Kryokonzervace oocytů doc. Ing. Michal Ješeta, Ph.D. Gynekologicko-porodnická klinika, LF MU a FN Brno Možnosti kryokonzervace biologického materiálu ovarium oocyt MIIembryaspermie oocyt GV velikost buněk počet buněk relativně snadná kryokonzervace velice obtížná kryokonzervace Vývoj vitrifikace oocytů Etický problém kryokonzervace embryí ̶ v roce 1996 papež Jan Pavel II. "apeloval na svědomí světových vědeckých autorit a zejména na lékaře, aby byla zastavena produkce lidských embryí, přičemž je třeba vzít v úvahu, že se zdá, že neexistuje žádné morálně přípustné řešení týkající se lidského osudu tisíců a tisíců 'zmražených' embryí, která jsou a zůstanou předmětem základních práv, a proto by měla být chráněna zákonem jako lidské osoby Název předmětu (kód předmětu) (např. První pomoc - cvičení (VLPO011c)) ̶ oocyty nejsou etický problém, ale embrya…. ̶ žaloba párů na kliniku IVF pro neúmyslné zničení zamražených embryí v roce 2022, byla neúspěšná ale: ̶ nejvyšší soud v Alabamě však nyní (únor 2024) jeho rozhodnutí v poměru osm hlasů k jednomu zvrátil s tím, že se „zákon o neúmyslném usmrcení nezletilého dítěte se vztahuje na všechny nenarozené děti bez ohledu na jejich umístění“ ̶ Odůvodnění: …chceme aby bylo více dětí… Nejvyšší soud Alabama 2024 Název předmětu (kód předmětu) (např. První pomoc - cvičení (VLPO011c)) ̶ vrchní soudce Tom Parker, 02/2024 ̶ alabamské ústava:…každý člověk byl stvořen k obrazu Božímu, což znamená, že každý život má nevyčíslitelnou hodnotu, kterou „nelze protiprávně zničit, aniž bychom na sebe přivolali hněv svatého Boha“. „Článek 36.06 uznává, že to o nenarozeném lidském životě platí neméně než o všech ostatních lidských životech: „všechny lidské bytosti nesou Boží obraz ještě před narozením a jejich životy nemohou být zničeny, aniž by byla vymazána jeho sláva“ Kryokonzervace oocytů v klinické praxi ̶ kryokonzervace gamet byla původně zavedena za účelem udržení šance na početí v případě onkologické léčby (zachování plodnosti) a poté rozšířena na indikace, jako je Turnerův syndrom, autoimunitní onemocnění, endometrióza nebo zachování plodnosti ze společenských důvodů Mražení oocytů • po řadu let od prvně publikované práce (1986) nebyla kryokonzervace oocytů příliš používanou metodou kvůli nízkému procentu přežívání, špatné fertilizaci a špatné kvalitě embryí • technika vyšla z kryokonzervačních protokolů užívaných pro embrya • bylo nutno provést řadu experimentů, které se zabývaly nejrůznějšími modifikacemi těchto laboratorních postupů, aby vedly ke spolehlivému použití pro oocyty Obtížné mražení Vitrifikace oocytů • velký objem a malý povrch – pomalé pronikání kryoprotektiva • poškození periferních oblastí oocytů • specifické organely – dělící vřeténko, CGs, ZP • vysoký obsah vody • MII jsou citlivější než GV oocyty (poškození dělícího vřeténka) (Boiso et al., 2002) – vznik aneuploidií se zvyšuje s věkem ženy in vitro zrání není tak efektivní jako zrání in vivo Vitrifikace • během vitrifikace jsou buňky vystaveny velkým změnám osmolarity • se zvyšující se osmolaritou, nastává hypertonický tlak na buňky, který způsobí jejich deformaci (5600 mOsm) • při rozmražení je nutné buňky dát nejprve do prostředí s vyšším osmotickým tlakem a postupně tlak snižovat na izotonické prostředí Mrazení oocytů vs embryí Mrazení oocytů vs embryí optimální čas pro embrya Mrazení oocytů vs embryí optimální čas pro oocyty • pravděpodobné příčiny nízké úspěšnosti se nacházely na více úrovních • zmrazování/rozmrazování indukuje změny zony pellucidy, které poškodí mechanismus napojení spermií a/nebo jejich penetraci • narušení funkce kortikálních granul může vést k polyspermii • oocyt v metafázi II je extrémně citlivý vzhledem k jeho velikosti, obsahu vody a uspořádání chromozomů • poškození cytoskeletu vede k následné chaotické organizaci organel Mražení oocytů Mrazení oocytů IVM člověk 36-38h • poškození mikrotubulů dělícího vřeténka v metafázi II vlivem tvorby ledu může vést k chromozomální aneuploidii • dalším abnormalitám karyotypu a zástavě vývoje embryí • oocyty ve stádiu GV jsou méně diferencované než v MII (neorganizované dělící vřeténko a dekondenzovaný chromatin) čímž jsou méně náchylné k poškození • po kryokonzervaci a rozmrazení je ovšem úskalí v in vitro maturaci těchto oocytů Fertilizace po mrazení oocytů • oocyty by měly být mrazeny nejdříve 5 hodin po odběru. V tomto období se odstraní hyaluronidázou kumulární buňky. • odstranění buněk by mělo usnadnit průnik kryoprotektiva. V současné době se upřednostňuje mrazení bez kumulárních buněk. Důležitý je způsob oplozování oocytů po rozmrazení: • změny v zona pellucida, poškození funkce kortikálních granul a částečná disrupce membrán, která způsobila blok splynutí a penetrace spermií vedly k nízkému procentu oplození při klasickém IVF - tyto překážky se podařilo úspěšně obejít použitím ICSI Indikace k mrazení oocytů V současné době je kryokonzervace oocytů využívána v následujících případech: 1. Možnost uchování oocytů pro pacientky s rizikem předčasného ovariálního selhání (endometrióza – iatrogenní oškození, operace, autoimunitní – tyreotitida) 2. Skladování zmrazených darovaných oocytů v programu dárcovství (odbourá nutnost synchronizace cyklů dárkyně a příjemkyně) 3. Řešení v případě neočekávané absence partnerových spermií v den odběru oocytů (překážka zdravotní, dopravní, pracovní, momentální psychické rozpoložení). Indikace k mrazení oocytů 4. Pomoc pro ženy s onkologickým onemocněním u kterých nemohou být zamrazena embrya - nemají vhodného partnera a odmítají dárcovské sperma. 5. Možnosti skladování oocytů se nově jeví jako příležitost pro ženy, které neplánují bezprostředně těhotenství a chtěly by si uschovat „mladé oocyty“ pro vlastní použití v budoucnu – social freezing. 6. Kryokonzervace oocytů minimalizuje etické a právní komplikace spojené se skladováním embryí (v některých zemích bylo mrazení embryí omezeno) 7. Autologní zmrazení vajíček s poolingem lze provést i u pacientů se špatnou odpovědí na léčbu s neobstrukční azoospermií. U těchto pacientek může být provedeno několik cyklů odběru oocytů následovaných zmrazením oocytů. To může být následováno chirurgickým odběrem spermií varlat později, když je k dispozici dostatečný počet (~10–12) zralých oocytů pro inseminaci. To může zabránit vícenásobným operacím varlat u mužského partnera. Vitrolife vitrification Vitrolife vitrification Vitrolife vitrification Vitrolife warming Vitrolife Vitrolife Kitazato Cryotop Oocyte Vitrification Animation - YouTube Kitazato Vitrification Method - Kitazato IVF (kitazato-ivf.com) Změny tvaru oocytu před vitrifikací během mražení během rozmražení po rozmražení Warming: vit média ̶ DMSO je příliš toxické na to aby bylo použito při 37C lipidy zona pellucida dělící vřeténko Poškození oocytů během mrazení mitochondriemikrofilamenta Fyziologické aspekty vitrifikace oocytů Dělící vřeténko - citlivé na změny teploty, bylo zjištěno, že zmizí během rozmražení po slow freezingu a později během 3 h znovu vzniká - regenerace vřeténka nastává během několika minut při 37˚C, už od 33 ˚C se začíná vřeténko rozpadat - MII myších oocytů: spindle se rozpadá krátce po rozmražení a následně znovu vzniká během 1 h po rozmražení - přestože se během vitrifikace naruší integrita dělícího vřeténka, tak po rozmražení po obnově buněčné homeostázy se změny opraví - stavbu dělícího vřeténka poškozují i kryoprotektiva - platí že nebyly zjištěny chromozomální misegregace po vitrifikaci, vývojové malformace či defekty Poškození organel oocytů – mitochondrie ̶ kryokonzervace způsobuje mitochondriální disfunkci ̶ rapidní průnik kryoprotektiv do oocytu může způsobit nevratné změny organel včetně mitochondrií ̶ kryoprotektiva (především s DMSO) spouští uvolňování Ca z endoplazmatického retikula a způsobuje abnormálně zvýšené hladiny mitochondriání Ca ̶ míra poškození mitochondrií určuje zda oocyt zemře nebo přežije ̶ poškození mitochondrií může vést ke změně Ca a signalizace ROS při oplodnění a ohrožení vývoje Fyziologické aspekty vitrifikace oocytů Vápníková kaskáda a zona hardening • oscilace vápníků jsou jiné u nemražených a mražených oocytů • uvolňování Ca z ER • vitrifikovaných i slow-freeze jsou nižší frekvence a delší doba trvání • bylo zjištěno že nastává předčasný zona hardening (způsoben pravděpodobně kryoprotektivy) • DMSO samotný u myši způsobuje zona hardening • vitrifikované oocyty mají odolnější ZP vůči chymotrypsinu • u potkanů bylo zjištěno že DMSO nebo EG způsobuje vylití kortikálních granulí Poškození organel oocytů – zona pellucida ̶ trilaminární vrstva glykoproteinů ̶ kryokonzervace někdy způsobí ZP hardening způsobený předčasným vylitím kortikálních granul do perivitelinního prostoru ̶ přidání proteinů do kryokonzervačních médií snižuje efekt zona hardening Fyziologické aspekty vitrifikace oocytů Genová exprese • koncentrace kryoprotektiv a jejich složení ovlivňuje genovou expresi oocytů • byly zjištěny i rozdíly mezi typy kryoprezervace (slow freezing snižuje geny chromozomové struktury a regulace buněčného cyklu, vitrifikace snížila expresi regulátorů ubikvitinace) • epigenetické změny nalezené v rozmražených oocytech by mohly být vysvětlením downregulace exprese genů (u zvířat i lidí) • ovlivnění epigenetických mechanismů regulace buněčného cyklu a zásah do regulace apoptózy, u lidí byly nalezeny v procesu ubikvitinace • narušení regulace ubikvitinace může ovlivnit obsah proteinů v oocytech a potenciálně vývojové schopnosti oocytů Exprese genů oocyty ̶ oocyty podrobené buď vitrifikaci nebo pomalému zmrazení, vykazují transkriptomické změny, protože obě metody generují modifikace v profilu genové exprese lidských oocytů MII (downregulaci několika genů souvisejících s vývojem embrya, energetickými drahami, integritou DNA a buněčným cyklem), tyto změny jsou výraznější u pomalého zmrazení ̶ vitrifikace může ovlivnit imprinting esenciálních genů, jako jsou GTL2 a PEG3 a snižuje expresi PTEN v oocytu ̶ sekvenování jednobuněčné RNA ukázalo, že postup vitrifikace lidských oocytů snížil genovou expresi ve srovnání s čerstvými oocyty Epigenetika oocyty ̶ pomalé zmrazování zvyšuje trimethylaci histonu H3 na lysinu 27 (H3K27me3) a snižuje trimethylaci histonu H3 na lysinu 4 (H3K4me3), což by mohlo narušit vývoj myšího embrya ̶ myší oocyty podrobené vitrifikaci vykazují zvýšené hladiny demetylace histonu H3 v lysinu 9 (H3K9me2) a zvýšení acetylace histonu 3 na lysinu 5 (H3K5ac) ̶ bovinní blastocysty z vitrifikovaných oocytů vykazují sníženou úroveň metylace genomu ̶ prasečí oocyty podrobené vitrifikaci vykazují hyperacetylaci histonu 4 dvě hodiny po rozmrazení, zvýšení metylace histonu 3 ̶ většina epigenetických změn byla pozorována u vitrifikace nezralých oocytů (stadium GV) následované krokem zrání in vitro, o kterém je známo, že snižuje následný vývoj embryí Vápník ̶ vitrifikované/zahřáté oocyty vykazující změny amplitud a frekvencí Ca ve srovnání s čerstvými oocyty ̶ podporují aktivační kompetenci těchto oocytů, přičemž míra oplodnění je srovnatelná ̶ kryokonzervace spermií má také vliv na obsah PLCz Fyziologické aspekty vitrifikace oocytů Metabolismus • u bovinních embryí zjištěn výrazně pomalejší metabolismus po kryo • slow freezing má výrazně horší dopad na metabolismus než vitrifikace, což je pravděpodobně dáno poškozením mitochondrií • během vitrifikace dochází k poškození plazmatické membrány – kvantifikace laktát dehydrogenázy (LDH - márkr neporušenosti plazmatické membrány) • bylo zjištěno, že po slow freezingu byl staticky zvýšený obsah LDH na rozdíl od vitrifikace • embrya po vitrifikaci lze znova mrazit u myší takto embrya přežila 4 cykly a vyvíjela se na 31,5 % (nemražená se vyvíjela na 51,7 %) na rozdíl od slow freezingu, kdy ambrya nepřežila 3 cykly Poškození oocytů vliv CPA ̶ použití1,2-propandiolu v pomalém zmrazování vyvolává změny v profilu exprese proteinů oocytů ̶ expozice oocytů hlodavců tomuto činidlu zvyšuje intracelulární kalcium, ROS, zona pellucida a snižuje přežití oocytů ̶ mražení způsobuje pokles kortikálních granulí, zvýšenou vakuolizaci, změny mitochondrií ̶ pomalé zmrazování může vyvolat vyšší a trvalejší intracelulární elevaci Ca2+ ve srovnání s kontrolními a vitrifikovanými lidskými oocyty, což naznačuje poškození Ca2+ kaskády Open vs closed system ̶ obavy z otevřené vitrifikace kvůli riziku křížové kontaminace a přenosu chorob kapalným dusíkem ̶ uzavřený systém může mít za následek méně účinné zmrazení oocytů kvůli snížené rychlosti chlazení (23 000 C/min vs 1000 C/min) ̶ lepší zachování ultrastruktury oocytů v otevřeném systému ̶ prospektivní studie oocytů sourozeneckých dárkyň zmrazených oběma technikami - kromě míry přežití (82,9 % vs. 91,0 %) nebyly zjištěny žádné statisticky významné rozdíly v míře klinického těhotenství a počtu živě narozených dětí mezi closed a open ̶ roce 2018 byla provedena metaanalýza a zjistila srovnatelné kryopřežití, klinické těhotenství a míru živě narozených dětí Přežívání oocytů po vitrifikaci Klinické těhotenství po vitrifikaci Perinatologická data – FET vs KET Recentní pokrok v kryo oocytů 1. nová technologie využívá AI pro predikci oplodnění a počtu živě narozených dětí ze zmrazených oocytů - třídění oocytů se provádí ze snímků zralých oocytů porovnaných databází dříve kryokonzervovaných vajíček dávajících blastocystu 2. AI selekce může zlepšit predikci potenciálu vývoje embryí a výsledku těhotenství cyklů ICSI pomocí zmrazených a rozmražených oocytů 3. automatizovaná vitrifikace by mohla zlepšit výsledky mražení oocytů 4. hodnocení kvality oocytů před kryokonzervací lze provést vizualizací vřetének v oocytech metafáze II nebo měřením velikosti vřeténka pomocí polarizačního mikroskopu (polskopu) 5. biopsie polárních tělísek před kryokonzervací oocytů může být také použita pro predikci euploidních embryí a budoucích výsledků těhotenství. Oocyty s euploidním prvním polárním tělískem mají větší šanci na vznik blastocysty Onkologické pacientky a vitrifikace oocytů ̶ cca 10 % žen reprodukčního věku má malignity ̶ s rozvojem terapie malignit se zvýšila poptávka po efektivní kryokonzervaci oocytů ̶ většina chemoterapií je gonadotoxická, radioterapie také poškozuje ovária ̶ konvenční ovariální stimulace předsatvuje zpoždění o 2-3 týdny ̶ proto vhodné udělat random start ovarian stimulaci a využít folikulární vlny ̶ ovariální stimulace může být zahájena náhodně v kterýkoli den menstruačního cyklu, aniž by došlo ke snížení výtěžnosti oocytů a aniž by byla ohrožena naléhavost a bezpečnost léčby rakoviny. Onkologické pacientky a vitrifikace oocytů ̶ další možností je duální stimulace ̶ možnost je i odběr nezralých oocytů (špatná efektivita IVM) ̶ ženám s genovou mutací rakoviny prsu (BRCA1/2), které plánují profylaktickou ooforektomii k prevenci rakoviny vaječníků, může být nabídnuta kryokonzervace oocytů ̶ ženy s rizikem ovariální insuficience v důsledku genetických stavů, jako je premutace fragilního X, Turnerův syndrom a delece chromozomu X, jsou vhodnými kandidátkami na zmrazení vajíček před následným selháním vaječníků Social freezing • Zaměstnanecký benefit velkých korporací (Apple, Facebook) hrazení nákladů do 20 000 USD (10 000 mražení + 1000 USD/rok skladování) významný především věk ženy – průměr 30 let, optimální do 26 let (u žen nad 40 nemá smysl) 2nd International Symposium on Social Egg Freezing Barcelona 2015 Izrael : ženám mezi 30 - 41 lety, pokud se bojí poklesu plodnosti, umožněno podstoupit čtyři odběrové cykly, nebo odběr dvaceti oocytů. Takto vzniklá embrya pak mohou být transferována ženě až do věku 54 let Social freezing • veřejný průzkum prezentovaný na ESHRE 2014, • Lallemant et al.2013, Complete Fertility Centre of Princess Anne Hospital, Southampton, • 973 žen průměrný věk 31 let • září 2012-září 2013 • 89,1% žen souhlasí s mražením ze sociálních důvodů • pouze 19 % vážně uvažuje o zmražení vlastních oocytů • osobní kariéra nebyla tak významný faktor jako věk a absence partnera u žen do 35 let Ve Velké Británii v roce 2012 vzniklo asi 580 embryí z vitrifikovaných oocytů. Tyto embrya byla transferována ve 160 cyklech – do konce roku 2012 se narodilo 20 dětí. Počet zamražených oocytů ̶ zásadním faktorem ovlivňujícím úspěšnost social freezingu je počet zralých (metafáze 2) zmražených oocytů ̶ zmrazení příliš malého počtu oocytů je málo efektivní ̶ zmrazení příliš velkého množství - zbytečné výdaje, nepříznivé účinky na zdraví, nároky na skladovací prostory a plýtvání oocyty (pokud jsou nevyužity) ̶ více než 8 oocytů by mělo být zmrazeno, aby se zlepšila budoucí míra těhotenství (Rienzi et al. 2012) ̶ Doyle a kol. (2016) doporučuje kryokonzervovat 15–20 zralých oocytů u žen ve věku <38 let (70–80% šance na alespoň jedno živě narozené dítě) a 25–30 zralých oocytů ve věku nad 38 let (65–75% šance na alespoň jedno živě narozené dítě). ̶ pacientky by měly mít přibližně 20 zralých oocytů pro reálnou šanci na porod živého dítěte (ESHRE) Ideální věk pro mražení vajíček ̶ nejkritičtějším faktorem je věk při zmrazení ̶ zmrazení vajíček v mladším věku může maximalizovat množství a kvalitu oocytů ale je méně pravděpodobné, že je pacientka v budoucnu využije ̶ mrazení v pokročilém věku vyžaduje větší počet cyklů odběru oocytů, čímž se zvyšuje fyzická, psychická i finanční zátěž pacientky, často vede ke zmrazení zvýšeného počtu méně kvalitních oocytů ̶ měla by existovat rovnováha mezi požadovanými přínosy a nákladovou efektivitou (?) ̶ míra živě narozených dětí ve věku <35 let byla významně vyšší než ve 35 letech (23,8 % vs. 12,0 %) u žen podstupující plánovanou OC ̶ 30-35 let je rozumnou věkovou skupinou pro mražení oocytů (mladší - u žen se sníženou ovariální rezervou nebo s předčasnou ovariální insuficiencí) ? ̶ nejčastější věk žen používajících rozmražená darovaná vajíčka je 43-45 let (UK) ̶ IVF zmrazených darovaných vajíček mají významně vyšší úspěšnost než u pacientek používajících vlastní vajíčka, a LBR je 30 % na léčebný cyklus, u vlastních vajíček pacientky je to 18 % Název předmětu (kód předmětu) (např. První pomoc - cvičení (VLPO011c)) Banka vajíček ̶ v programech dárcovských oocytů pro ženy s nízkou ovariální rezervou neúspěšným oplodněním IVF a ženy po menopauze ̶ zjednodušuje logistiku cyklu ART díky minimální koordinaci, protože není nutná synchronizace mezi menstruačním cyklem příjemkyně a dárkyně ̶ karanténa oocytů - čas pro screening infekčních onemocnění ̶ snižuje náklady na cyklus darování oocytů díky efektivnímu přidělování oocytů mnoha příjemkyním ze skupiny dárkyň a zkracuje dobu do otěhotnění ̶ dárcovské oocyty lze snadno přepravovat z jednoho centra do druhého, což zjednodušuje postup IVF léčby ̶ prospektivní studii, která byla provedena za účelem porovnání výsledků cyklů čerstvých a vitrifikovaných dárcovských oocytů, nebyl nalezen signifikantní rozdíl v míře oplodnění (80,7 % vs. 78,2 %) a míře klinického těhotenství (40,8 % vs. 33,3 %) mezi fresh a cryo oocyty Lékařská fakulta Masarykovy univerzity 2021 Děkuji Vám za pozornost !