MUNI MED Kryokonzervace spermií a testikulární tkáně doc. Ing. Michal Ješeta, Ph.D. Gynekologicko-porodnická klinika, LF MU a FN Brno ■I FAKULTNÍ NEMOCNICE v w m r I BRNO Mrazeni spermii -od té doby, co byla úspěšně představena technika in vitro fertilizace, se ukázalo vhodné používat kryo p rezervová n é sperma -u dárců výhradně mražení - pro příjemkyni je tak zaručena minimalizace rizik přenosu infekcí a virových nákaz jako je žloutenka typu B nebo C Během let byly rozvinuty rozmanité metody pro kryoprezervaci spermatu: kontrolované pomalorychlostní mražení • mrazení v suchém ledu • mrazení v páře tekutého dusíku • vitrifikace celý proces kryoprezervace spermatu se spoléhá na efektivní metody ředění spermatu kryoprotektivy, vlastní mrazící proceduru a bezpečné uskladnění kryoprezervovaného materiálu každý krok závisí na přesném použití specifického vybavení a materiálu dle manuálu PNI výrobce MED Mražení spermií - indikace FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO 1. před léčbou maligních onemocnění (chemoterapie, rádioterapie) 2. pro skladování spermií dárce 3. před vasektomií či chirurgickou léčbou neplodnosti 4. u azoospermických pacientů, kdy byly získány spermie po MESA/TESE 5. po vibrostimulaci při poruše ejakulace (invalidé po poranění páteře) 6. před léčbou IVF, kdy se nemůže pán dostavit v den OPU nebo má problémy s odběrem na klinice - z logistických důvodů je potřeba provést odběr spermií dříve než v den odběru oocytů 7. pokud z důvodu poruchy kvality spermatu či rizika selhání odběru je indikována preventivní kryokonzervace 8. u mužů s progresivním zhoršováním kvality spermatu, které je způsobeno onemocněním spojeným s rizikem následného vzniku neplodnosti (Klinefertův syndrom) 9. sociál freezing (u mužů pracujících v rizikovém prostředí, kde jsou toxické látky, y ||| J které mohou ovlivnit spermatogenezi) MED Russian State to Fund Sperm Freezing for Mobilized Soldiers ajrvi The Moscow Times C FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO HOME > MILITARY & DEFENSE A fertility clinic is offering Ukrainian soldiers free sperm freezing in case they are killed or suffer severe injuries while fighting Joshua Zitser Mar 13.2023.6:40 PM SEČ Advertisement IDF will offer soldiers the option of 'harvesting' their sperm in case of death This was decided by the Knesset Health Committee on Monday in preparation of th law for using the sperm of a deceased person for procreation. ISRAEL, MIDDLE EAST, PALESTINE, VIDEOS & PHOTO STORIES Israel freezing sperm of soldiers killed in Gaza Between 7 October to 15 November Israel has retrieved the sperm of 39 soldiers killed io its war on Gaza. Posthumous sperm retrieval is a controversial issue and a number of countries ban the practice. Init recent event in Israel have seen the Health Ministry ease rules to make it quicker to carry out. Podmínky uchovávání - podmínkou dlouhodobého uschování vzorků v tekutém dusíku je vyšetření infekcí přenosných krví a pohlavním stykem (hepatitídy B a C, HIV, syfilis...) v době odběru spermií a uložení séra k případným dalším vyšetřením - dokud není prokázána negativita těchto infekcí, musí být vzorky skladovány v karanténě odděleně od vyšetřených vzorků - v případě pozitivního výsledku některého z testů musí být vzorky uloženy v nádobě určené pro infekční vzorky (samostatné nádoby - hep B, hep C, HIV...) i.1uíi1 MED Slow-freezing (SF) - optimální počáteční rychlost ochlazení vzorku z pokojové teploty na 5 °C je 0,5-1 °C/min - vzorek se poté zmrazí z 5 °C na -80 °C rychlostí 1-10 °C/min, následně se ponoří do kapalného dusíku při teplotě -196 °C - programovatelné zmrazovače, které během 60 min vzorek zamrazí - konvenční pomalé zmrazování, někdy způsobuje rozsáhlé chemicko-fyzikální poškození spermií, pravděpodobně kvůli ledovým krystalům Vitrifikace spermií - velký objem kapaliny - špatné skokové zamrazení - riziko kontaminace, otevřený systém - práce s malými objemy 20ul (pro cooling rate 2000-10000 °C/min) MU NI MED Rapid-freezing (RF) Nitrogen Vapor Liquid Nitrogen nejprve se smíchá po kapkách se stejným objemem kryoprotektiva za studena; směs se naplní do slámek (0,25 ml) a nechá se 4 min inkubovat při 10 °C slámky se pak umístí na 15 minut do vzdálenosti 1-3 cm nad hladinu kapalného dusíku (páry kapalného dusíku -80 °C) po této fázi jsou slámky ponořeny do kapalného dusíku během chlazení je vhodnější umístit slámky do vodorovné polohy, aby se minimalizoval tepelný rozdíl mezi oběma konci oproti SF lepší motilita a přežití spermií, stejná morfologie a DNA integrita Kryoprotektiva existují 4 známá kryoprotektiva pro spermie: glycerol, ethylenglykol, DMSO a 1,2-propandiol - snižují bod tuhnutí, snižují množství solí a látek přítomných v kapalné fázi vzorku a snižují tvorbu ledu ve spermiích - glycerol je permeabilní kryoprotektivum, které působí na membrány, propustnost a stabilitu lipidové dvojvrstvy, asociaci povrchových proteinů a buněčný metabolismus - dále so používá ještě DMSO (škodlivé účinky při vyšších teplotách) - 1,2-propandiol a ethylenglykol se pro kryo spermií používají zřídka MED Kryoprotektiva - v současných postupech mrazení spermií se používají pouze 2 typy zřeďovacích medií: - a) žloutkový citrát v glycerolu - b) modifkované Tyrodovo medium obsahující glycerol a sacharozu Preferovány jsou preparáty založené především na Tyrodově mediu + přidávají se glycin cholesterol a další látky Kryoprotektivní činidla jsou obvykle přidávána kejakulátu při pokojové teplotě, pomalu a při konstantním vířením směsi. - to se provádí z toho důvodu, aby se zabránilo potencionálnímu poškození spermií při změně jeho objemu nebo vlivem samotného kryoprotektiva - směs se nechá vířit 10 minut, čímž se získá přiměřený čas pro pronikající kryoprotektiva ke vstupu do buněk a pro dokončení změn v objemu spermi MED Kryokonzervace spermií kryokonzervace v původním ejakulátu nebo po promytí po promytí větší reprodukovatelnost a odstranění balastních látek nejprve nechat ejakulát zkapalnit po smíchání s kryoprotektivy, rozplníme do pejet a 500 ul a zatavíme vhodné v zatavených pejetách umožňující těsné uzavření kryotuby se šroubovacím uzávěrem - nutné opatřit zatavitelným obalem SpermFreeze Solution™ Sperm Freeze - mražení Couwg hrf-w ******* SpermFfeez< SocfmFre«( Solution'' I Solution"' .1- Ijt Sperm Freezt Sperm Freezi Solution'" Solution"' I Vitrolifc<7 ^gg;; Sjjg£ ggsr_ -ekvilibrace při RT, 2h 3. Leave iri room temperature í 10 rTiIrl 8«inflou« jfeCUJJfcKiC'.- Wmou,, Freezing fi O O C SpErmFreeze" ■ , ^ I*! ^ Solution 1, Assess the semen sample Ensure that both liquified semen and SpermFreeze Solution are et Measure the total volume of semen and carry out semen analysis as required!. 2. Add SpermFreeze Solution Dilute with equal volume of semen and SpermFreeze Solution. Add SpermFreeze Solution slowly and dropwise to the semen and then carefully tilt after each crop added. Close the lid tightly and turn the tube upside down 20 times-, being careful nut to create bubbles. 4. Load vials Mark, c ryovial 5- with patient ID and load the semen mixture into cryuvfals. Dc net fill cryovials completely tD allow far expansion. 5, Free-zing Place the cryovials upright on -a 1-3 cm Styrufoam board in a liquid nitrogen bath. Leave for 6. Store in Nifl) Transfer the cryovials quickly into the liquid nitrogen and store at I -íaa-c 1-3 CPU Optional, this step can be performed using a slew-freeze machine programmed for sperm freezing.* MUNI MED CryoSperm f 10670010» «mi Freezint Klium Pokyny pre poujiti Zamraiůvůnr: 1. FredahNvBha p f ípravek CryoSperm'"" min in- ;il" ň| 2 ľii i ■: I inv || :■ F i pnknjijvŕ taplQlé. 3. Po rkjpglnůni zmař-ta wlkový obpmi ejakulätu a podle puLľeby pravedre □nalezu. 3. Viúrek řsperriiftEu a prípravku CryoSperm11" muEl mít pokojovou taplolu. Dal* nařecftc sperma pľľpraMkeíti CryůSperm™ m pomri l 1:1 {obj.fobj j. Médium je 1ťeba d-o JpG-ŕrtlŕEu pridával kupku pů kapCÉ ú s-mas b-ž Tiuaŕ po každá nn prídavku opatrní carnlchat, 4. Fuŕigchta amŕa fťilťiIrnainaFn minul pokojová taplolá. 5. Naplnit; naŕudŕné atmeňú du p«jtdr nebo- do Kry-D&Kopi-c k^ch zkumavek n uiísrňtn po-dle doporuíeni jipich výrobce. Je óůteitté ponecfrar i>g spoůoi ŕasn Jyŕľ/ífty vúJňý ríJúiJů/ prú ĽrJeffjídrtľ e uvnoimŕ eŕpauZŕ rozroŕru ŕáňem 5. Paneohta tytlnkvj t horizontálni poloza těsné nad púMfchaťťi kapalnŕhú du-siku (LNA Zkumavky pro hluboká zmrazovaní |b (F^ga pFipojit k trubici íi :::>ní!i;liat na atajnau dobu nad povrchem L N.. 7, Na záver prenaíle tvtinky nobo' kryůikůpiiků Zkumavky dOLN. a uskladnéta ph-lŮ6 C'C. m u r j 1 MED Evidence vzorků - popis zkumavky Štítek (samolepící) zahrnující: • jméno a příjmení • rodné číslo • pracoviště • datum • doba expirace (v ČR 28 let) • SEC kód u dárců • Že se jedná o spermie Na kryozkumavky často barevné markery, pejety barevně odlišené • Informované souhlasy: obsahují upozornění jak bude se vzorky nakládáno v případě neuhrazení skladování •Onkologičtí pacienti skladování 10 let hradí pojišťovna - povinnost pacientů doložit zahájení onkologické terapie ivi t: u Evidence vzorků - kryoprotokol Kryoprotokol zahrnující: • jméno a příjmení • rodné číslo • pracoviště • datum • doba expirace doba uhrazení skladování • SEC kód u dárců • výsledky sérologií - HIV Ag/Ah, HBsAg, aHBc, antiHCV, SYPH (RRR) u dárců navíc: TPHA (Syph), chlamidie (moč), Connexin, CFTR, karyotyp... • uložení vzorků • šarže kryo média • karanténa-přesun z karatény • Kontaktní údaje !!! mail i telefon, čím více tím lépe i.1uíi1 MED Materiály pro uchovávání směsi ejakulátu a - obvykle jsou používány pouze dva typy obalů při kryoprezervaci lidského - kryozkumavky lze lehce sterilně naplnit a udrží 1,0 ml -1,5 ml směsi spermatu s kryoprotektivy - šroubovací zkumavky nemají příliš těsné uzávěry tekutý dusík proniká do nádob a během ohřívání hrozí roztržení buněk - pejety 0,25-0,5 ml - uskladnění v nádržích s kapalným dusíkem je objemné a tato technika se dá provést pouze s částí spermatu spermii spermatu: - kryozkumavky - pejety MU NI MED Kryozkumavky šroubovací - zatavitelné Semen Cryoprotectants Freezing sample Kryopejety - malý objem Kryokonzervace spermií -poškození Osmotic stress: • Glycerol moving through the cell • Cell shrinks and swells, becoming strained • EC ice crystals Oxidative stress and DNA damage: • Removal of seminal plasma during centrifugation • Peroxidative membrane damage • Limited IC antioxidants reserve Ice crystals: Formation of intracellular and/or extracellular ice crystals causing disruption of cellular organelles -as- ®CCF 2011 Cryoprotectant toxicity: Glycerol is toxic to intracellular components přestože mají spermie ideální tvar na mražení tak jejich kryoprotekce není příliš efektivní co do počtu buněk (50-90% prežíva) poškození struktury buněčné membrány, buněčný metabolismus a mitochondriální bioenergetické procesy po rozmrazení často degradace proteinů tyto změny mají vliv na parametry spermií: snížení pohyblivosti nebo změna morfologie mitochondriální poškození, zhoršení motility, morfologie a může být během kryokonzervace ovlivněna i integrita DNA spermií HUNI MED ■I FAKULTNÍ NEMOCNICE —^ si- w w m r I BRNO Rozmrazovaní spermii Existuje několik technik: 1. rozmrazování při pokojové teplotě po dobu 10 minut a následný průchod termostatem při 37 °C po dobu dalších 10 minut 2. rozmrazování v termostatu a vodní lázni při teplotě 37 °C po dobu 10 minut 3. rozmrazování při pokojové teplotě po dobu 15 minut - jakmile je sperma rozmraženo, oddělí se od kryokonzervačního média promytím v kultivačním médiu a odstředění MU NI MED Kryokonzervace spermií- romražení - bezprostředně po roztátí obsah zpracujeme - pejetu dezinfikujeme a sterilními nůžkami odstřihneme oba konce pokud jsou spermie kryokonzervovány v kryotubě, tubu vybavíme z obalu a otevřeme - směs spermií a kryoprotektiva zředíme promývacím roztokem a centrifugujeme -vniklá peleta spermií může být buď resuspendována nebo podrobena swim-up MU NI MED SpermFreeze - rozmražení * wrthC IV* PIUS 1. Rtmovf cryoviaJt from N2(l) i c ryowaH front • 196 *C and ptac« mam at a «rata* bath at Or* kus 0-r**uS Sperm selection procedures Motility I Sorting Zeta potential Binding properties T Membrane integrity and normal morphology Immotile population Conventional techniques (swim up and density gradient centrifugation) Migration-sedimentation technique Glass wool filtration Microfluidic devices Magnetic activated cell sorting Fluorescence activated cell sorting Electrophoresis Zeta method Hyaluronic acid binding assay Zona pellucida binding assay Microfluidic devices 159 Microfluidic devices 159 Microfluidic devices Motile sperm organelle morphology •lamination Birefringence Hypo-osmotic swelling test Motility-activating substances Laser assisted immotile sperm selection Sperm tail flexibility test Microfluidic devices MED Základní separační techniky spermií FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO původně vyvinuty pro klasické IVF ne pro ICSI u kryokonzervovaných spermií poloviční koncentrace a nízký objem Základní separace motilních spermií swim-up - klasický - direct swim-up hustotní gradient (DGC) sekundární swim-up • selekce vitálních a progresivních spermií • swim-up oproti DGC výrazněji snižuje počet spermií s poškozenou DNA ve vzorku Densitygradients Seminal Plasma Lymphocytes, epithelialcells. weakspermatozoa Mobil« spermatozoa Swim-up Spermatozoaforthe reproductivetechnique (HIV-free) https://europe-ivf-life.com/how-is-life-created-in-an-ivf-lab/ MUNI MED Swim - up (konvenční) • na promytí používat izotonické roztoky • swim-up médium, do kterého spermie vycestují je vhodné používat fertilizační médium obsahující glukózu, Ca ionty a další látky podporující motilitu spermií • poškození spermií po kryo nejčastěji přes ROS • centrifugace neoddělí od sebe dobré či špatné spermie a leukocyty navzájem, po posledním promytí peletu opatrně převrstvíme fertilizačním médiem - vhodné sledovat dobu swim-up • pokud příliš krátce - málo spermií • pokud příliš dlouho - vysoká koncentrace, ale horší motilita • vhodné je šikmé uložení zkumavek v inkubátoru Direct swim-up (primární swim-up) • přímý swim-up - bez centrifugace • lze ejakulát podvrstvit po fertilizační medium nebo vrstvu ejakulátu opatrně převrstvit fertilizačním médiem • poté v inkubátoru 37 °C, 5% C02, 1 h • prodloužení času nad 1h nevhodné - postupné stárnutí spermií • spermie stáhneme pouze ze svrchní vrstvy • do oplození necháme suspenzi v popsané zazátkované zkumavce • potřeba dobrá koncentrace - nepříliš vhodné pro kryo spermie MU ME Sernon oř prupa'ud pollotoO •»P'-'~ Hustotní gradient (denzitní gradient) nejčastěji dvouvrstevný gradient oddělení spermií od bakterií, plísní a částečně virů vhodná u pozitivních pacientů doporučováno po kryo - Vitrolife 140 SOU 3 ■ 300 500g ■ d«bm at ni*wfac< ol .ntwío<« Příklad: do centrifugační zkumavky napipetujeme 1 ml hustšího roztoku (např. 80 %) na něj opatrně navrstvíme 1 ml řidšího roztoku (např. 40 %) a nahoru navrstvíme 1 ml ejakulátu centrifugujeme 15-20 min při 400g M U NI MED Sekundární swim-up • kombinace klasického swim-up a hustotního gradientu • výhody obou přístupů - odstranění patogenů a pečlivý výběr pouze živých spermií • po centrifugaci připravíme získanou suspenzi pro swim-up jako u swim-up a necháme 1h v inkubátoru • opatrně stáhneme svrchní vrstvu • doba swim-up by se neměla prodlužovat déle než 60 min • po kryo problém u nízké koncentrace Gra (c) Density dient-Swim (DG-SU) Up MUNI MED Pokročilé separační metody • separace morfologická - IMSI (náročné, drahé, pouze morfologické parametry) už se príliš nepoužívá nejefektivnější u OAT • pozitivní selekce pomocí vazby na hyaluronan - PICSI [spojené s redukcí aneuploidních spermií) -jedna z nejrozšířenějších metod výběru spermií -spermie s vysokou afinitou k hyaluronanu jsou zralejší vhodnější pro fertilizaci -HFEA Human Fertilisation and Embryology Authority (2019) - klasifikace red Mikrofluid n í chipy: Zymot (Fertile) FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO 5 kanálku délka 15 mm hloubka 50 |jm objem 15 |jl simulace cervikálního hlenu Inlet Port DX NOW % No*mol &p«nm t*vn throujh mcfO-cranritH Abnorm ni »p« rr- nim y b**»nd or «t*ek to &mrr+i i tunel vysoký 5 m a dlouhý 1,5 km Mikrofluidní chipy: Zymot Multi (Fertile Plus) semipermeabilní membrána o velikosti pórů 8 |jm objem 0,85 ml ejakulátu 37 °C po dobu 30 minut u kryo vhodné a efektivní u oligo může být problém Width 3.1 í.5um Length 4.5 - 4.9pm Midpiece rectangular 4.0 - 5.0um Vacuoles <4°o area vyseparovane spermie semipermeabilní membrána spermie před separací t*\0 Hi! / zkapalněný ejakulát c fakultní nemocnice BRNO Mikrofluidní chipy CA0/CA1 firma LENSHOOKE Writing H19.23 mm area ( Port (fof injection and suction) i polykarbonátová membrána s póry 5 |jm rozděluje prostředí na 2 konpartmenty snadná manipulace bez centrifugace objem 1 ml ejakulátu Side view: Place lower chamber P upper Selekce spermií: lab-on chip průchod speciální komůrkou vybrány jsou nejpohyblivější spermie MICRQFUUIDICS SPERM SORTING QUALIS Separační čip využívající průtoku média • krátká manipulace • eliminace poškození spermií • pouze 65 ul ejakulátu, dobré DFI • výborná motilita a morfologie Surts. MorpriQi&aKiaiiy Normal Mot*e Sperm (Leas. DNA írapmenílflrtJoni) Separační čip McGill • 500 radiálních mikrokanálků, viskózni médium, selekce 10-20 min • šířka 100 |jm, spermie s nízkou mírou poškození DNA - nejrychlejší EFAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO I " D Srovnání DGC x CAO x Zymot C fakultní nemocnice BRNO + lepší motilita, morfologie + nižší DFI Parameters Concentration Total motility Motile sperm count Progressive motility Rapid progressive motility Slow progressive motility Normal morphology rate DFI AR VCL ALH LIN Median (IQR) (M/mL] Change to neat (%) Medisn (IQR) (4 Change to neat ■ r ■ Median (IQR] (Ml Change to neat (%) Median (IQR) [%) Change to neat (%) Median (IQR) \%) Change to neat (%) Median (IQR) (K) Change to neat (%) Median (IQR) I^C Change to neat (%) Median (IQR) Change to neat ,;,£) Median (IQR) {%) Change to neat (%) Median (IQR| (um/sl Change to neat (%) Median (IQR] (um) Change to neat (%) Median (IQR) (K) Change to neat (%) Normozoospermie (n=34) Neat DGC 38,5(27.0-56.7) 6.5 (3.1-14.1) *" Jou mal of Assisted Reproduction and Genetics (2023) 40:185 5-1864 https://doi.Org/l 0.1007/sl 0815-023-02838-4 GAMETE BIOLOGY Check for updates Live motile sperm sorting device for enhanced sperm-fertilization competency: comparative analysis with density-gradient centrifugation and microfluidic sperm sorting Ch9ng-Teng Hsu1 • Chun I. Leew'5 • Fong-Sian Lin1 • Fang Zong Wang1 • Hui-Chen Chang1 Ts9 En Wang1 Chun-Chia Huang2,5 • Hui-MeiTsao2- Maw-Sheng Lee2,3,4,5 ■ AshokAgarwal6,7,8 Zymot 4.8(2.4-8.5)' CAO .56.2(51.6-68.7) 85.8(78.7-91.2) " 24.2 (14.6-34.8) 47.4 (39.5-55.9) 35.7 (25.8-46.7) 10.9 (8 7-13.8) +40.0 5.4 (2.4-13.3)'* -79.9* 80.6 (69.2-86.4)'* +50.5 * 75.8(65.8-82.3)'" +87.6* 4.4(3.1-5.4)*° _-Ě4 4 *_ 90.7 (76.9-95.5)*" 2.2 (0.9-3.6)*° -92 8 b 85.6(73.9-92.7)"° +64.6 ° 77.7(64.5-85.1)*' +97.7* 7.1 (4.1-8.9)"° .5.5(4.5-8.0) 8.1(5.6-10.9) 1 3.1(7.0-12.0) 10.3(7.6-14.5) ' +22.5 * +47.7° +57.7' 1S.5 (10.5-22.8) 118(6.9-19.3)"* 3 7(2.3-6.1) 13 2 (9.3-17.9) 55.3(42.6-58.5) 4.5 (3.S-5.0) 42.8 (41.1-47.3) -22.U 13.4 (8.0-18.4)" -7,0* 94.3 (79.1-108.0)'" +78.1* 6.2 (5.1-7.1)'° +41.2 * 35.5 (30.4-41.2)*' -23.2* -76.1 -6.5(4.0.9.0)'" -516' 86.3 (80.0-92.2)*° +59.6 " 6.2 (S.5-6.6)'' +40.7 1 34.5(31.5-37.9)'° -22.6* Para mew rs Con cent ration Total motility Motile sperm count Progressive motility Rapid progressive motility Slow progressive motility normal morphology rate Median (IQR) (M/mL) Change tc neat(?£) Median [IQR) i%\ ^ Change to neat I Median [IQR] [M] Change to neat (54) Median [tQR](W] Change to neat (96) Median (IQR; \%) Change to neat (%■) Median [IQR) [%} Change to neat (%) Median (IQR)<%* Change to neat (%) Median [IQR) {%] Change to neat (%J Median [IQR) {%] Change to neat (%) Median (IQR) [urn/s| Change to neat<&J Median (IQR] [urn) Change to neat [%) Median [IQR) (%) Change to neat [%} Non-normDzoospermic [n= Neat DGC 15.5 (10.2-30.3) 2.S (1.4-6.6)"* -793" _3 jQ 12.0-4.5] 5.1 ("J 0-/.D] 0 6 3(4.0-8.5)'b 8.5(6.ü-lU.H ' ^ 13 2 (9.5-35.9] 6.3 {3.0-13. 9.5(6.5-14.5) 45.5(38.7-56.0) J.9 (3.2-4.7) 42.2(39.2-45.3) +22.3 " 8.5(5.5-17.5)' -5.4" 77.9(66.4-93.4)'' +&3.3 ■ 5.2 (4 4-5.9p +34.0 ' 35,3 (31.4-40.6)'* -IS.3 * -52.9 D 5 (3.0-8.5p -50 " 75.9(64.9-90.2)'* 465.7 1 5.4 (4.6-6.6)'b +45.7 " 35.6 {32.4-39.9)"* -16.4" IUI L. -73.0e 4 (2.5-6.0)*1 -60' 76.8(66.0-88.6)"' +54,4° 5.3(4.7-6.3)"' +38.7 " 33.7 (29.1-38.2)"11 22.6 b U Srovnání swim-up/CAO výsledky naší laboratoře z hlediska koncentrace (vzestup na 113%) ani motility (pokles na 95 %) nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl Koncentrace DFI ndex Motilíta Swim-up CAO Swim-up CAO Swim-up CA0 .00 90.0 100 65. S 100 94.7 100 39.3 100 42.9 :oo 100 100 53.5 100 37.5 :oo 102.2 100 77.7 :oo 91.9 :oo 33.9 100 125.3 :oo 60.5 :oo 105.5 100 50.0 :oo 106.2 :oo 83,9 100 154.7 :oo 49.4 :oo 105.5 100 124.5 :oo 92.9 :oo 33.9 100 106.6 :oo 90.2 :oo 94,1 100 257.1 :oo 33.3 :oo 39.4 z hlediska integrity DNA byl zjištěn statisticky významný rozdíl při srovnání relativních hodnot pokles ze 100% na 72,09% (hladina P 0,0017) Označení vzorku Integrita DNA-DFI ndex před zpracováním po zpracování Swim-up CAO CA01 13 12.5 3.2 CA02 18 15.6 6.7 CA03 8.7 16.3 6.3 CA04 23 11.2 10.3 CA05 21 15.2 9.2 CA06 16 11.3 12.0 CA07 20 15.3 7.8 CA03 16 14.2 13.2 35 13.4 CA10 14.5 7.4 6.2 Výhody a nevýhody metody mikrofluidních metod při separaci po kryokonzervaci Výhody • rychlé a jednoduché, opakovatelné • bez centrifugace • konzistentní výsledky, dobrá čistota vzorku • malý podíl spermií s fragmentací DNA •spermie s normálni stavbou akrozomu Nevýhody •snižují množství použitelných spermií (malé objemy) •zpravidla nevhodný před klasickým IVF či IUI • nevhodné pro pacienty s těžkou oligozoospermií •vysoké náklady na materiál MU NI MED MACS - Magnetic Activated Cell Sorting spermie s poškozenou DNA vstupují do apoptózy vazba magnetických partikulí (50 nm) (díky Annexinu V) na fosfatidylserin, který je u apoptotických spermií na povrchu selekce pomocí speciálního magnetu lze kombinovat s dalšími metodami selekce spermií velice dobré výsledky u spermií po kryokonzervaci neoznačují se neapoptotické spermie !! u vzorků po kryo snižuje podíl spermií s fragmentací DNA - vhodné po kryo E FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO Paasch et al., 2003) EFAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO Naše zkušenosti s metodou MACS Efekt způsobu separace spermií na podíl spermií s poškozenou DNA Ejakulat bez separace MACS MACS/swim-up swim-up/MACS spermie každého pacienta (n = 16) separovány 3 způsoby použití MACS snížilo podíl poškozených spermií ve vzorku nejefektivnější způsob je použití metody MACS na odseparované spermie (ověřeno metodou HALOSPERM) M U NI MED Kryokonzervace materiálu z varlete a nadvarlete - kryokonzeravce materiálu získaného po punkci nadvarlete nebo varlete je nedílnou součástí postupů u azoospermie -synchronizace odběrů oocytů a spermií přináší logistické problémy a použití kryokonzervovaných spermií přináší velmi dobré výsledky -vlastní kryokonzervace je stejná jako u spermií - pokud přímo izolované spermie, tak je vhodné použít modifikované kryokonzervace malého množství - ke kapce spermií přidáme stejnou kapku kryo roztoku a zamícháme poté nasajeme do malé pejety průměr 1 mm dlouhé 10-20 mm a zatavíme -to zatavíme do normální pejety I.IUÍII MED Kryoprezervace materiálu z varlete a nadvarlete Ca D D Kryokonzervace malého množství materiálu * A - kapka směsi spermií a roztoku kryoprotektiva * B - tenká plastová pipeta ■ C - zatavená pipeta se sloupečkem kryoprotektiva obsahujícího spermie * D - Pejeta se zatavenou pipetou Kryoprezervace testikulární tkáně ^ • během posledních několika desetiletí se stále zvyšuje počet dětí, které přežívají zhoubný nádor • pozdějšími zdravotními následky léčby, nejzávažnější je neplodnost • k léčbě zhoubných nádorů se často používají gonadotoxické terapie • kryoprezervace testikulární tkáně je pravděpodobně jediné možné východisko pro prepubertální chlapce, s tímto typem léčby spermatogeneze (spermarche) začíná až v pubertálním věku nejdříve od 12 let nemají sperma ani zralé spermie pro kryoprezervaci podobně lze postupovat v případech pokud se nepodaří ani vibroejakulací či elektroejakulací získat spermie M U NI MED Chirurgické získání spermií TESA (testicular sperm aspiration) - lokální A, málo používaný přístup biopsie varlat PESA (percutaneous epidydimal sperm aspiration) lokální A, nejméně invazivní u mužů, kde je obštrukční azoospermie MESA (microsurgery epididymal sperm aspiration) celková A aspirát dáme do sterilní misky a zkontrolujeme přítomnost spermií pokud jich je málo, tak se vyberou pipetou do kapky fertilizačního média pokud jich je hodně, tak se použije centrifugace v hustotním gradientu pokud nejsou, tak se dělá TESE MU NI MED Chirurgické získání spermií TESE (testicular sperm extraction) tkáň propláchneme v promývacím roztoku a dáme do sterilní misky tak aby byla tkáň pod hladinou media lze nyní izolovat spermie z varietní tkáně 3 způsoby: • pomocí zahnutých sterilních jehel • pomocí sítka trenky • desintegrace tkáně pomocí kolagenázy (může dojít k poškozené spermatid) • poté hledáme spermie pod mikroskopem • pokud jich je málo, tak je vybereme pipetou, pokud hodně, tak lze použít separační techniku • varietní tkáň lze uchovávat v mediu až 3 dny při 4C MED Selekce nepohyblivých spermií Immotile spermatoza E FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO HOS test Activating Mechanical Substances Technique (STFT) t LAISS t -získané spermie mohou být nepohyblivé a je důležité rozlišit nepohyblivé živé a mrtvé použití Theofilinu (aktivátor spermií) - u hlodavců detekováno narušení vývoje, nutné promytí spermií mechanická technika (STFT) - sperm tail flexibility test - náročná, pouze pro zkušené, nevhodná po rozmražení UNI ED LAISS - laser asissted immotile sperm selection velice efektivní metoda pozitivní selekce viabilních spermií laserem vhodná jak pro pacienty po TESE, tak i pro pacienty s primární ciliární diskinezí/Kartegenerovým syndromem - kteří mají pouze nepohyblivé spermie nezbytné je mít invertovaný mikroskop s laserem Kryoprezervace testikulární tkáně FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO pečlivě zvážit, zda léčba opravdu způsobí neplodnost až bude chtít založit rodinu, tato tkáň bude rozmražena a zárodečné buňky zpětně implantovány do pacientových varlat, kde by pokračovalo jejich zrání in vitro zráni implantovaných buněk - pro ICSI nebo pro implantaci zpět do varlat v oblasti kryoprezervace testikulární tkáně byl proveden významný pokrok ve zvířecím výzkumu MU NI MED Kryokonzeravce testíku lární tkáně í"Vl University of il?y Pittsburgh Kyle Orwig, Ph.D. Grady, the first primate baby born using cryopreserved tissue from immature testes, at two weeks old. OHSU tato technika je považována za experimentální, dosud nebylo možné produkovat zralé spermie (s reprodukčním potenciálem) z lidských spermatogonií narození samice makaka (2019) po autotransplantaci kryokonzervované nezralé tkáně varlat představuje významný krok k podpoře konzervace testikulární tkáně u prepubertálních a dospívajících chlapců M U l\l I MED Technika mražení - kryokonzervaci lze provádět pomocí různých protokolů, včetně pomalého zmrazování nebo vitrifikace (častěji slow freezing) - protokoly jsou však stále ve vývoji, aby se optimalizovaly výsledky - na myším modelu je kryokonzervace testikulární tkáně účinnější než kryokonzervace testikulární buněčné suspenze - obnovení spermatogeneze u lidí (a nepochybně i u nehumánních modelových systémů) je stále náročná a životaschopní potomci byli dosud popsáni pouze v systémech zvířecích modelů MU NI MED Kryoprotektivní média - složena z roztoku HSA nebo séra (použití séra může vést ke křížové kontaminaci) CPA: DMSO nebo Glycerol • jako kryoprotektivní činidlo se používá nejčastěji DMSO o koncentraci 0,7 mol/l, doplněný sacharózou o koncentraci 0,1 mol/l a lidským sérovým albuminem o koncentraci 10 mg/ml • kousky tkáně jsou umístěny v 1 ml mrazícího media při 4 °C ve 2 ml mrazících ampulkách, mrazení se provádí v programovatelném mrazícím zařízení MU NI MED Kryokonzervace testikulární tkáně - case report - po příjezdu do laboratoře (do10 minut), byla biopsie přenesena do Petriho misky umístěné na ledu (4 °C) - byla rozdělena na 1-2 mm3 fragmenty, které byly poté umístěny do kryozkumavek obsahujících 1 ml roztoku kryoprotektiva (sacharóza 0,1 ml/l, DMSO 0,7 mol/l, HSA10 mg/ml) -jakmile byly kryozkumavky zapečetěny (SYMS III, CBS), bylo provedeno pomalé zmrazování pomocí programovatelného mrazicího boxu (FREEZAL, Air Liquide, Carbagas, Suisse) - na konci mrazicího programu byly kryotrubice skladovány při teplotě -196 °C v kapalném dusíku Kryokonzervace testikulární tkáně - postup - metoda kryokonzervace podle protokolu Katolické univerzity v Lovani: pokud byly pozorovány haploidní buňky, polovina vzorku byla kryokonzervována podle protokolu o zmrazení zralé tkáně varlat a druhá polovina podle protokolu o zmrazení nezralé testikulární tkáně, aby se zvýšila šance na následné obnovení plodnosti - fragment extrahované tkáně na histologické vyšetření - imunohistochemické barvení - detekce přítomnosti spermatogonií pomocí specifických markem (SALL4 a CD117) a k detekci nádorových buněk (protilátky podle základního onemocnění) -v USA za 8 let na 14 univerzitách 189 pacientů (2019) - kryokonzervace testi ku lární tkáně s následnou in vivo nebo in vitro spermatogenezí - tkáňové fragmenty nebo spermatogoniální kmenové buňky (SSC) - po izolaci spermatogoniálních kmenových buněk po kryokonzervaci - in vitro proliferaci/spermatogenezi, transplantaci SSC nebo techniky IVF (ROSI) Embryorronsfer MU NI MED ROSI - injekce kulatych spermatid do oocytu Fig 1: Testicular cells after treatment Sertoli cell (green arrows); round spermatids (yellow arrows); spermatogonia with or without pseudopodia (red arrows), and primary spermatocytes (blue arrows), erythrocytes (purple arrow). Spermatogonia B 4 IJJI..U.W.IJUJ.IJJ 1 S (9 The procedure of ROSI. (A) Immediately before picking up one spermatid. (B) A spermatid aspirated into the injection pipette, the plasma membrane being broken. The white arrowhead indicates the spermatid nucleus. (C-F) Oocytes before, during and after injection of spermatid. Arrowhead indicates the spermatid nucleus. (Magnification: A-F. 400*.) MUNI MED 1. biopsie tkáně varlat prepubertálním chlapců před zahájením gonadotoxické léčby 2. mrazení SSC nebo testikulární tkáně 3. po rozmražení organ model, 3D model nebo in vivo model 4. metody in vitro spermatogeneze k indukci spermatogeneze pomocí orgánové/tkáňové kultury nebo 2D nebo 3D systému buněčných kultur (před i po rozmražení) 5. získávání biopsií varlat je nabízena jako experimentální možnost v některých onkologických/reprodukčních centrech SSC isolation In vitro propagation of SSCs Testicular biopsy Cryopreservation Testicular biopsy In vitro spermatogenesis (Organ culture model) SSCs Prepubertal boy (Undergoing gonadotoxic treatment) In vitro spermatogenesis (20 or 30 cell culture SSC auto transplantation (Patient after recovery) - \»* Recovered haptoid , male germ cells «OS'c-rlCSI t 4 Qfjfjpl ng 4t Intercourse Autotransplantace fragmentů tkáně varlat - do varlete, šourku, či ektopicky pod kůži - zatím pouze u myší, králíků, makaků - u pacientů s maligním onemocněním je vyšetření tkáně molekulárními technikami povinné, aby se vyloučilo opětovné zavedení maligních buněk, zatímco u nemaligních onemocnění, jako jsou Klinefert. syndrom či CF toto riziko nehrozí - normálního vývoje bylo dosaženo po ICSI se spermiemi prasečích a opičích xenoštěpů MU NI MED Spermatogonial sterm cells - uchování spermatogoniálních kmenových buněk (SSC) a obnovení gametogeneze, ať už in vivo nebo in vitro, pro pozdější léčbu - transplantace nebo kultivace izolovaného SSC by mohla zabránit remisi maligních buněk a byla by lepší volbou pro pacienty s metastazujícími malignitami nebo hematologickým karcinomem - autotransplantace SSC navíc umožňuje (zatím pouze v systémech zvířecích modelů) obnovení spermatogeneze in vivo (včetně přirozeného početí bez nutnosti technik IVF) na rozdíl od tkáňového štěpování vyžaduje izolace SSC enzymatické štěpení pomocí kolagenázy a trypsinu nebo mechanickou dezagregaci buněk PNI MED Transplantace zárodečných buněk u myši - zdrojem dárcovských buněk je testikulární buněčná suspenze, in vitro kultivované buňky obohacené o spermatogoniální kmenové buňky nebo buňky frakcionované magneticky aktivovaným tříděním buněk (MACS) - markerový gen pro vizualizaci (např. (3-galaktosidázu, která se v přítomnosti substrátu X-gal barví modře) Evaluation of Spermatogenic Colonies - 8 týdnů po transplantaci lze spermatogenezi získanou od dárce snadno detekovat ve varlatech příjemce jako modré kolonie MU NI MED Autotransplantace SSC - injekce SSC (do rete testis) je považována za nejslibnější nástroj pro obnovení plodnosti -je potřeba SSC izolovat a in vitro proliferovat (cca 5% buněk vede k tvorbě kolonií) - lidské prepubertální SSC byly in vitro kultivovány - myši byli po transplantaci schopné plodit živá mláďata -2012 prokázána funkční spermatogeneze u Makaků po transplantaci In vitro spermatogeneze zabrání riziku přenosu maligní tkáně produkce spermií in vitroje předmětem intenzivního výzkumu, který v posledních letech úspěšně realizoval několik kroků probíhá výzkum s cílem vyhodnotit ideální kultivační médium a podmínky nezbytné k dosažení trvalé architektury a funkce varlat 3D kultura - zárodečné buňky disociovány od somatických buněk, v médiu 35 a 50% agaru - kokultivace se somatickými buňkami v roce 2018 byla prokázána proveditelnost generování haploidních zárodečných buněk z nezralé tkáně varlat orgánová kultura - štěp neporušen a navrstven na vrstvu agaru Male Mouse Testis Pieces um ED um p n Děkuji Vám za pozornost! 4