - glycerinové čípky - velice nízká toxicita oproti ostatním penetrujícím CPA - vyšší osmotická lýza oproti DMSO Bjycerinové CÍĎky 2.2g QH3ŽZ3 MUNI MED Propandiol HO - často používané na mražení časných embryí - propan-1,2-diol, propylenglykol -MW76.1 g/mol - bod tání -59 °C, Tg -68 °C - tradiční CPA, jedno z nejdéle používaných kryoprotektiv - menší toxicita než DMSO - málo dráždivý, není kancerogenní a genotoxický - hlavní součást deodorantů, e-cigaret, vonné oleje - lékařský lubrikant, chladící médium Polyvinylpyrolidon PVP neprostupující CPA, stabilizátor potravin E1201 MW 2 500 - 25 000 000 g/mol, bod tání 130 °C může ovlivnit integritu nukleových kyselin makromolekuly, jako je polyEG, Ficoll nebo polyvinylpyrrolidon, které se používají jako doplňky ve vitrifikačním médiu, podporují vitrifikaci s nižšími koncentracemi CPA dalším zvýšením rychlosti ochlazování (>10 000 °C/min), která je potřebná pro úspěšnou vitrifikaci oocytů/embryí, se konečný objem vitrifikačních mikrokapiček snížil a to až na 1 |jl. M U NI MED Polymerní CPA - vyssi l g nez penetrujici - jejich použití zvyšuje viskozitu roztoku zvyšuje Tg a snižuje teplotu tání Tm - tyto CPA tak zkracují dobu změny teploty Tm až Tg - která je obecně dobou kdy dochází k tvorbě škodlivých extracelulárních krystalů - zmírňují negativní dopad penetrujících makromolekul na buňky mnoho typů makromolekul s kryoprotektivním účinkem Temperature °C -120 -100 -40 ^^°te Glass phase Glass transition No crystals Concentration of solution MUNI MED CPA makromolekuly - Přirozené makromolekuly: HA, dextren Semisyntetické makromolekuly: HES, semisyntetické deriváty celulózy - Syntetické makromolekuly: Ficoll®, PEG, PVP, PVA, trehalose-based polyetery, polyampholyty OH --O ..O Ficoll ™ 400 «w«00,000 I. ,7