Prof. Anna Vašků1
Genetika a genomika v patofyziologii nemocí
Embryolog
Jaro 2024
Genom ve zdraví a nemoci
̶ Genetická výbava jedince (souhrn všech
genů=genom) je sice osudově zadána v okamžiku
zplození, ale není pro další život konečná, protože
v průběhu života se může měnit jak
̶ pod vlivem četných faktorů prostředí, tak
̶ faktorů epigenetických (metylace, acetylace histonů,
glykace),
̶ tak pod vlivem dalších faktorů genetických (např.
mutacemi somatických buněk v průběhu maligní
transformace).
Prof. Anna Vašků2
Genomika
̶ je obor genetiky, který se snaží stanovit úplnou genetickou
informaci organismu a interpretovat ji v termínech životních
pochodů. Někdy se genomika rozděluje na tzv. strukturní
genomiku, spočívající ve stanovení sledu nukleotidů genomu
organismu, na bioinformatiku, jež počítačovými metodami a
prací v databázích interpretuje přečtenou dědičnou informaci
a na funkční genomiku, kde se experimentem, například
vyřazením nějakého genu z činnosti (zvířecí modely typu knock
out), snažíme přiřadit funkci neznámým genům, případně funkci
genů studovat.
Prof. Anna Vašků3
Strukturální součásti DNA
Prof. Anna Vašků4
Prof. Anna Vašků5
Struktura DNA
̶ Cukry-N-glykosidické vazby bazí mezi C1
deoxyribózy (DNA) a ribózy (RNA) a N1
pyrimidinových bazí a N9 purinových bazí.
̶ Báze A, T (- vazby), G, C (= vazby)
̶ Fosfáty jsou esterifikovány na C5´deoxyribózy a
vytvářejí dNMP
̶ dNMP+P=dNDP+P=dNTP
Prof. Anna Vašků6
Povaha informace skladované v DNA
̶ Některé geny kódují protein. Jejich transkribovaná RNA se
nazývá heterogenní nukleární RNA (hnRNA). Ta se upravuje
(processing) na mRNA.
̶ Messenger RNA (mRNA) je lineární kód, který je možno převést
(translace) do sekvence AK polypeptidu pomocí kodonů a
antikodonů (o 3 znacích) pro každou AK.
Prof. Anna Vašků7
Povaha informace v DNA
̶ Některé geny nekódují protein. Funkce transkribované RNA v
tomto případě je:
̶ processing mRNA (malé nukleární RNA čili snRNA)
̶ translace mRNA do proteinu (transfer RNA-tRNA, ribosomální RNArRNA.
tRNA a rRNA kóduje 3D strukturu ve výsledných produktech
RNA, které umožňují jejich funkci.
Prof. Anna Vašků8
Syntéza DNA ve zvířecích buňkách
̶ DNA je ve zvířecích buňkách ve formě chromosomů (1-10cm celkové
délky). Každý chromosom má 2000 začátků (origins) replikace. Od
každého tohoto místa probíhá obousměrně syntéza DNA. Až se
jednotlivé kousky syntetizované z míst začátku replikace setkají, vzniká
dceřinné vlákno DNA. Začátky jsou od sebe vzdáleny cca 30-100 m.
̶ časová synchronizace syntézy 50000-60000 replikonů v každém
genomu.
Prof. Anna Vašků9
Prof. Anna Vašků10
Koncepce „Read and Write genome“
̶ Genomy jsou databáze DNA, které obsahují kódující a
formátující sekvence, které umožňují dědičné předání
schopnosti syntetizovat biologicky adaptivní molekuly RNA a
proteinů. V průběhu evoluce se kódující sekvence i
formátující signály mění, což umožňuje stále nové adaptace
pomocé restrukturalizace genomu (Shapiro, 2011 a Shapiro,
2013).
̶ Dynamický read–write (RW) genome střídá tradiční
představu „read only memory“ (ROM) genomu.
Prof. Anna Vašků11
Koncepce „Read and Write (RW) genome“
̶ Základní ideou této koncepce je myšlenka, že buňky používají
DNA jako modifikovatelný prostředek skladující data („data
storage medium“), který kóduje RNA a proteinové molekuly:
tyto molekuly si musejí poradit s měnícím se prostředím.
̶ Změna je pro žijící organismy kontinuálním dějem. Ke změnám
dochází během průchodu buněk cyklem buněčného dělení, s
měnícími se vlastnostmi vnějšího prostředí, se zkušeností buněk
s poškozením, s vývojem multicelulární morfogenezy a s
interakcí buněk s jinými buňkami a organismy.
Prof. Anna Vašků12
Koncepce „Read and Write (RW) genome“
̶ Ke zvládnutí krátkodobých změn buňky primárně nasazují přechodně
vznikající nukleoproteinové komplexy, které jsou schopny regulaci exprese
genomických dat a umožňují tak růst a replikaci buněk.
̶ Pro dlouhodobější změny, jako je buněčná diferenciace a multicelulární
morfogeneze, vstupují do hry dědičné epigenetické modifikace genomu.
̶ Pro nejdlouhodobější změny, které vytvářejí nové biologické funkce
během evoluce, buňky nasazují schopnost „natural genetic
engineeringu“, které umožňují přebírat a alterovat sekvence DNA a
rekonfigurovat organizaci genomu. Někdy tyto funkce mění strukturu DNA
také v zájmu krátkodobých cílů (např. rychlá nastolená diverzita mezi
receptory adaptivního imunitního systému).
Prof. Anna Vašků13
Tumorigeneze je komplexní evoluční proces zahrnující mnoho genetických a
epigenetických alterací. Epigenetické změny během iniciace a progrese
tumoru poskytují abundantní zdroj variability, která podporuje rychlou
adaptaci tumoru a poskytuje bohatý zdroj labilních biomarkerů pro
genetickou analýzu.
Tumour Biol. 2016 Jul 28. Biomarkers of genome instability
and cancer epigenetics. Reis AH, Vargas FR, Lemos B.
Prof. Anna Vašků14
Geny udržující stabilitu genomu
̶ Označují se někdy jako mutatorní geny a
bývají i řazeny k tumor-supresorovým genům.
Produkty těchto genů se uplatňují
v opravných mechanismech poškozené DNA.
̶ Jejich mutace vede ke zvýšené frekvenci
mutovaných onkogenů a tumorsupresorových
genů, někdy až 1000krát.
Prof. Anna Vašků15
Prof. Anna Vašků16
Geny udržující stabilitu genomu
̶ Patří sem geny, jejichž produkty zajišťují
vystřižení poškozeného úseku DNA a umožňují
excizní opravný proces. Jejich recesivní
mutace způsobuje onemocnění zvané
xeroderma pigmentosum a Cockayenův
syndrom, což jsou prekancerózy se zvýšenou
náchylností ke karcinomům kůže navozeným
expozicí na UV-záření.
Prof. Anna Vašků17
Geny udržující stabilitu genomu
̶
Další skupinou mutatorních genů jsou „mismatch“
opravné geny; kódované proteiny opravují chybné
zařazení baze při replikaci DNA (nikoliv však
komplementární). Projevem mutací těchto genů je
instabilita na nukleotidové úrovni – mikrosatelitová
instabilita. Zárodečné mutace zejména MSH2 a MLH1
genů jsou podkladem hereditárního nepolypózního
kolorektálního karcinomu (HNPCC) .
̶ Mutace genů, jejichž produkty zajišťují „opravné
čtení“, jehož úkolem je identifikace chybných úseků
DNA při replikaci, byly prokázány u karcinomu žaludku
a tlustého střeva. Jedná se především o mutaci genu
pro polymerasu d.
Prof. Anna Vašků18
Geny udržující stabilitu genomu
̶
Rozpoznání poškozené DNA a aktivace p53
vyžaduje přítomnost ATK. Tento gen kóduje
kinasu, která aktivuje jak CHK2 tak p53 při
poškození DNA. Děti trpící ataxiíteleangiektazií
mají inaktivující mutaci obou
alel.
̶ V klinickém obraze je pak imunodeficience,
mozečkové příznaky a zvýšené riziko vzniku
maligního nádorového onemocnění,
především lymfomů. Buňky těchto pacientů
nemohou aktivovat p53 jako odpověď na
poškození DNA.
Prof. Anna Vašků19
Geny udržující stabilitu genomu
̶
Jiný syndrom označovaný jako NBS (Nijmegen breakage syndrom) je způsoben
homozygotní inaktivací genu NBS, který se podílí přímo na opravách poškozené
DNA. Do tohoto mechanismu rozpoznávajícího a opravujícího poškozenou DNA
vstupuje též gen BRCA1. Mutace v jedné alele zárodečných buněk nesoucích tento
gen je odpovědná asi za polovinu případů karcinomu mléčné žlázy s familiárním
výskytem. Při účinku proteinu BRCA1 hraje důležitou funkci jak ATM tak CHK2, které
umožňují jeho fosforylaci, když dojde k poškození DNA. ATM také fosforyluje kofaktor
BRCA1 - CtIP, který reguluje transkripci genu BRCA1. Defekty DNA-opravného
mechanismu přispívají k akumulaci genetických defektů (viz genová nestabilita
navozená genem HNPCC = gen pro hereditární nepolypózní kolorektální karcinom)
a podporují progresi maligně transformovaných buněk.
Prof. Anna Vašků20
Tumor-supresorový protein p53 (TP53)
̶ je jeden z nukleárních proteinů, který má klíčovou úlohu v regulaci cyklu
buněčného dělení při přechodu z G0 do G1-fáze. Obsahuje domény pro
vazbu na specifický úsek DNA, dále oligomerizující a transkripci aktivující
domény. Váže se jako tetramer na vazebné místo na určitém úseku DNA
a tím aktivuje expresi genů, kódujících faktory inhibující proliferaci a
podporující invazivitu buněk.
̶ Mutanty genu p53 jsou nalézána u řady maligních tumorů. Pozměněný
TP53 ztrácí schopnost vazby na příslušný lokus DNA, což vede
k nedostatečné produkci faktorů potlačujících nádorový růst. Alterace
genu p53 se objevuje nejen jako somatická mutace, ale též jako mutace
v zárodečných buňkách u některých nádorových onemocnění
s familiárním výskytem (syndrom Li-Fraumeni
Prof. Anna Vašků21
Tumor-supresorový gen p53
➢je klíčovým regulačním faktorem, který monitoruje poškození DNA. I
➢inaktivace p53 bývá jedním z prvních kroků, který vede k maligní transformaci při
vývoji řady nádorových onemocnění.
➢Pacienti s Li-Fraumeniho syndromem mají obvykle jednu mutantní alelu
v zárodečných buňkách a tím i riziko vzniku sarkomů, leukemie a karcinomu mléčné
žlázy. Vzácně pacienti s Li-Fraumeniho syndromem nemají v zárodečných buňkách
tuto mutaci, ale mutaci genu CHK 2, kódující proteinkinasu, která fosforyluje
protein p53, čímž dochází k jeho aktivaci. Tito pacienti však mívají alteraci v jiných
genech – MDM 2 a p14ARF, které regulují expresi p53.
Prof. Anna Vašků22
5´
3´
3´
5´
5´ 3´
Promotor Exon 1 Intron 1 E2 I 2 E 3 I 3 Exon 4DNA
RNA
transkript
Zralá mRNA
Protein NH2 COOH
1 2 3 4
Lidský gen
RNA
Transkripce
Processing (capping, adice
poly A, splicing)
Translace
3´
Cap AAAAAn
5´UTR 3´UTR
5´UTR 3´UTR
1 I 2 I 3 I 4
1 2 3 4
Prof. Anna Vašků23
Základní terminologie
̶ Gen
̶ Lokus
̶ Alela
̶ Genotyp
̶ Homozygot, heterozygot, hemizygot (X-linked)
̶ Genom
Prof. Anna Vašků24
Genová exprese - transkripce a translace DNA
Prof. Anna Vašků25
Dělení buněk
mitóza
2 dceřinné buňky s diploidním počtem chromozomů
1 cyklus DNA replikace následuje rozdělení
chromozomů a jádra (profáze → prometafáze →
metafáze → anafáze → telofáze) a násl. celé buňky
(cytokineze)
meióza
1 cyklus replikace následován 2 cykly segregace
chromozomů a buněčného dělení
1. meiotické (redukční) dělení – rozdělení
homologních chromozomů
významné – odehrává se zde meiotický
crossing-over (rekombinace) – žádná z gamet
není identická!
poruchy rozestupu – např. trisomie
2. meiotické dělení – rozestup sesterských
chromatid
2 dceřinné buňky s haploidním počtem
chromozomů
vznik pohlavních buněk (spermie, vajíčko)
dodatečné promíchání genetického
materiálu crossing-overem
Prof. Anna Vašků26
Typy tkání podle regenerační schopnosti
̶ Labilní (intermitotické a postmitotické buňky: kůže, sliznice,
hemopoetická tkáň, semenný epitel)
̶ Stabilní (reverzibilně postmitotické buňky: Játra-ledvinypankreas,
endotelie, mezoteliální buňky, synoviální krycí buňky,
vazivová tkáň, lymfocyty s dlouhým poločasem)
̶ Permantní (irreverzibilně postmitotické buňky- gangliové,
svalové, vaječné, plasmatické, makrofágy)
Prof. Anna Vašků27
Lidské chromosomy
• morfologicky
barvitelné pouze v
průběhu mitózy nebo
meiózy, kdy dochází
ke kondenzaci
• v diploidní buňce 23
párů homologních
chromosomů (22 párů
autosomů a 2 pohlavní
chromosomy)
Prof. Anna Vašků28
Karyotyp člověka
každý biologický druh má svou
charakteristickou chrom. výbavu
(počet a morfologii) = karyotyp
u člověka mají diploidní bb. 46
chromozomů
22 párů homologních autozomů, 1
pár gomozomů (44XX nebo 44XY)
zárodečné (vajíčko, spermie) 23 – haploidní
struktura chromozomu
centromera
telomery (raménka)
dlouhé - q
krátké – p
barvením chromozomů se dosáhne
charakteristického pruhování a tím rozlišení
jednotlivých chromozomů
Prof. Anna Vašků29
Karyotyp podle Denverské klasifikace
Prof. Anna Vašků30
Chromatin  chromozom
▪ v nedělící se buňce je chromatin
rozprostřen volně v jádře
▪ u dělící se organizuje do
viditelných chromozomů
Prof. Anna Vašků31
Chromosomové a genové aberace
̶ Chromosomové aberace
Strukturní
Numerické
̶ Genové mutace
Vzácné alely
Polymorfismy
Prof. Anna Vašků32
Chromozomální poruchy
aneuploidie (změna počtu chromosomů v sadě)
porucha rozdělení sesterských chromozomů
[meiotická non-disjunkce]
později během rýhování → somatická mozaika
monosomie
gonozomální
Turnerův sy. (45, X0)
trisomie
autozomální
Downův sy. (47, XX/XY + 21)
Edwardsův sy. (47, XX/XY +18)
Patauův sy. (47, XX/XY +13)
gonozomální
Klinefelterův sy. (47, XXY)
polyploidie (porucha rozdělení celých sad nebo
oplození 2 spermiemi [dispermie])
u člověka neslučitelné se životem
těhotenství je potraceno
molla hydatidosa (a pak těhotenství nutno ukončit
potratem)
porod novorozence s triploidií – velmi časná letalita
Prof. Anna Vašků33
Genové mutace
̶ Z hlediska patogeneze nemocí je důležité, zda se jedná o mutace v
somatických buňkách, které vznikají v průběhu života, většinou jsou
buněčně nebo tkáňově specifické a nepřenášejí se na potomstvo,
nebo zda jde o tzv. zárodečné mutace, které vznikají v zárodečných
buňkách (vajíčko nebo spermie), stávají se součástí vrozené
genetické predispozice, jsou obsaženy ve všech buňkách a
přenášejí se na potomstvo.
̶ Mutací vzniklé alely jsou v populaci z různých důvodů vzácné (např.
jsou výrazně patologické a tudíž jsou z populace odstraňovány
selekcí, nebo vznikly nedávno a nestačily se v populaci rozšířit) a
časté (polymorfismy).
Prof. Anna Vašků34
Genové mutace-typy
Normální stav
DNA
ATGCAGGTGACCTCAGTG
TACGTCCACTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Thr-Ser-Val
Mutace typu „missense“
DNA
ATGCAGCTGACCTCAGTG
TACGTCGACTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGCUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Leu-Thr-Ser-Val
Příklady-hemoglobin S u
srpkovité anemie
Prof. Anna Vašků35
Genové mutace-typy
Normální stav
DNA
ATGCAGGTGACCTCAGTG
TACGTCCACTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Thr-Ser-Val
Mutace typu „nonsense“
DNA
ATGCAGGTGACCTGAGTG
TACGTCCACTGGACTCAC
RNA
AUGCAGGUGACCUGAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Thr-Stop
Příklady: 0 thalasemie
Prof. Anna Vašků36
Genové mutace-typy
Normální stav
DNA
ATGCAGGTGACCTCAGTG
TACGTCCACTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Thr-Ser-Val
Mutace typu trinukleotidové expanze
DNA
ATG(CAGCAGCAG)20CAGGTGACCTCAGTG
TAC(GTCGTCGTC)20GTCCACTGGAGTCAC
RNA
AUG (CAGCAGCAG)20CAGGUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-(Gln-Gln-Gln)20Gln-Val-Thr-Ser-Val
Příklady: Huntingtonova nemoc
Prof. Anna Vašků37
Genové mutace-typy
Normální stav
DNA
ATGCAGGTGACCTCAGTG
TACGTCCACTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Thr-Ser-Val
Mutace typu „frameshift“
(=posun čtecího rámce)
DNA
ATGCAGGTGAACCTCAGTG
TACGTCCACTTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUGAACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Asn-Leu-Ser
Příklady:
Duchennova muskulární dystrofie, 0
thalasemie, Tay-Sachsova choroba
Prof. Anna Vašků38
Genové mutace-typy
Normální stav
DNA
ATGCAGGTGACCTCAGTG
TACGTCCACTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Thr-Ser-Val
Mutace typu „inserce“
DNA
ATGCAGGTG-3000 bp-ACCTCAGTG
TACGTCCAC-3000 bp-TGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUG-3000 bp- ACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val----------------?
Příklady:
velké: Hemofilie A
Prof. Anna Vašků39
Genové mutace-typy
Normální stav
DNA
ATGCAGGTGACCTCAGTG
TACGTCCACTGGAGTCAC
RNA
AUGCAGGUGACCUCAGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val-Thr-Ser-Val
Mutace typu „delece“
DNA
ATGCAGGTG
TACGTCCAC
RNA
AUGCAGGUG
PROTEIN
Met-Gln-Val
Příklady:
malé-cystická fibróza
velké: Duchennova muskulární
dystrofie
Prof. Anna Vašků40
Monogenní nemoci
̶ Rozvoj molekulárně biologických metod umožnil detailní
analýzu genetického podkladu mnoha mendelisticky
děděných, tzv. monogenních nemocí.
̶ U těchto chorob se dědičný podklad uplatňuje jako velký
faktor, tj. je přítomen prakticky u všech nemocných a
jedná se prokazatelně o faktor příčinný (např. defekty
v dystrofinovém genu u muskulárních dystrofií), k němuž se
přidávají jen jako přídatné další faktory genetické i faktory
zevního prostředí. Příčinou těchto nemocí bývají především
tzv. vzácné alely.
Prof. Anna Vašků41
Čtyři základní typy monogenní dědičnosti
dominantní recesivní
autosomální autosomálně dominantní
(AD)
autosomálně recesivní
(AR)
X-vázaný X-dominantní (XD) X-recesivní (XR)
Prof. Anna Vašků42
Mitochondriální dědičnost
̶ Z hlediska genetiky je zásadní fakt, že mtDNA je předávána
další generaci výhradně matkou (matroklinní dědičnost),
když po oplodnění jsou zachovány pouze mitochondrie
lidského vajíčka. To patrně není pouhým důsledkem
nepoměru počtu mitochondrií lidského oocytu (cca 100
000) a spermie (50-70), ale předpokládá se aktivní proces,
který po oplození zlikviduje mitochondrie paternálního
původu. Tomu odpovídá i typický maternální přenos chorob
způsobených mutacemi mtDNA v rodokmenu (viz obrázek).
Pokud je heteroplazmická mutace zděděna nebo k ní
dojde v časných fázích embryogeneze, normální i
mutovaná varianta jsou náhodně předávány při buněčném
dělení dceřinným buňkám (mitotická i meiotická
segregace). Distribuce a zastoupení mutované mtDNA v
jednotlivých orgánech jsou proto patrně závislé na čase a
vzniku mutace a rovněž na typu postižené buňky.
Prof. Anna Vašků43
Rodokmen pro mitochondriální dědičnost
Prof. Anna Vašků44
Monogenní choroba
̶ Monogenní choroba je determinována alelami v jednom lokusu.
̶ Variantní alela, která vznikla mutací někdy v nedávné nebo vzdálené
minulosti a je většinou relativně málo častá, nahrazuje původní
„divokou“ („wild“) alelu na jednom nebo obou chromosomech.
̶ Má-li jedinec pár identických alel, říkáme, že je homozygot, pokud jsou
alely rozdílné, jedinec je heterozygot.
̶ Pokud se jedná o dědičnost vázanou na X, rozlišujeme u ženy tři
genotypy (XX, Xx, xx), u mužů jen dva hemizygoty (X0,x0)
̶ Monogenní choroby mají charakteristický způsob přenosu v rodinách.
Prof. Anna Vašků45
Monogenní nemoci
̶ Monogenní choroby jsou primárně, i když ne výlučně,
chorobami dětského věku.
̶ Méně než 10% z nich se manifestuje po pubertě a
pouhé 1% se objeví po skončení reprodukčního věku. I
̶ V populační studii na 1 milionu živě narozených dětí
byla incidence vážných monogenních chorob
odhadnuta na 0,36%, u 6-8% hospitalizovaných dětí se
uvažuje o monogenních chorobách.
Prof. Anna Vašků46
Polymorfismy v DNA
̶ Jako polymorfismy v DNA se označují přirozeně se
objevující změny v sekvenci DNA s více než jednou
variantou-alelou, s populační frekvencí více než 1 %.
Objevují se v průměru jednou na každých 1000 párů bází
genomové DNA.
̶ Asi 90 % z nich jsou polymorfismy se záměnou jednoho
nukleotidu (single nucleotide polymorphisms - SNP), jejichž
podstatou je substituce jedné báze.
̶ Většina těchto polymorfismů leží v nekódujících
(intronových) sekvencích nebo dokonce v intergenových
oblastech, na jejichž funkční význam existují odlišné
názory.
Prof. Anna Vašků47
Polymorfismy v DNA
̶ Kromě SNP se vyskytují také minisatelitní a mikrosatelitní
polymorfismy, které vznikají v důsledku variace v tzv.
tandemových repetitivních sekvencích. Minisatelitní
polymorfismy jsou obvykle dlouhé 0,1-20 kilobází, zatímco
mikrosatelitní často méně než 100 párů bazí.
̶ Většina mikrosatelitních polymorfismů jsou dinukleotidové
opakovací (repeat) sekvence, jako je např. opakování
motivu CA. SNP jsou obvykle bialelické (existují jen dvě alely),
minisatelitní polymorfismy multialelické (existuje více než dvě
alely).
̶ Ačkoliv většina polymorfismů je zřejmě funkčně neutrální,
část z nich zřejmě má alelicky specifické účinky na regulaci
genové exprese nebo funkce kódovaného proteinu, což
determinuje interindividuální variabilitu v biologických znacích
i vnímavost vůči nemoci.
Prof. Anna Vašků48
Vzácné alely a polymorfismy
Vzácné alely jsou „špatné“ („loss of function, gain of function“)
̶ Jsou často pod tlakem selekce
̶ Polymorfismy (> 1% frekvence v populaci)
̶ Význam:
̶ Zdroj vrozené variability genomu
̶ Faktor přežití vzhledem k patogenům?
̶ Jak vzácné mutace, tak polymorfismy jsou způsobeny genovými
mutacemi
Prof. Anna Vašků49
Germinativní vs. somatické mutace
̶ Germinativní mutace přítomny ve všech
buňkách. V průběhu života se nemění (genetická
predispozice?)
̶ Somatické mutace vznikají v somatických
buňkách v průběhu života (maligní transformace).
Prof. Anna Vašků50
Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci
̶ Za genetickou predispozici mnoha biologických
procesů, evolučních adaptací a tedy také tzv.
komplexních nemocí zřejmě odpovídají kombinace
určitých genů a určitých faktorů zevního prostředí.
̶ Interakční efekty a vliv vnějších faktorů však nutně
musíme očekávat i v případě mendelisticky děděných
nemocí, což se koneckonců projevuje ve všeobecně
známé lékařské zkušenosti se širším klinickým spektrem
příznaků stejného onemocnění.
Prof. Anna Vašků51
Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci
̶ Na odhalení nejobecnějších principů genetiky multifaktoriálních
nemocí se na rozdíl od genetiky nemocí mendelistických v současné
době stále ještě čeká. Také z tohoto důvodu zatím v klinické praxi
často kolísá názor na výsledky genetických studií, které se snaží odhalit
genetický podklad komplexních nemocí, od neodůvodněného
očekávání nad nalezenými geny velkého účinku až po velkou skepsi
vzhledem k existenci genetického podkladu v populaci četných
nemocí ( nad 1%), jako je v kardiologii např. esenciální hypertenze.
̶ Nemoci sporadické, familiární (tumory)- velký význam znalosti
rodokmenu
Prof. Anna Vašků52
Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci
̶ Jinak řečeno, v 21. století již musíme
počítat s tím, že fakticky každá choroba
má nějaké genetické pozadí, jehož podíl
na manifestaci dané choroby je různý.
Prof. Anna Vašků53
DNA markery
̶ U komplexních nemocí se ukazuje, že je možno asociovat alely mnohých
polymorfismů s výskytem komplexní nemoci nebo některými intermediálními
znaky onemocnění (hladiny proteinů, rodinná anamnéza aj.) statisticky
asociovat, čili přinejmenším najít genetický marker, s touto nemocí
asociovaný.
̶ Určitý genotyp nebo alela daného polymorfismu tak představuje vyšší (nižší)
riziko pro nemoc.

Odds ratio (OR):
Počet nemocných s riz. genotypem x počet zdravých bez riz. genotypu
Počet nemocných bez riz. genotypu x počet zdravých s riz. genotypem
Senzitivita, specifita (nad 80%) a síla testu (nad 80%).
Epigenetika
̶ = stabilní a heritabilní změny v genové expresi, které nezahrnují
změny v sekvenci DNA
̶ Epigenetické procesy řídí genovou expresi během buněčného
cyklu, vývoje a v odpovědi na modifikace prostředím nebo
biologickými faktory
Prof. Anna Vašků55
Prof. Anna Vašků56
Typy epigenetických procesů
1. Metylace DNA = kovalentní vazba metylových skupin na CpG
ostrůvky v DNA:
̶ Typicky jsou metylovány v netranskribujících se genech
̶ Typicky jsou sníženě metylovány v genech, které jsou
transkribovány
̶ Změna metylačních programů jako výraz dysregulace („rakovinný
program“)
̶ 5 typů metyltransferáz (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L a
DNMT2)
Prof. Anna Vašků57
Prof. Anna Vašků58
Typy epigenetických procesů
2. Postranslační modifikace
histonů
Nukleosom je základní jednotka
chromatinu skládající se z 146 bp DNA
obtočené kolem oktameru proteinů, který
se skládá ze dvou podjednotek všech 4
histonů : H2A, H2B, H3 a H4.
2 typy modifikací: acetylace a metylace
Prof. Anna Vašků59
Typy epigenetických procesů
3. Mechanismy založené na RNA
̶ Zralé mikroRNA (miRNA) jsou malé
jednořetězcové molekuly RNA, typicky s 22
nukleotidy.
̶ Poprvé byly identifikovány u organismu
Caenorhabditis elegans v roce 1993, dosud
identifikovány u mnoha druhů živočichů i rostlin.
̶ V lidském genomu bylo dosud identifikováno více
než 700 genů pro miRNA
(http://microrna.sanger.ac.uk/).
̶ Asi 30% lidských genů je patrně regulováno
miRNA.
Prof. Anna Vašků60
Acetylace histonů je katalyzována histon acetyltransferázami
(HATs) a deacetylace histonů histon deacetylázami (HDs nebo
HDACs).
Prof. Anna Vašků61
Role DNA metylace a histonové
modifikace v regulaci genů.
A. Metylace cytosinu v CpG párech
povolává proteiny obsahující methyl-CpGbinding
domain (MBD), jako jsou MeCP2. Pokud
se MBD naváže, vytváří komplex s histon
deacetylázami (HDAC) nebo přímo blokuje
vazbu transkripčních faktorů
B. MBD se nemohou vázat na hypometylovanou
DNA.
C. Acetylace pozitivně nabitých lysinových
amino skupin v histonech histonovými
acetyltransferázami (HAT) neutralizuje náboj a
uvolňuje vazbu negativně nabitých fosfátů v
DNA. Takto“relaxovaná“ DNA podporuje vazbu
a aktivní transkripci.
Prof. Anna Vašků62
Epigenetické modifikace nukleosomálních histonů a DNA, které regulují expresi
genů. Histonové modifikace kompaktně svinutého heterochromatinu nebo
relaxovaného transkripčně aktivního chromatinu. H, histone; K, lysine; me,
methylation; me3, trimethylation; ac, acetylation; DNA methylation silencing the
gene; meCpG, methylated Cytosine in Cytosine-Guanine dinucleotide sequences
within the DNA.
Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2012 Jul;15(4):323-9.
Prof. Anna Vašků63
The pathways affected by HDAC activity.
Stimson L et al. Ann Oncol 2009;20:1293-1302
© The Author 2009. Published by Oxford University Press on behalf of the European Society for
Medical Oncology. All rights reserved. For permissions, please email:
journals.permissions@oxfordjournals.org
Prof. Anna Vašků64
„Dostupnost“ chromatinu
̶ DNA je normálně svinuta do B-DNA= jeden pravotočivý závit na 10,5 bp. Toto svinutí
ovlivňují topoizomerázy, vazba proteinů, transkripce, replikace, změny v iontovém
složení.
̶ Zvýšené zavinutí („positive supercoiling stress“)
̶ Snížené zavinutí („negative supercoiling stress“)
̶ Euchromatin – relaxovaný, transkripčně aktivovatelný
̶ Heterochromatin –kondenzovaný, relativně nedostupný
Prof. Anna Vašků65
Acetylační a metylační modifikace
H3K9 regulují expresi srdečních
genů.
Signály srdečního stresu indukují
patologickou hypertrofii
prostřednictvím ztráty transkripční
represe modulované SIRT6 (=histon
acetyláza), kterou zajišťují geny pod
vlivem IGF (insulin-like growth
factor) (A, i) nebo prostřednictvím
reaktivace fetálních genů a
myokardiálních genů odpovídajících
na stres (modulováno KDM4A
=histon demetyláza (A, ii).
Trimetylace H3K9me3 pomocí
Suv39h1 (=metyl transferáza) a
následná represe genů buněčného
cyklu udržuje postmitotický fenotyp
zralých srdečních kardiomyocytů
(B).
Biochemical Society Transactions (2013) 41,
(789–796) (Printed in Great Britain)
Prof. Anna Vašků66
Genetické studie
̶ Základní debata nad genetickým podkladem nemocí logicky začíná od
strategie výběru tzv. kandidátních genů. Tato otázka je podstatně
jednodušší u mendelisticky děděných nemocí, kde se změněná funkce
jednoho genu snadněji identifikuje.
̶ Kandidátní gen může být asociován:
̶ s intermediálním fenotypem
̶ s klinickou manifestací nemoci
̶ s klinickou závažností nemoci
̶ s odpovídavostí nemoci na léčbu (farmakogenetika)
Genetické studie
̶ Dalším významným momentem je výběr statistické metodologie, která
zhodnotí sílu asociace genů s chorobami. Možnosti jsou v zásadě dvě:
linkage (vazebná) analýza a asociační studie. K detekci specifických
genetických oblastí a genů, které se účastní v transmisi nemoci, je
v principu možné použít obě metody.
̶ Linkage (vazebná) analýza testuje kosegregaci genového markeru a
fenotypu nemoci v rodině. Čili marker a nemoc se v dané rodině mají
vždy vyskytovat spolu.
Genetické studie
Asociační studie vyšetřují souvýskyt markeru a nemoci na populační
úrovni, tj. u nepříbuzných jedinců, obvykle srovnáním frekvencí
markerů u nepříbuzných nemocných a kontrolních subjektů (studie
case-control). Statistickou sílu asociace je možno dále zvýšit
obohacením o další kritéria, jako jsou klinické subtypy nemoci (studie
case-case), závažnost nemoci, časný začátek nemoci, rizikové
faktory pro nemoc včetně pohlaví a vhodné biologické znaky (např.
plasmatické hladiny cytokinů při asociaci genetických polymorfismů
v cytokinových genech; studie genotyp-fenotyp).
Zdraví čeští dobrovolníci středního věku (41-50 let)
Polymorfismus -3A/-4A v genu pro endotelin-1 (EDN1)
Kouření
0
20
40
60
%
Muži - kuřáci (102) Muži - nekuřáci (90)
Muži - kuřáci (102) 53 45 2
Muži - nekuřáci (90) 37 50 13
3A3A 3A4A 4A4A
Pg=0,003
Pa=0,003
[%]
Genotypy 3A3A a 3A4A jsou častější u zdravých mužů kuřáků oproti mužům
nekuřákům (OR = 7,69, 95% KI 1,67-35,38, P=0,002).
Chronické srdeční selhání
Polymorfismus RXR 39526 A/AA
Krevní skupiny ABO
0
50
100
%
Pacienti s CHF - KS A(84) 95 5 0
Pacienti s CHF - KS nonA(117) 79 20 1
A/A A/AA AA/AA
Pg=0,006
Pa=0,002
Alela AA přináší 5x vyšší OR pro pacienty s CHF a krevní
skupinou nonA (B+AB+O): OR=5,16; 95%KI 1,72-15,50;
P=0,0009
Chronické srdeční selhání
Polymorfismus -790T/G v genu pro MMP-2
Celkový cholesterol
0
50
100
%
Muži s CHF, TC < 5 mmol/l (58)
Muži s CHF, TC > 5 mmol/l (58)
Muži s CHF, TC < 5
mmol/l (58)
30 34 36
Muži s CHF, TC > 5
mmol/l (58)
10 40 50
TT TG GG
Pg=0,03
Pa=0,01
Genotypy TG + GG přinášejí 3,59x vyšší OR pro muže s CHF a vyšší hladinou
celkového cholesterolu: OR=3,59; 95% KI 1,30-9,93; P=0,009
Chronické srdeční selhání
Polymorfismus -735C/T v genu pro MMP-2
Hypertenze
Celkový cholesterol
0
50
100
% Muži s CHF, normotenzní, TC< 5 mmol/l (45)
Muži s CHF, normotenzní, TC > 5 mmol/l (47)
Muži s CHF, normotenzní, TC< 5
mmol/l (45)
76 24 0
Muži s CHF, normotenzní, TC > 5
mmol/l (47)
91 4 5
CC CT TT
Genotyp CT přináší 7,28 x vyšší OR pro muže s CHF, normotenzí a vyšší hladinou
celkového cholesterolu: OR=7,28; 95% KI 1,51-35,03; P=0,006
Pg=0,01
Pa=0,171
Chronické srdeční selhání
Asociovaný genotyp 8002 G/A a -3A/-4A EDN-1
Big endotelin
0
10
20
30
40
50
AA3A3AAA3A4AAA4A4AAG3A3AAG3A4AAG4A4AGG3A3AGG3A4AGG4A4A
Big endotelin < 0,7 pmol/L
(19)
Big endotelin > 0,7 pmol/L
(84)
Asociovaný genotyp AG3A4A nese 5x vyšší OR pro
chronické srdeční selhání ve skupině
s nízkou hladinou big endotelinu oproti skupině
pacientů s vysokou hladinou:
OR = 5,38;
95% KI = 1,75-16,58;
P= 0,005
Chronické srdeční selhání
Dilatační kardiomyopatie (DCM), plicní městnání (PCG)
3´TACE
0
50
100
%
MM 14 56
MN 28 33
NN 59 11
Pacienti s DCM (29), PCG=1 Pacienti s DCM (9), PCG=2
Genotyp MM nese 8x vyšší OR pro DCM s PCG=2 oproti DCM s
PCG=1: OR=7,81, 95% KI = 1,45-42,17, P=0,02
Pg=0,02
Pa=0,0007
Copyright ©2006 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.
Davies, S. M. Hematology 2006;2006:111-117
Figure 2. Relationship between genome-wide and candidate gene pharmacogenetic studies
Studie kandidátních genů
▪Racionální (patofyziologická) selekce genů bez možnosti
objevit nové (je možno ovšem objevit nové klinicky validní
markery uvnitř genu)
▪Limitovaný počet genů snižuje riziko falešné pozitivity výsledků
▪Redukované náklady, pokud je tento přístup úspěšný (vede k
signifikantním výsledkům=klinicky validním markerům).
▪Je možno se dopracovat statisticky adekvátně velkým
souborům vyšetřených osob
Srovnání strategií genetického výzkumu:
kandidátní geny vs. „genome-wide „ studie
Studie „genome-wide“
▪Analýza celých genomů může vést k identifikaci
dosud neznámých genetických souvislostí
▪Zvyšuje se riziko nepravdivého výsledku
▪Zvýšené náklady, také na základě zvýšeného počtu
signifikantních výsledků
▪Statisticky adekvátně četných souborů je možno
dosáhnout jen obtížně
Srovnání strategií genetického výzkumu:
kandidátní geny vs. „genome-wide „ studie
Personalizovaná medicína
̶ Umožňuje zlepšovat účinnost terapie na základě vysokého respektu k
interindividuální variabilitě pacienta
̶ Zdroje:
̶ Klinicky relevantní znalost genetického podkladu nemocí
̶ Buněčná terapie
̶ Genová terapie
̶ Farmakogenetika
̶ Farmakoekonomické aspekty
Prof. Anna Vašků80
Personalizovaná medicína?!
̶ Také v souvislosti s komplexními nemocemi hledáme vhodné genetické/epigenetické
biomarkery, ať už diagnostické, prognostické nebo prediktivní.
̶ Prediktivní biomarkery jsou velmi významné v oblasti farmakogenetiky
(farmakogenomiky), protože nám mohou pomoci identifikovat pacienty, u nichž
bude lék účinný a zároveň nebude mít významnější vedlejší účinky
(farmakodynamika).
̶ Protože v případě komplexních nemocí se jedná u klinicky manifestních jedinců o
souhru genetických a epigenetických faktorů, nedá se objektivně předpokládat
existence jen jednoho dostatečně „silného“ biomarkeru dostatečně vystihujícího
farmakogenetické aspekty léčby onemocnění. Musíme tedy na základě statistických
lineárních a nelineárních modelů hledat mnohočetné kombinované biomarkery,
které budou dostatečně klinicky specifické i senzitivní. Dále bude potřeba srovnat
různé úrovně regulací (DNA, transkriptom, proteom, metabolom al.) pomocí
integrální multi“omické“ biologické strategie („integromika“)
Prof. Anna Vašků81
Personalizovaná medicína?!
̶ Mantrou personalizované medicíny, tedy „léčby na míru“ v léčbě komplexních
nemocí je „správná dávka správného léku ve správné indikaci správnému
pacientovi ve správný čas“. Logika tohoto přístupu je jasná: pokud rozumíme
etiopatogenezi onemocnění, můžeme ho úspěšně léčit. V současné době už se
blížíme k porozumění molekulární patofyziologii mnohých komplexních nemocí, což
nám umožní identifikovat cesty řídící klinickou manifestaci onemocnění a klíčové
cílové proteiny. Co se týče vyšetření vrozeného genetického základu (germinativní
alely, přítomné ve všech buňkách organismu), je možné je vyšetřovat i „preventivně“,
před vlastní klinickou manifestací komplexní nemoci, zejména v rodině s pozitivní
anamnézou této nemoci. Tuto možnost výrazně podporuje technologický rozvoj
molekulárně biologické diagnostiky („next generation sequencing“), která dnes
umožňuje determinovat celou sekvenci DNA jedince během 24 hod.
Prof. Anna Vašků82
Personalizovaná medicína?!
̶ V medicíně byly prokázány tisíce monogenních nemocí, u nichž je
genetický marker součástí diagnostiky a v mnohých případech
implikuje i nejvhodnější léčbu.
̶ U komplexních nemocí se při jejich klinické manifestaci významně
uplatňují nejen faktory genetické (vrozené) predispozice, ale také
mocný vliv faktorů prostředí. Ty se „překládají“ do změn exprese genů,
tedy do účinků epigenetických, které jsou celoživotně zdrojem
subakutní až chronické adaptace na rychle se měnící charakteristiky
prostředí, ve kterém žijeme.
̶ Statický model DNA matrice je tedy stále dynamicky opracováván
tak, že buňky mění své transkripční profily na základě relativně
jednoduchých změn DNA (metylace a acetylace DNA, metylace
histonů, mikro RNA a další mechanismy epigenetických změn).
Klíčové složky farmakogenetiky
Farmakogenetika - cíle
̶ Popsat vliv dědičnosti na odpověd organismu na různé látky
s využitím interdisciplinárního přístupu
̶ Farmakogenomika
̶ Farmakodynamika: popisuje žádoucí či nežádoucí účinky
léků na organismus
(lék→ organismus)
̶ Farmakokinetika: se zabývá hladinami léků a jeho
metabolitů v různých tkáních a vstřebáváním léků, jejich
distribucí, metabolismem a eliminací
(organismus → lék)
Klinický potenciál farmakogenetiky
Farmakodynamika x farmakogenomika
̶ Různá odpověď pacientů téže populační skupiny na tentýž lék
̶ Různá odpověď pacientů na kombinace týchž léků
̶ Geneticky determinovaná přecitlivělost na danou látku
Farmakokinetika
̶ Absorpce (GIT, motilita?, pH žaludeční sekrece?, intestinální
flóra?, místo absorpce)
̶ Distribuce (frakce léčiva vázaná na bílkoviny séra, afinita
jednotlivých léčiv k BS – fenylbutazon-warfarin)
̶ Metabolismus (indukce, inhibice metabolizujících enzymů...
rifampicin-orální kontraceptiva)
̶ Eliminace (pH moči, lithium-thiazidy)
Farmakokinetika x farmakogenomika
̶ Rozdílné hladiny léku v séru pacientů téže skupiny, váhy, atd. po
podání stejné dávky
̶ Rychlejší x pomalejší nástup účinku
̶ Různá doba eliminace léčiva z organismu
̶ Interakce (alkohol, tabák, barbituráty)
Farmakogenetika a vývoj léků
̶ Nutnost přesné diagnózy (k fenotypicky podobným stavům
mohou vést různé patobiochemické mechanismy).
̶ Individuální odpověď jedince na terapii může záležet na genech,
vstupujících do interakce s metabolismem léku nebo jeho
působením.
̶ Polovina všech dosud používaných léků je metabolizována
enzymy P450.
P450
̶ CYP3A4 – 50% metabolizovaných léků
̶ CYP2D6 – 20%
̶ CYP2D9 + CYP2D19- 15 %
̶ CYP2D6, CYP2D9, CYP2D19 a CYP2A6 byly prokázány jako
funkčně polymorfní
Copyright ©2006 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.
Davies, S. M. Hematology 2006;2006:111-117
Figure 1. The hoped-for pathway of development of personalized medicine for the treatment
of leukemia
Chronické srdeční selhání
Farmakogenetické rozdíly v dávkování beta blokátorů a ACEI- I/D ACE
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Others (177) Patients with lower than
50% dose of BB and/or
ACEI (60)
DD
ID
II
Pg=0,006, Pa=0,009
OR pro genotyp II u pacientů
s nižší než 50% dávkou proti
doporučené je (BB+ACEI) je
2,84, P=0,002
Model terapie hypertenze (podle Lindpaintnera, březen 2003)
A=fyziologický stav: tři molekulární mechanismy (M1, M2, M3) se podílejí na
determinaci znaku (TK), B=hypertenze D1: selhání M1 (příčina/účast)
C=hypertenze D1: kauzální terapie T1 (cílená na M1), D= hypertenze D3: selhání M3 (příčina
účast), E=hypertenze D3, léčení T1: terapie není kauzální, F=hypertenze D1, paliativní
terapie T2, cílená na M2, G=hypertenze D1, terapie T2, refrakterní varianta na T2 v M2, H=
fyziologický stav: odlišný podíl M1 a M2 na normálním znaku, I = varianta hypertenze D1:
selhání M1 J =varianta hypertenze D1: terapie T2
Worldwide haplotype distribution. The frequencies of 7 globally distributed haplotypes for 6 SNPs
in the VKORC1 gene are represented by pie charts over the country of origin of population samples
from which they were derived. The SNPs are listed in the order in which they occur along the
VKORC1 gene: −1639G>A, 497T>G, 1173C>T, 1542G>C, 2255C>T, 3730G>A. All haplotypes
occurring at frequencies of less than 2.5% in all population samples tested are grouped together in
the “Other” category. For the United States, the population samples are broken down into white (W),
black (B), and Mexican American (MA) subgroups and by the study under which they were
collected: International Warfarin Pharmacogenetics Consortium or National Health and Nutrition
Examination Survey III. Blood. 2010 May 6; 115(18): 3827–3834.
Polymorfismy v genech CYP2C9, VKORC1 a CYP4F2 byly asociovány se schopností udržovat adekvátní
hladinu antikoagulace
Overview of genetic associations with warfarin dose requirements
The primary genes contributing to warfarin dose requirements are vitamin K
epoxide reductase complex 1 (VKORC1) and cytochrome P450 2C9
(CYP2C9). The CYP2C9 enzyme metabolizes the more potent S-enantiomer
of warfarin, while VKORC1 is the target protein for warfarin. Specifically,
warfarin inhibits VKORC1, thus preventing reduction of vitamin K to vitamin
KH2, a necessary co-factor for carboxylation and activation of clotting
factors. The gene for CYP4F2, which metabolizes vitamin K, provides a minor
contribution to dose requirements, particularly in European and Asian
populations.
A single polymorphism in the VKORC1 regulatory region, c.-1639G>A
(rs9923231), predicts dose requirements across ethnic groups. The minor A
allele at this position is associated with approximately twofold lower gene
expression and significantly lower warfarin dose requirements compared to
the G allele. The frequency of the A allele varies by ethnicity with the
highest frequency in Asians, intermediate frequency in Europeans, and the
lowest frequency in African Americans. Differences in allele frequency
account for the lower dose requirements generally observed in Asian
populations and higher requirements in Africans compared to Europeans.
Trends in Cardiovascular Medicine
Volume 25, Issue 1, January 2015, Pages 33-41
Děkuji vám za pozornost
?
Prof. Anna Vašků98