Legislativní a etické otázky spojené s kryokonzervací doc. Ing. Michal Ješeta, Ph.D. Gynekologicko-porodnická klinika, LF MU a FN Brno Mražení embryí problémy ̶ technika vyvolala mnohé etické, morální a právní problémy ̶ některé země mají specifické zákony které omezují kryokonzervaci - Německo, Švýcarsko, Itálie ̶ odhaduje se, že v Evropě v roce 2011 přispěla kryokonzervace k celkovému LBR o 4 % (LBR vzrostla z 19,7 % pouze s čerstvými cykly na 24,0 % včetně kryocyklů) ̶ zemích, kde je kryokonzervace systematicky uplatňována, je tento přínos ještě patrnější: Finsko +13,4 %, Švýcarsko +10,2 % a Austrálie a Nový Zéland +13,5 % Etická úskalí kryokonzervace ̶ embryo má právo na život a právo na zachování integrity ̶ kryokonzervace narušuje integritu embrya a je tedy morálně nepřípustná ̶ v roce 1996 papež Jan Pavel II. "apeloval na svědomí světových vědeckých autorit a zejména na lékaře, aby byla zastavena produkce lidských embryí, přičemž je třeba vzít v úvahu, že se zdá, že neexistuje žádné morálně přípustné řešení týkající se lidského osudu tisíců a tisíců 'zmražených' embryí, která jsou a zůstanou předmětem základních práv, a proto by měla být chráněna zákonem jako lidské osoby. Etická úskalí kryokonzervace Status embrya • ontologický personalismus: všechna lidská práva od počátku početí • empirický funkcionalismus: embryo je lidská bytost odlišná od lidské osoby, která se možná vyvine v lidskou osobu se všemi právy • gradualismus: práva zárodku lineárně rostou s jeho vývojem (zygota 0 % novorozenec 100 %) Marek Orko Vácha např. uvádí, že ...i dospělý jedinec je shlukem buněk. Tak jaký je mezi nimi rozdíl?“ Pascal Ide „…otázka statusu embrya uniká všem racionálním způsobům rozpravy.“ Tomáš Akvinský (13. století) se domníval, že k výskytu lidské duše dochází se zpožděním. Platná legislativa Zákon o specifických zdravotních službách 373/2011 sb. HLAVA II ZDRAVOTNÍ SLUŽBY POSKYTOVANÉ ZA ZVLÁŠTNÍCH PODMÍNEK Díl 1 Asistovaná reprodukce Podmínky likvidace embryí – v ČR § 9 odstavec 1 …lze je (embrya) uchovat a použít pro další umělé oplodnění této příjemkyně. To neplatí, jestliže neplodný pár písemně prohlásí, že tato embrya nehodlá použít pro své další umělé oplodnění a zároveň udělí souhlas s jejich: - použitím pro jiný anonymní neplodný pár, - nebo udělí souhlas s použitím nadbytečných embryí k výzkumu podle zákona o výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách - nebo s jejich likvidací Prohlášení může neplodný pár kdykoliv odvolat Podmínky likvidace embryí – v ČR § 9 odstavec 2 Pokud lidská embrya nebyla použita nebo neplodný pár neučinil písemné prohlášení o jejich likvidaci podle odstavce 1, může poskytovatel po 10 letech uchovávání těchto embryí opakovaně prokazatelně písemně vyzvat neplodný pár o vyjádření k dalšímu uchovávání těchto embryí, včetně udělení souhlasu s jejich zlikvidováním. Pokud neplodný pár nereaguje na opakovanou prokazatelně zaslanou písemnou výzvu poskytovatele, lze i bez vyjádření neplodného páru lidská embrya zlikvidovat. Podmínky likvidace embryí – v ČR § 9 odstavec 3 Opakovanou písemnou výzvou podle odstavce 2 se rozumí její prokazatelné zaslání prostřednictvím provozovatele poštovních služeb na adresu neplodného páru, která je poskytovateli známa, a to nejméně dvakrát s časovým odstupem nejméně 60 dnů. Lhůta pro vyjádření neplodného páru na základě druhé výzvy činí 30 dnů ode dne jejího doručení. Podmínky likvidace embryí – v ČR § 9 odstavec 4 Výzva je doručena dnem, kdy si ji adresát převezme, jinak se považuje za doručenou uplynutím lhůty 10 dnů ode dne oznámení o jejím uložení u provozovatele poštovních služeb. Jestliže je výzva s ohledem na změnu adresy neplodného páru nedoručitelná nebo bylo odmítnuto její převzetí, považuje se výzva za doručenou dnem jejího vrácení poskytovateli. Obdobně se postupuje, je-li výzva nedoručitelná jen jedné osobě z neplodného páru. Jak je to ve světě • v roce 2017 byla v USA cca 0,6 - 4 miliony opuštěných embryí skladování v USA i 1000 dolarů/ročně • snaha o zdůvodnění limitů a jejich prodloužení (někdy velmi krátké Portugalsko 3 roky), nejčastěji 10 let • 07/2022 v UK prodloužena doba skladování z 10 na 55 let (gamety, embrya) Skladování embryí Kryokonzervované gamety • Neexistuje zákonná úprava!!! • týká se jen 1 osoby • uskladnění není vymahatelné, pokud klient neplní podmínky smlouvy s TZ (náklady na skladování), likvidace je možná • Jedná se o vzácný materiál – vždy dobré mít souhlas s likvidací Blízký východ ̶ dlouho bylo zmrazení vajíček v regionu zakázáno pro neprovdané ženy, vdané ženy mohly tento zákrok podstoupit se souhlasem svého manžela ̶ 2008 změna ve Spojených arabských emirátech-zákon č. 11/2008, který zakazoval zmrazování embryí, gamet a jakéhokoli jiného reprodukčního materiálu ̶ zrušen federálním zákonem č. 7/2019 - nyní lze zmrazit vajíčka ze sociálních i zdravotních důvodů (před chemoterapií radiační léčbou, nebo u těch, kterým hrozí předčasné selhání vaječníků) ̶ svobodným ženám je povoleno nechat si zmrazit vajíčka a mohou je použít pouze pro vlastní těhotenství po svatbě se spermiemi svého manžela při postupu IVF Další země Asie ̶ v Bahrajnu je povoleno skladování gamet po dobu až 10 let a embrya po dobu 5 let a léčba je opět dostupná pouze manželským párům. ̶ v Saúdské Arábii, kde je IVF léčba od svého zavedení v 80. letech 20. století stále populárnější neexistuje žádné časové omezení pro uchovávání, ale léčba může probíhat pouze v rámci manželské smlouvy, která musí být doložena ̶ v Ománu je skladování zmrazených vajec po dobu 5 let a poté podléhá každoroční obnově. Etická úskalí kryokonzervace ̶ Itálie zákon v roce 2004 (40/2004) – max 3 embrya (oplození max 3 oocytů), ale žádné se nesmí mrazit!!! - zákaz PGT ̶ odhad byl zhoršení efektivity IVF asi o 2/3 ̶ zakázáno mražení spermatu a to i u onkologických pacientů !! ̶ 2009 italský ústavní soud (151/2009) prohlásil kryokonzervaci embryí za legitimní Název předmětu (kód předmětu) (např. První pomoc - cvičení (VLPO011c)) Nejdelší skladování embryí ̶ Emma Wren Gibson narozena 2017 (skladování 24 let) rekord (zamrazeno 1992) ̶ mladší sestra Molly narozena 2020 (skladování 27 let – nový rekord) ̶ maminka Tina Gibson narozená 1991 ̶ prostřednictvím NEDC které bylo založeno 2003 a zprostředkovalo už více než 1000 porodů prostřednictvím adopce embryí Doba skladování - nejdelší skladování ̶ listopad 2022 dvojčata narozená z embryí která byla zamražena 22.4.1992 (29 let a 10 měsíců) ̶ National Embryo Donation Center ̶ z 5 nebyly 2 životaschopné, ET 3 embrya ̶ Philip and Rachel (33) z Oregonu Automatizace procesu vitrifikace oocytů ̶ Laura Rienzi z italské společnosti GeneraLife: obrovský přínos má vitrifikace oocytů pro životy tolika lidí, a také se zaměřila na automatizovanou vitrifikaci, která, jak řekla, zajistí "kvalitu procesu" tím, že standardizuje načasování, objemy a postupy. "Měli bychom se zaměřit na standardizaci a automatizaci," řekla, "ale tam ještě nejsme." GAVI Systém Sarah Arav et al., 2018 ̶ Fertisafe Israel ̶ dostupnost automatizovaného vitrifikačního zařízení stane nepostradatelným pro standardizaci, zjednodušení a reprodukovatelnost celého procesu Leidenfrostův jev • při styku kapaliny s povrchem, který značně převyšuje teplotu látky, dochází k vypařování části objemu kapaliny, které je doprovázeno Leidenfrostovým jevem • kapalina v kontaktu s výrazně teplejším povrchem (rozdíl teplot musí být alespoň 193 °C) vypaří část svého objemu a vytvoří tím páru, která kapalinu tepelně izoluje, kapalina vytváří drobné kuličky, které se pohybují a odpařováním neustále zmenšují • Leidenfrostův jev se nevyskytuje jen u vody, např. tekutý dusík (-195,8 °C) při kontaktu s objekty pokojové teploty (nebo lidského těla) vytváří tenkou izolační vrstvu páry Slush nitrogen • hlavní výhoda snížení vaporizace • cooling rate 15000 – 30000/min kapalný dusík (-196 C) • 135 000/min slush nitrogen (-210 C) zařízením VitMaster (IMT Ltd, Ness Ziona, Izrael), které působením podtlaku snižuje teplotu LN na -205 až −210 °C • snižuje negativní Leidenfrostuv efekt – vaporizace po solidifikaci • rychlost ochlazení se zvyšuje až 6x oproti LN • použití slush N výrazně rychlejší zamražení, lepší přežitelnost embryí (Osman et al., 2020) Antioxidanty ̶ přítomnost antioxidantů během kryokonzervace má významné příznivé účinky na vývoj embrya, a to pravděpodobně prostřednictvím snížení oxidačního stresu ̶ použití antioxidantů do roztoků pro kryokonzervaci by proto mohlo představovat cennou strategii pro zlepšení vývoje a životaschopnosti embryí ̶ tyto údaje jsou příslibem pro zlepšení výsledků přenosu KET v klinickém IVF, v současné době probíhají studie zaměřené na tuto problematiku Prof. David Gardner Název předmětu (kód předmětu) (např. První pomoc - cvičení (VLPO011c)) Gx media Hodnocení kryokonzerace embryí - kryoprotektiva ̶ přímá toxicita CPA je potenciálním zdrojem škod s neznámými důsledky DMSO a EG mohou indukovat metylaci a strukturální změny v chromatinu. DMSO může také usnadnit dvouřetězcové zlomy DNA ̶ poškození vyvolané CPA závisí na koncentraci, kolísání pH, teplotě, stupni hyperosmotického stresu a tvorbě reaktivních forem kyslíku ̶ změny v propustnosti membrán k rychlé výměně přítoku vody, která modifikuje morfologii embryonálních buněk to končí nuceným zastavením metabolismu poté co jsou embrya ponořena do tekutého dusíku ̶ tato přechodná variabilita v dynamice štěpení embrya vyjadřuje morfologické rozdíly ve tvaru a velikosti blastomer, přítomnost fragmentů, asymetrii mezi buňkami, rozdíly ve stavu buněčného cyklu Efekt kryo na rep. bunky Epigenetika ̶ vitrifikace snížila acetylaci histonů H3K9 a H3K27 ̶ antioxidanty zmírnily takové poruchy acetylace histonů, i když jejich podávání bylo nedostatečné k obnovení epigenetických značek na normální úroveň ̶ antioxidanty zvýšily míru přežití embryí a jejich růst poté, co byla podrobena vitrifikaci ̶ byly studovány také modifikace chromatinu kryokonzervací to ukázalo, že myší blastocysty jsou odolnější vůči poruchám způsobeným kryokonzervací než moruly ̶ postupy pomalého zmrazování ovlivňují integritu chromatinu více než vitrifikace; naopak hladiny ROS jsou vyšší ve vitrifikačním protokolu ve fázích moruly než při pomalém zmrazování. Aneuploidie fresh vs vitri ̶ ploidie embryí podstoupily PGT-A s vitrifikovanými oocyty ve srovnání s čerstvými oocyty ̶ primárním výsledkem byl poměr euploidních, mozaikových a aneuploidních embryí mezi těmi, kteří používali vitrifikované a čerstvé ̶ ploidie embryí, nebyly mezi oběma skupinami zjištěny statisticky významné rozdíly v míře euploidie (40,1 % vs. 41,6 %), mozaicismu (15,7 % vs. 12,0 %) nebo aneuploidie (44,3 % vs. 46,4 %) (p = 0,06). ̶ Vitrifikace oocytů s následným zahřátím, oplozením a biopsií trofektodermu pro PGT-A nebyla spojena s nepříznivou chromozomální kompetencí ve srovnání s věkově odpovídajícími kontrolami s použitím čerstvých oocytů. Kryonika – společnost Alcor ̶ kryokonzervace těl lidí i zvířat (domácí mazlíčci) ̶ nejsou schopni nikoho rozmrazit, ale dosud byla zamraženo desítky těl (1927 členů a 225 těl a 119 mozků v roce 2023) ̶ uskladnění v kapalném dusíku neomezeně dlouho ̶ technika vitrifikace Lékařská fakulta Masarykovy univerzity 2021 Děkuji Vám za pozornost !