MUNI MED Kryokonzervace embryí doc. Ing. Michal Ješeta, Ph.D. Gynekologicko-porodnická klinika, LF MU a FN Brno M U N I Vitrifikace MED vitrifikační média reagují s intra i extra celulární vodou snižují bod mrazu vytěsněním vody zabrání tvorbě krystalů roztok ztuhne tak rychle, že molekuly nemají dostatek času na to, aby se přestavěly do krystalické podoby velice rychlé zmrazení cca 23 000 °C/min (od +25 °C do -196 °C) sirupovitý roztok se mění v amorfní led vysoké koncentrace kryoprotektiv okolo 4M penetrující a 0,5 M nepenetrující - silně hypertonické prostredí Concentration of cryoprotectant in VS 30% (EG and DMSO) C Volume of 0.1 uL Cooling rate of approximately 23,000°C/min Osmolarity of VS =8.000 to 4.000 mOsm/L MUNI MED Vitrifikace • problém vitrifikace je dosažení a udržení podmínek uvnitř i vně buněk, které zaručují amorfní stav po celou dobu ochlazování i během procesu zmrazování • tohoto stavu je dosaženo, když jsou rozpuštěné látky dostatečně koncentrované nebo když je chlazení dostatečně rychlé, aby zvýšená viskozita inhibovala nukleaci a zabránila růstu ledových krystalů • když se koncentrace CPA zvyšuje, Tg stoupá (Tg = -135 °C pro čistou vodu, < -135 °C pro roztoky CPA) a amplituda tranzitu mezi Tm a Tg se zkracuje • čím rychleji je tento teplotní rozsah překročen tím nižší je pravděpodobnost vzniku ledových krystalů Vitrifikace -Tg u vody je -137 °C -musí ale být ochlazení rychlejší než 100 000 °C/min -zabrání to nukleaci krystalů při přechodu mezi Tm a Tg - pod Tg je moc pomalý pohyb molekul a nedojde ke krystalizaci -záleží na rychlosti ochlazování a objemu kapaliny - přidání kryoprotektiv zvyšuje viskozitu -CPA pronikají do buňky, částečně nahrazují vodu a zpomalují pohyb molekul vody, to vede ke: 1) zpomalení nukleace krystalů 2) redukce růstu krystalů 3) omezení velikosti krystalů mezi Tm a Tg I.IUÍII MED Vitrifikace - voda 20'C 1 o°c Thermol ~ ao'c 4---------------------------.......------ -I37«C 196aC 4 Tm 0 < -C/w K * Vol Th I I nu King I Area of heterogeneous nucleation liquid ft«>^» uouiogeueou* ihm It .dinu /"-' Area of homogeneous nucieation Tg Glass transition T* I — crystallina phase At glassy state Pure H20 Tm- teplota tání, Th - teplota vzniku homogenních jader Tg - teplota zesklovatění mu ni MED Vitrifikace ?o*c -~40*C 100'C -I37*C Liquid phase Tm • * £ Area of , 0 heterogeneous nucleation crystalline phase ^ Area of 4jf homogeneous nucleation »HK Glassy state Tm melting T" Th homogenous nucleation 1 T, glass transition T* Pure HJ° Culture media solution - salt -AA - protein 'preservation solutions Solute = salt- AA - protein + cryoprotectant I Přidání CPA mění Tm, Th i Tg - velmi vysoká koncentrace ale buňky poškozuje v závislosti na době expozice • nad Tg jsou roztoky buď podchlazené, nebo ve stavu krystalické pevné látky • pod Tg se podchlazený roztok může přímo transformovat z kapalného stavu do stavu zvaného skelná pevná látka nebo amorfní led • krystalická pevná voda vytvořená při teplotě nad Tg zůstane krystalická i při ochlazení pod Tg • aby se dosáhlo skelného pevného stavu, musí být Tm na Tg předán bez tvorby krystalů m u ni MED Temperature °C Vitrifikace Teplotní bod solidifikace Tg • PPG Ctyo (SuMnr « Pro»cUrt)» Mwhyl Inulin HyOraypropylmirtn Utlum— • Mydrayprop¥*nulin •SUChyow 20 o -40 ■100 ■120 6 t 1 12 14 16 IV, (Grtmj Untrown W»nw/Gr«m SokW) Freez|ngpo/nř Liquid phase Glass transition ^rnpe^uTe Glass phase No crystals Concentration of solution je velice důležité správně načasovat poměr koncentrace kryoprotektiv a dobu expozice, tak aby došlo k dostatečnému prosycení vzorku, ale bez poškození buněk vlastní přítomností kryoprotektiv mu ni MED Vitrifikace ^^^^ Plate 0.2mm 0.7mm - klíčem k úspěchu při dosahování "skleněného" stavu v extra- a intracelulárním kompartmentu stanovení optimální rovnováhy mezi následujícími třemi faktory: 1) rychlost ochlazování a ohřívání (2000 °C/min až 20 000 °C/min; v některých systémech dokonce 1000 °C/min-100 000 °C/min) 2) optimální viskozita rozpuštěné látky 3) objem kapky vitrifikačního roztoku mu ni MED - Dvoufázová reakce buňky v přítomnosti nevitrifikujícího roztoku CPA (nVS) a vitrifikujícího roztoku CPA (VS). Jsou zobrazeny změny v objemu buněk a molekulární změny (modré tečky molekuly vody, zelené a červené tečky buněčné makromolekuly, žluté tečky CPA). Během inkubace embryí s nVS dochází k dehydrataci buněk - voda vytéká akvaporinovými kanály (1). Po dosažení osmotické rovnováhy (A) je vstup CPA a v menší míře následuje H20 (2). To je charakterizováno malým nárůstem objemu (B) Ve VS dochází k silné dehydrataci (3), což vede k vyšší koncentraci CPA v buňce (4) a silnému snížení objemu buněk (C). Vitrification Protocols Different protocols have been proposed: A) 15% EG + 15% DMSO + 0.5M sucrose B) 15% EG + 15% PrOH + 0.5M sucrose C) 7.5% EG + 7.5% DMSO + 12% SSS D) 5.5M EG + 1M sucrose Carriers: Different types: Open Pulled Straw CryoLoop H em i-Straw Cryotop Cryoleaf Cryolock Vitri-inga Plastic-blade Straw-in-straw Vajtaetal,1998 Laneetal, 1999 Andervoost et a\, 2001 Kuwayama et al, 2005 Chian et al, 2009 Bernal et al, 2009 Almodin etal, 2010 Sugiyama etal, 2010 Kuleshova and Shaw, 2000 Isachenko et al, 2005 A) Open devices B) Closed devices Single-straw closed systems CryoTip Cryopette Kuwayama et al, 2005 Keskintepe et al, 2009 muni MED Srovnání metod tnfikace a pomalého mru Vitrifikace (Mil > 2 000 °C/min - uzavřeny systém > 10 000 °C/min - otevřeny systém_ < 10 min Zručnost embryológa Konečný objem vzorku 0.1-2 ||l Konečná koncentrace kryoprotektiv > 4 mol/l Krystalizace vzorku ne Přímý k< mý kontakt s LN2 ne - uzavřeny system ano - otevřený systém icke poškozeni nízké riziko Cytotoxicita Přežívaní vysoké riziko rozmrazených oocytú vyšší Přežíváni rozmražených embryi srovnatelné Přežívání Přežíváni ivam rozmrazených blastocyt vyšší Prežívam rozmrazených spermií srovnatelné Pomalé mrazení cca 0.3 9C/mm >3h ne nižší 200-500 ul 1.5 mol/l ano ne vysoké riziko nízké riziko nizši srovnatelné nižší f ^ Slow freezing ^ Vitrification ^ Damage due to ice formation yes no Speed of freezing 0.3°C/min. 23,000°C/min. Amount of cryoprotectant low high Cell survival low high Procedure simple complex muni MED Vitrifikace různých stádií Vytvoření standardního vitrifikačního protokolu pro všechna embryonální stádia není reálné, protože embrya se liší: • různý poměr povrch/objem • rozdílný cooling rate mezi zygoty, dělícími se embryi a blastocystami • různá citlivost na mražení mezi různými stadii Optimálním stádiem na mražení jsou blastocysty-jednotný protokol Kryokonzervace PN stádií • vitrifikace je efektivnější než pomalé mražení • kombinace vysoké hladiny kryoprotektiv a velké rychlosti zamražení • méně efektivní přístup • skoro se nepoužívá • v minulosti problémy s kultivací do stádia blastocyst !!předchází etickým problémům s časným embryem!! mu ni MED ■i FAKULTNÍ NEMOCNICE ■ BRNO Kryokonzervace časných embryí ■i FAKULTNÍ NEMOCNICE ■ BRNO • co je optimální stádium pro vitrifikaci je sporné • v minulosti často transfery druhý den a tedy i vitrifikace 2. den • při pomalém mražení často mražení druhý den • nevýhoda je že je to před aktivací embryonálního genomu - embryo nemusí být schopné se vyvíjet do stádia blastocysty Oogenesis Fertilization Cleavage Differentiation Vitrifikace blastocyst Oproti ostatním stádiím mají: 1) více buněk a snadněji kompenzují kryopoškození 2) blastomery jsou menší a snadněji do nich pronikají kryoprotektiva 3) bez spolehlivě fungujícího mražení blastocyst nemá smysl dělat prodlouženou kultivaci embryí I.1UÍI1 MED Embryo grading Embryo Lúeekly Planner DayO Egg retrieval and insemination Day 1 Fertilization check ® Day 1-3 Cleavage stage Day 2 (4 celts); Day 3(8 cells) J5. Day4 Morula stage Day5+ 1 Blastocyst stage Inner Cell Mass IICM) A Numerous and tightly packed s Several and loosely packed cells c Few ce//s Trophectoderm (W A Many tightly packed cells organised into epithelium B Several cells organised into loose epithelium C Few/ ce//s Morula Early Blastocyst • Blastocyst Expanded Blastocyst S*• ■' ' '■ y u ,\ \M - f< ■ Hatching Blastocyst üii vk'~-' '. Fully Hatched Blastocyst ■ BBSS ^2 .- Embryo grading A - many cells, form a single layer; B - few cells, form free epithelium; C - very few large cells. Důležité je vybrat kvalitní embryo na embryotransfer, všechna ostatní dobrá jsou vitrifikována. Nemrazí se: 1) embrya zastavená ve vývoji 2) embrya lytická či s vysokým podílem fragmentací 3) embrya s velice špatnou morfologií H1 *wl014AA 1 ) BI 3AA « :) BI 2 BA < f) s with expansions 2-3 Intermediate quality BB BI 3BB BI 2 BB . y Hl I ' 111 rl DIU ? I In BI 4BC i n J/ r BI3AC m ty í) " - i- • cíl ""íl TS lij " 1 f * v c I á*B-5L- • ) ) ' 1 >\~ŕi ■ ß Blastocysts are initially graded numerically, from 1 to 6 (this can be performed under a dissecting microscope): 1. Early blastocyst: the blastocoele occupies less than half the volume of the embryo. 2. Blastocyst: the blastocoele occupies half the volume of the embrvo or more. t 3. FulI blastocyst: the blastocoele completely fills the embryo, but the zona has not thinned. 4. Expanded blastocyst: the volume of the blastocoele is larger than that of the embryo, and the zona is thinning. 5. Hate h i ng blastocyst: the trophectode rm has started to herniate through the zona. 6. Hatched blastocyst: the blastocyst has completely escaped from the zona. The morphology of the I CM and trophectoderm are then assessed under an inverted microscope: ICM A. Tightly packed, many cells, B. Loosely grouped, several cells Trophectoderm A. Many cells forming a cohesive epithelium B. Few cells forming a loose epithelium Inner Cell Mass Trophectoderm < 1 6 C Very few cells C. Very few large cells muni MED Jednání s pacienty - kryo embryí - centrum která nabízí kryokonzervaci embryí si musí být vědom logistických, právních, morálních a etických problémů, které mohou nastat - oba partneři musí podepsat komplexní formuláře souhlasu s kryokonzervaci - v případě rozvodu nebo rozchodu, či smrti jednoho z nich nemohou byt embrya použita - kryokonzervované vzorky nelze skladovat po neomezenou dobu a musí být jasnou politikou kliniky, že záznamy jsou správné udržovány, s pravidelnými audity úložiště banky - všechny páry s kryokonzervovanými embryi ve skladu musí být kontaktováni každoročně, možnosti: 1. pokračujte ve skladování 2. přenosu zmrazeného embrya. 3. darujte svá embrya pro výzkumné projekty (schváleno etickou komisí) 4. darujte svá zmrazená embrya jiným neplodným párům 5. nechte embrya rozmrazit a zlikvidovat. mu ni MED Vitrifikace 5. nebo 6. den? -dlouhodobě lepší jsou výsledky s vitrifikací 5. den -den 6 starší, větší blastocel má vliv na ztrátu vody a pronikání kryoprotektiv -snazší artificiální kolaps u D5 než u D6 embryí Hatching Blastocyst Hatching Blastocyst Fully Hatched Blastocyst Artificial collapse (AC) - v letech 2003 a 2004 bylo prezentována lepší efektivita vitrifikace lidských blastocyst pokud se před vitrifikací udělá kolaps blastocyst - nejprve mechanický kolaps pomocí ostré jehly, později mnohem efektivnější kolaps pomocí laseru - opakovaně zjištěna vyšší efektivita transferů, ale i vyšší implantační a clinical pregnanci rate muni MED Embryo shrinking - přežití blastocyst a klinické těhotenství byly signifikantně vyšší u kolapsu než u kontrolní skupiny - míra implantace a míra živě narozených dětí však byly v obou skupinách podobné. - metaanalýza naznačuje, že umělé smrštění před vitrifikací blastocysty zlepšuje přežití a míru klinického těhotenství, ale ne implantaci nebo počet živě narozených dětí a) b) c) Vývoj metod vitrifikace Table 23.1 Various vitrification techniques In embryology System Direct dropping into liquid nitrogen Electron microscopic grids Open pulled straw Glass micropipettes Super-finely pulled open pulled straw Gel-loading tips Sterile stripper tip Flexipet denuding pipette Fine-diameter plastic micropipette 100-[iL pipetting tip Closed pulled straw Sealed open pulled straws Cryotip Cryoloop Nylon mesh Minimum drop size Minimum volume cooling Hemi straw system Cryotop VltMaster Solid surface vitrification Reference Landa and Tepla (72) Martino et al.(24) Vajta et al. (79) Kong et al.(166) Isachenkoet al. (167) Tominaga and Hamada (168) Kuleshova and Lopata (121) Liebermann et al. (169) Cremadesetal.(170) Hredzaketal.(171) Chenetal.(172) Lopez-Bejar and Lopez-Gatius (173) Kuwayama et al. (67) Laneet al. (87) Matsumoto et al. (93) Arav(174) Hamawaki et al. (95) Vanderzwalmen et al. (96) Kuwayama et al. (66) Aravet al. (81) Dinnyesetal. (109) Source: Reprinted from Vajta G, Nagy ZP. Are p rogrammable freezers still needed in the embryo laboratory? Review on vitrification. ReprodBkxned Online 2006; 12(6): 779-96 (175), with permission from Reproductive Healthcare Ltd. Metody - Cryoloop - Open systém - 20000C/min - 1 ul Figure 23.1 Examples for commercially available tools used as carriers for high-speed vitrification, (a) Open pu (MWtub, Landshut, Germany); (b) McGill Cryoleaf (MediCult, Jyilinge, Denmark); (c) Cryotop (Kitazato, Tokyo, Japan); (d. (Hampton Research, Aliso Viejo, CA). Bars represent 2 mm. Typy pejet a jejich cooling rate DEVICE VOLUME COOLľNG RATE CRYOLOOP >1 \il 20.000 °C/min HE MI-SATRAW >1 |il >20.000 DC/min d CRYOLEAF ^ >1 Hi 23.000 17 C ,/miii VľTRI-IXGA 1 Hi 20.000 °C/min CVM-RIKG >1 |il 10.000 cC /min VTTRISAFE >1 |il 1.300 °C/min H55 0.5 [il 2.000 °C/min 0.25 ML STRAW 25 |il 2.500 °C/min OPS 1^1 16.700 0 C/min ^ CR\ OTOP ^ 0.1 |il 23.000 0 C/min CRYOTTP lul 12.000 c C/min ^ RAPID-I ^ 0.5 |il 1.200 °C/min CRYOPETTE 1.2|il 23.700 °C/min ULTRA VIT 0.2 Ml 250.000 °C/min muni MED Metody % v -Vitrolife \ - aseptické, uzavřený systém ^ -1200 °C/min -0,5 ul - Rapid-i Effective vitrification Instant warming Consistent Speed where volume it's needed Protokol Vitrolife RapidVit™ Blast obsahuje tři přípravky pro vitrífikaci lidských embryí ve stádiu blastocysty. Přípravky jsou pufrovány MOPS, Obsahují gentamicin, který působí jako antibakteriální přípravek, a lidský sérový albumin. Vitri 1™ Blast neobsahuje žádná kryoprotektiva. Vitri 2™ Blast obsahuje kryoprotektiva etylenglykol a propandiol. Vitri 3™ Blast obsahuje kryoprotektiva etylenglykol, propandiol a ficolL Pro použití po ohřevu na teplotu +37 aC. Vitrolife <\ Vitri 1 • Blast M Bil 12 10 n* V>Mil,_i tlagn*n*m .....-.-.»>ü. i BS 8 Instant warming Easy to locate Speed where It's needed T=0 T=2hr muni MED Protokol Vitrolife Warm cleave Přípravek RapidWarm™ Cleave obsahuje čtyři roztoky pro rozmrazení embryí ve stádiu dělení v it r if i kovaných 3. den. Roztoky jsou pufrovány MOPS. Obsahují gentamícin, který působí jako antíbakteríální přípravek, a lidský sérový albumin. Warm 1 ™ Cleave obsahuje jako kryoprotektivum sacharózu. Warm 2™ Cleave obsahuje jako kryoprotektivum sacharózu. Warm 2™ Cleave obsahuje jako kryoprotektivum sacharózu. Warm 3™ Cleave neobsahuje žádná kryoprotektiva. Vitrolife <\ ■«ri2-ClemlMf,0C„!ea,e Vitri 1 Cleave^ 91069, ior^ «,.«<. m.*** 91068 10*1 • tetanmi i -Mima***? >ift««i)Ot(US«>K«B>*-iÉfi)M' nMe6*«i Warm 1" Cte^,£P<-^í;.U Rychle umlčte vitrif kovaná ůrtibrya dú přípravku Warm 1 ™ Cleavů. Nethie ambrya, aby se přůmisiila z průsloru záfiaůni najňha dnů. Ponachla v lomta stavu puccuu 1sckurJ Přenesla embrya dú přípravku Warm 2™ Cleave a ponechle je v lomta ráztoku po dubu I mi nuly. Přenesla embrya dů přípravku Warm 3™ Clůsvaapůnethle je v lomta ráztoku po dubu 2 minuly. Přeneste embrya dú přípravku Warm 4' Cleave a panechleje v lomtn ráztoku po dubu 5 minuL Nŕk-jlikiálťrrbrya propláchnete kullivatnlm mrdiůrrt v souladu < boinymi labůraiůrnimi púStupy. Metody 3min 3m i n ES Stcp3 C+240« I) £>m i n - Kitazato -Cryotop/Cryoleaf 0,1 ul -Cooling rate 23000 °C/min - Open/closed system -Složení: EG, DMSO, trehalóza, hydroxypropylceluloza Vitrification Protocol [ Oocyte ] CAfter) 4 WS? (aocm i) WS1CMZD DSC300u i) Ir n 3" 1 Protokol Kitazato Preparation for Vitrification 1. Bring BS, ES and VS to. room iemperature p5-27*C). VT601 KITAZATO VITRIFICATION SOLUTIONS 12 months shelf life KITA ATO 0 Vial 1.5 mL of BS (Basic Solution) j Vial 1.5 mL of ES (Equilibration Solution) 2 Vials 1.5 mL of VS ' (Vitrification Solution) The Repro Plate is a conic-shaped well dish, exclusively designed to follow The Cryotop Method uiith comfort. The Repro Plate has high transparency and great visibility and also offers two slots to support the Cryotop5. allowing those who wish to carry out loading specimens statically. 2. Writs necesEary inton-natlon about a pallentonthe handky'rjtriiw cap of Owtop (Sm Figur» You can alic label men. 8. ICiynlKp] Fill 9Cfc= of Coaling Rack with fresh Iquid nitrogen. [GiyDtcp SC roc cloud &yucm| Placa Aluminum Block m Cooling Rack SC 1mm Ihc beginning. Then fill with Frgsn liquid niirogjen trtil it WW5 Bie fop of Ihe Alurnwum Block (See Figure- 2-3j. 4. Remove 1he culture cJiah containing Oocyte or Embryo froiri Ifii: inculiiriuf. Chm:k tlw [qu:i|ily i if ths Otx:ylK c:r \hr. Embryo well with pasleur pipette- meter Ihe mtcrcacope (S« Figur* 2-il For Oocyte VMrifcation. lake 1he cumulus calls of. 7.....;-■ Oocyte (ŕ Crjfnpiľtí Ihc -«iJtli c:' f:<:riviíi:|| ■■« üpijirs *itli thckres-s d ;ona pelkicida and record II (Ex.1:1). I) m*p»5 WW to know rh? compltrting c.f Ihc equikbrallon after immersing n ES. IUI L U Ekvilibrace embryí 1. Nakapejte každých 300 I ES do první jamky, VS do druhé a třetí jamky destičku Repro pomocí pipety. 2. Krok 1: Přeneste Embryo do TOP centra ES z kultivační misky. Začne se spontánně zmenšovat a postupně se vrací původní velikost absorbováním roztoku ES (do 15 minut). Embryo Equilibration KITAJIATO ES 1 Recommendation 2PN . 4-cdlOf 8-coll 10- 12rr»n Morula cw Blastocyst 12-I5 Figur« 3-3|. Immediately put the lid on the Repro Plate. Embryo Equilibration 2 Aspirate the Embryo at the tip of the pasteur peette (See Figure 3-4). Put the Embryo with mnmal volume of medium to the TOP center of ES. Embryo Equilibration 3 - For 10 ■ isminutcs Set up the stop watch lh count up function). Check the time with the stop watch tor the follow^ steps, the Embryo tree-falls wrthin 30 seconds. It spontaneously begms to shnr* and then gradualy returns to its ongnal size with inWraUig ES. wheh »wicates that the Equ«*«Uk>n is complete. mm M ESP Vitrifikate Upozornění: Měly by být provedeny následující kroky od 1 do 9 mezi 60 a 90 sekundami. 1. Aspirufte oocvt (MM) / embryo z ES špičkou pipety. 2.Step 2: Přeneste oocyt (MM) / embryo do TOP centra VS druhá jamka, S.Vpichujte oocyty (Mil) / embryo pipetou a vyfoukněte je. Opakovat tento proces třikrát, změna pozice ve VS druhé jamky. 4. Přeneste oocyt (MM) / embryo do VS třetí jamky 5. Změňte polohu oocytu (Mil) / embrya ve VS třetí jamky s pipetou. 6. Vložte oocyt (Mil) / embryo do černé čáry na kryotopu. 7. Vytvořte planární kapičky. 8. Ujistěte se, zda je oocyt (MM) / embryo na kryotopu s minimum objem VS třetí jamky (méně než 0,1 1} pod mikroskopem. 9. Okamžitě přelijte kryotop do tekutého dusíku. 10. Vložte kryotop do hůlky a uložte jej do skladovací nádrže. Vitrification 5 flap I rate Hie arum* Oocyte (Emfcryo} nVSZ at 1lia tip ol tfie pasteur aipetle iBe* Figure 4-4-1. Flaw the Ooc/ls (Embry □[ by the black mark cH Crycntop sheel wiih minimal volume (leas 1han a.lpLJ ur VS2 (See Figure and 4-5b). For more than 1 Oocytes (Embryos), matte 1 droplet for each (See Figure 4-6a and =.....i-j Removal of the excess VS on the sheet After pgtliftg Q«¥t*t fjEmft«y«J On The Cryulop stat, lh« VS Htmu|d he rEirtuvftd tiy nsjiirritiiyj using pipeMn. Slepl Pul IhníJioí+píptKtríín Ihobohon Did Step 2 ipcllc rp>oi-'^ji ":■ oleí'i:. and m*í in* dop lowf. Stea i t O _ AscťnlD Tň [i-ci-;:. VS.-irc mrlitEC IhD VS Good example L —■ FIciii 4fJc- Bad example Mmc isIetk úropkí&ř Ine- Mack iurH mtVyotops-iMl. Tlw volume of YSZ15 too rrutt\ Good i'x. 11r.|- Bad example IJ oooo Vitrification Vitrification 1 After the com plot on of Equilibration, asprste the Oocyte (Embryo) m ES at the to of pasteur pipette (See Figure 4-1). Transfer the Oocyte (Embryo) to the surface center of VS1 with minimal volume of ES. Blow only the Oocyte (Embryo) out lo VS1. To avod getting the remaining ES in the pasteur pipette nto the VS1. blow out the ES to the outside of the well. Aspirate fresh VS1 and blow it out again to tho outside of the well. Aspirate fresh VS1 mto the pasteur pipette. Vitrification 2 - wwim 0.5 mnute Aspirate the Oocyte (Embryo) in VS1 with the pasteur pipette and blow it out to VS1. Quickly stir five times around the Oocyte (Embryo). Repeat tho aspirating blowing out and strung throe feme* changing the positions m VS1 (See Figure 4-2). Displace the outer sobtion of the Oocyte (Embryo) to VS1 completely until the remaining ES visually disappears. Vitrification 3 - Within0.5minute Blow out the remanng VS1 in the pasteur pipette to the outside of the well. Aspirate fresh VS2 «to the pasteur ppete. and then aspirate the Oocyte (Embryo) in VS1 at the tip of the ppetto. Transfer the Oocyte (Embryo) to VS2 with rrwwnal volume of VS1. Stir around the Oocyte (Embryo) changing positions twice with me pasteur pipette in VS2 (See Figure 4-2). This stop is completed when tho outer Oocyte (Embryo) s displaced to VS perfectly and tho flat shrinlung n cause ot dehydration is observed. Vitrification 4 Place the Cryotop under a microscope (Logo should be up) and adjust the focus on the black mark of tho Cryotop sheet (See Figure 4-3). muni MED muni MED Cry otop ® - Open System tfS^ Vitrification 6-A Plunge Ihe Cryulop direclly into liquid nitrogen. Hold the slraiv cap with Iwwwers and insert the Cry-clop from slieel cixJ in liquid rvtrogen. Then fit the Cryotop with the straw cap by hands screwing tightly In the air (See Figure 4-7). H:ik: II-m *Iihm will kHWHn trti i-hm-I Ilm HtlkJ IIh ilnwufi will InjHiH .m:l II il. T»hI fcaiiil iii^ch HirH il Ilm hI'hm «•[> I At Cryotop In» it ItgrtylottmOyctCfX (VLPO011C)) Figure 21.7 Vitrified oocytes on Cryotec in liquid nitrogen with tightly closed cover cap. Vitrification 6-B Witlirjul drecl Doritacl wilhi liquid nitrogen, insert Ihe CryolopSC rito Ihe straw cap p'e-sel at tlve Aijniinum Hoc*. Then seal Ihe straw cap (See Figure 4-81. Insan lha Gr/alcpSC In irw straw cap. e*ji iha ixau pan ol mo » am cap «in ihü S*ila. Thawing Kitazato Slozeni: •HEPES • Trehaloza • Hydroxypropylceluloza • gentamicin 1 .Warm TS vial Isealecfj with a Petri Dtah In an Incubator to 37"Ci>1 .Srnura). 2.Brirtq DS and WS 10 room temperature (2S-27°C]. a.Retrieve tr« carve utiich has Ihe specific Cryedop, quickly immerse the cans In a Cooling Rack lilted wilh Iresh liquid nitropen. Retriava 1he specific Cryoiop from the cane in Ihe liquid nitrogen. Check Ihe information about Ihe patient on the label of CrytHOp. CAUTION g Place Ihe Cooling Rack by toft *t*nw mfcri*-,::.:* hi. i. Write DS, W31 aid WS2 en the lid ot a Hepro Plate. Gently invert each vol of OS and WS twice to mix contents. Drop 3C0uL each for DS, WS1 and WS2 cfi the Repro Plate wilh rnkYO pipette. Place it an ihe rr»cro-scope stage and k it. Flei-ioweTS va| and Ihe PHri Dish Irani the incubator and pise* trie Petri Dish on the microscope stage. Gantly invert the vial oJ TS twice to rr*x r::inl(:nl!i -inri pnur tN? full cnntenls into the Petri Dish Figure 5. Adjust 1hn 1ocvg ol lh» microscope*1n ihij Pdri nich with ITS. HmM Use paster uiutlid in order to focus easiy on the carrier ol Ihe Petri Dish (See Figure 2-2J. Thawing Kitazato Cryotop® - Open System Príprava - V teplé lahvičce s TS (uzavřená) Peiiiho miskůuv inkubátoru pri 37° C (1,5 hodin). ■ Nalijte cely obsah TS do Petřino misky.-Ohřejte DSa WSna pokojovou teplotu (doparučeno 23-27° C),* VstrTkejte každých 3001DS do pivní jamky, WS do dndié a tretí jamky Repro Plate s pipetou. Upozornění: Jako manipulační nástroj používejte sterilizovanou pipetu s vhodným vnitrní průměr pro oocyty nebo embrya. Doporučene vnilřni präméryjsou: 1 SO um pro oocyty (Mil) 1 SO um pro embrya v zárodečném stadiu a 250 um pro embrya štěpen ínebo blastocysly. Rozmrazování Krok 1: C ry otopový" proužek rychle ponořte úplné do TS. Odejít to po dobu 1 minuty. Krok 2: Pipetou jemně aspirujte oocyt (Mil) / embryo umístěte jej na BOTTOM DS. Nectíte to 3 minuty. Krok 3:1. Pipirujte oocyt (Mil) y embryo pipetou a opatrn ě j ej vl ožte na BOTTO M WS d í u hé ja m k y. Nechte to 5 m i n u t. 2. P i-petou napipetujie oocyt (Mll) / embryo, jemné jej vložte vrchol WS tretí studny. Poté, co oocyt(MII) í embryoklesne na vdolní části WS třetí jamky, opakujtetento postup jeSté jednou. 3. Přeneste oocyt (Mil)/ embryo do kultivační misky obsahu-jícívhodné kultivační médi um. Inkubujte oocyt (Mil) /embryo doa 37" C inkubátor pro dokončení regenerace. Upozornení 1: Doporučuje se inku bávat oocyty {Mil) a embrya 2 hodiny, Upozornění 2: Omyjte embrya a inkubujte embryo pro zotavení v vhodná média, aby se zabránilo WS třel/studny přenesené v tele pacienta. Thawing 1 cai±iully 1 wist and remove th* stiaw cap Irem theCryůtůp in liquid niirogen ISee Fiowa 3-1). FYop it against ths ůůrYiůť úl lne Cůbliňt) Ffcack. Thawing 2 Be ready to use pasteur pipette keeping ihe Cryotop in liquid nitiůgen. Sel 143 the stup waLch (with count up ■funclwn). Check the trne wrth ihe stop walch for the |..:||.run :. : :.!|:: . Thi\ wi ntj 3 ■ For t OjicWy immerse Cryotop sheet intoTS on the microscope stags-. 11 -should be within 1 second (5*e rigij's 3-21. Find the Oocyte (Embryo) adjusting Ihe focus en Ihe black matt Cfttie Cryotop sheet. 1 minute niter immersing inloTS, gently-aspirate me Qpcyte lEmDryo) svin ihe paslaur pipnHr afl«r dnpnrning it 1mm Ihe sheet. Aspir.-iln Ihe Oocyla (brrb-^'Pl aval 1 1 does net c spenae f-oTi 1he shtxM. Also, aspiralq TS until 1hg Odcyt* (Embryo) roaches 2mm from ihe tip 01 ihe pa^lauY pipette Figure 3-3). bwtbi|. own mums wiih 11» step watch Twahing kitazato Cryotop* SC Closed System. Thawing 1 Eland lhe CJyülüüSC ürl 1ha A|uiTiiriuili B|Mk. Thawing 2 Cut the marlono point wrth Straw Cutter. P.i" Ihe culling blade ;ii Iht; black marking poinl. Turn the straw cap slowly to cut. Thawing 3 Be ready use pasteur pipatle keeping ihe Cryotopsc in liquid nitrogen. Set up the slop watch Iwrlh count up function). Check the tune with the stop watch lor Ihe following steps. Thawing 4 Insert the cu1 \ihk:p. cj' Ihe tfrnw ir;ip ink) I -<: iirim :: □etaeen the CryotopSC and the Aluminum Block. This is to lake oul the CryotopSC easier. Thawing 5 - For 1 minute Quickly immerse [he Gi-fOky jSG srieel inloTS ein Ihe riii::rc?v::cfy; r.l-.XK by translewig It linearly. 11 should be within 1 second (See Figure 3-4). Find ihe Oocyte (Emftrynl ad/JSting the focus on the olack nyirk of the Crydop shod. 1 nrniute atler Immersing into TS. gently asp rate theOocyle (Embyoi with the pasteur pipette after dispensing it from the sheel. Aspirate the Oocyte lEmbryo) even if it does not dispense 1rom the sheet. Also, aspirale TS until the Oocyte lErnbrycO reaches 2mm from thetp of the pasteur pipette (See Figure 3-5). !~ii:i..' Fii-l.i -.■ IVI L U Cryotop Embryo Vitrification Animation (voutube.com) Kitazato Vitrification Method - Kitazato IVF (kitazato-ivf.com) PART 4 Dilution Dilution Hjr J.n.vrud.'s Blow oul only 15 w tne patteur pipatte into :hs BOTTOM CBnterof DS slowly CSee Figure 4-1 si. then gantly place the Oecyle (Embryo) on the bottom el the TS layer [See Figure 4-1 b|. Leave it for 3 minute. This is for rnosll/ gradual displacumcni from TS to DS. PARTS Washing Washing 1 -ŕúr5rtn™f« 3 rTinule* later alter rririeraiiitj i-In DS, gKnn|y;isfjrnl«-1hB Oocyte itmbrvol in D5 with the paEleur pipefle. ^lao, aspirate DS until ma Qocyls (f mbrynl rnnchns ?rnm rnjm torn lip of the jwslotr pi»»t» |See Figure 5-1). Blew out only DS in l"e paite_,r p petLe into the BOTTOM center o\ WS1 slowly (See- Figure 5-£a). than genrlly place ffie Ootyta (Embryo) on Hie txfltuiri lhere (See Hcjure Leave il far 5 minutes. This, k alss far Tiostly gradual cis-placement f-om D51c W51. Washing 2 -Fori minute 5 niinuies later, ailer rnniersing niti WS1, aspirate the-Oocyle iFjnbryo) wrtfi ninirral volume oJ WSl v>ith p^&leur pHpatteHSee riuurii =-:"i| ;irirl Iriinsler il In tin-: TOP cnnler «1 WS2. APlcr Inn Oocyte (Erflbryotfrae-faJIs to the bottom on 1W52. co the-seme w< arinin in WS3 ÍSflo Figure 5^4). Oocyte f Eiľťyo Uľ-lí-Iu: EiiiLiil- ÍJILfl Washing 3 "r;L-í;l(!r In: 0:i:yl:: Iľniliryc;. I:i ;i cii|l..r<: c <:h <:.....;iininn :l.....prirnr:rial:i:i: tin- waiiN / 1 M WS w fJ.6 M WS '■ I 1mL ImL j \ 1 min / 3 nrän / f WHI3 Wetl4\ KS 1 1mL W ImL 1 LEGENDA: 1M WS = 1 M Sucrose Warming Solution Ú.SM WS = 0.5 M Sucrose Warming Solution MS = MOPS Solution W = prenos embrya do další jamky > Transfer to preferred culture media for recovery Manuálně náročná procedura - pozor na warming SV1% SV2% CP1% CP2% 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Operator Figure 24.8 Survival and clinical outcomes according to the operator. Abbreviations: SV1% and CP1%, survival and clinical pregnancy rates for the person doing the vitrification procedure. SV2% and CP2%, survival and clinical pregnancy rates for the person doing the warming procedure. Kry oe m b ryot r a n sf e r - elective ET - pouze jedno embryo transferováno všechna další dobrá jsou vitrifikována - po rozmražení je vhodné přesvědčit se zda embryo přežilo mražení -viditelná reexpanze je důkazem viability po mražení Morfologické změny zmražených blastocyst po rozmrazení a post-rozmrazené kultuře. (A) zmrazená blastocysta ihned po rozmrazení (B) blastocysta se začíná zmenšovat v 0,5 mol/l sacharózy (C) blastocysta se po další dehydrataci po dobu 10 minut pevně zmenšila v 0,2 mol/l sacharózy (D) blastocysta se začíná znovu expandovat po 1 hodině kultivace in vitro (E) blastocysta s >50% reexpanzí blastokély po 2 hodinách in vitro kultivace před ET Původní zvětšení x400. Open x closed system otevřený systém je efektivnější - u vitrifikace oocytů významné hrozí kontaminace vzorku patogeny v dusíku uzavřený systém nulové riziko kontaminace horší manipulace horší výsledky po rozmražení vitrification: Direct plunging in contaminated IN O Oocyte/embfyo 0 mierorganiim Adhesion of frozen mkrorqanrsms to oocyte/embryo and on carrier's Sillf.l, (< WARMING: Immersion of contaminated earner in ivaimmg so^ition at 3?°C Open Pulled Stra Cryoloqp Hami-Strav Cryotop Cryoleaf Cryolock Vitri-inga Plastic-blai Activation of warmed microrganrsms and contamination of culture medium vitrification: Direct plunging in contaminated LN O Oocyte/embryo A microrganism "Straw in Straw" High Security Vitrification Adhesion of frozen mkrorganisms to sealed external straw WARMING: Immersion of clean inner carrier in warming solution at 37°C No contamination of culture medium Open-closed system /.j/'/r r» / A Review of the Main Open and Closed Vitrification Devices PgHn Volume (ul) Cooling rate rC/min) Warming rate (°C/min) < 1 V"l<»|' Mai strip <0.1 23,000 >25,000 1 U mi sli4v> Small gutter 63 >2(M*K) >25,000 < l."l>''"|. Nyl(»n loop <0.1 >20,0(MI >25.000 • i\<4«.il Mat strip 1 23,000 >2S,000 • lyolotk I'lat strip 1 >20.000 >25,000 \llll lll|*4 1 lole 1 20.000 >25.000 i ')•• ii j'lilli il \ii.w Mini straw 1 16,700 <20.000 1 i i In • 1 look >1 10,000 >2S,000 i /.• . •/ •/•»i m ' ml \liaw Mi aw 25-100 <2500 -1300 N HllMlt Small gutter 03 1300 >25.000 II '.V Sm.ill miller is 2000 >25.000 1 loU 0.05 1200 >25,000 •lip Mini sImw 1 12.000 <20,000 .....1" ••. Mini *luw I 23,700 <20,000 1 ll. 4 .1 • uuiit |d i mi« !•* ipill.m 0.5 I'npublishcd Unpublished Riziko kontaminace - otevřený systém VITRIFICATION: Direct plunging m contaminated LN O Oocyte/embryo £ micforgariism Adhesion of frozen microrganrsms to oocyte/embryo and on carrier's surface WARMING: Immersion of contaminated carrier in warming solution at 37°C Open Pulled Cryoloop Head-Straw Cry o top Cryoleaf Cryolock Vi tri-Inga Plastic-bla Straw Activation of warmed microrganisms and contamination of culture medium muni MED Riziko kontaminace - uzavřený systém VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN O Oocyte/embryo £ microrganism Adhesion of frozen microrganisms to sealed external straw WARMING: Immersion of clean inner carrier in warming solution at 37°C "Strav in Straw" High Security Vi trification Culture i nv