Laboratorní diagnostika diabetu mellitu Ondřej Wiewiorka 2023 https://doi.org/10.2337/dc19-SppC01 Diabetes mellitus (DM) •Heterogenní onemocnění, jehož hlavním znakem je nedostačující regulace glykémie 1.Diabetes mellitus I. typu (imunitně podmíněný; idiopatický) 2.Diabetes mellitus II. typu 3.Gestační diabetes mellitus 4.Ostatní specifické typy diabetu •Akutní komplikace •(ketoacidóza, laktátová acidóza, hyperosmolarita, hypoglykémie) •Chronické komplikace •(retinopatie, nefropatie, neuropatie, kardiopatie) American Diabetes Association, 2. Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes—2019, Diabetes Care. 42 (2019) S13–S28. doi:10.2337/dc19-S002. Created by Isaac Yonemoto created with en:pymol, en:inkscape, and en:gimp from NMR structure 1ai0 in the en:pdb. Ref: Chang, X., Jorgensen, A.M., Bardrum, P., Led, J.J. Inzulín DM1- autoimunitní destrukce b-buněk – totální deficientce inzulínu DM2 – postupná ztráta sekrece b-buněk v důsledku rezistence vůči inzulinu DM gestační – diagnostikován ve druhém nebo třetím trimestru, přičemž diabetes nebyl přítomný před těhotenstvím Ostatní specifické DM – novorozenecký diabetes, maturity-onset diabetes of the young [MODY], diabetes exokrinního pankreatu (cystická fibróza a pankreatitida); lékově indukovaný diabetes (glukokortikoidy, léčba HIV/AIDS, transplantace) Dřívější klasifikace, že DM1 je pouze u mladých a DM2 pouze u starších neplatí... Obě věkové skupiny mohou onemocnět obým druhem DM Maillardova reakce 1912 Louis-Camille Maillard Erytrocyty přijímají GLU skrze GLUT1 transportér na inzulinu nezávislý. Erytrocyty mají receptory pro insulin – aktivace 6-fosfofruktokinásy (PFK). AGEs, RAGEs 2-(2-furoyl)-4(5)-furanyl-1H-imidazole (FFI), imidazolone, N-ε-carboxy-methyl-lysine (CML), N-ε-carboxy-ethyl-lysine (CEL), glyoxal-lysine dimmer (GOLD), methyl-glyoxal-lysine dimer (MOLD) AGEs, RAGEs •Důsledky AGEs •Albumin -> snížená schopnost vázat volné mastné kyseliny, aktivace a agregace trombocytů, tvorba volných radikálů •Kolagen -> fibróza, rozvoj aterosklerózy, stárnutí kůže •Fibrinogen -> snížená schopnost fibrinolýzy, tvorba slabší fibrinové sítě, vaskulární dysfunkce •Imunoglobuliny – autoimunní poruchy, záněty, imunosuprese uDůsledky aktivace RAGEs uProgradace zánětlivé reakce (fyziologicky reakce s S100A12) u u Diagnóza diabetu •Glukóza •Na lačno (alespoň 8 hodin bez příjmu potravy) •≥ 7,0 mmol/l •Náhodný odběr nebo OGTT (75g glukózy ve vodě, odběr po 2 hodinách) •≥ 11,1 mmol/l •HbA1c •≥ 48 mmol/mol Dle současného doporučení •O diagnóze lze rozhodnout pouze na základě opakovaného odběru! • Dle ADA (2019) •O diagnóze lze rozhodnout z jednoho odběru, pokud je hyperglykémie nezaměnitelná (unequivocal) • Porucha glukózové tolerance (prediabetes) •Termín používaný u osob se zvýšenou glykémií, ale ne tolik, aby překročili kritéria pro diagnózu diabetu •-> riziková populace pro diabetes 2. typu (≥ 45 let;BMI ≥ 25 kg/m2) •u obézních adolescentů (BMI ≥ 85 percentilu) •FPG (5,6-7 mmol/l) -> OGTT (75g/2hod) = 7,8-11 mmol/l •HbA1c (39-48 mmol/mol) • •-> riziko rozvoje kardiovaskulárních chorob • Dle ADA (2019) O diagnóze lze rozhodnout z jednoho odběru, pokud je hyperglykémie nezaměnitelná (unequivocal) Laboratorní diagnostika •Glykémie •HbA1c •Glykovaný albumin • Stanovení glykémie •Referenční metoda: ID-GC/MS (izotopová diluce a stanovení GC s MS) •Certifikovaný referenční materiál: SRM 909 NIST, NIST/SRM 917, NIST/SRM 965 (USA) •Alespoň 2x ročně účast v EHK • • Stanovení glykémie Mezilehlá preciznost CV < 2,5 % Pravdivost (Bias) B < 2,0 % Celková chyba TE < 7,0 % Metrologická návaznost referenční metoda Intraindividuální biologická variabilita 4,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 2,5 Interindividuální biologická variabilita 6,9 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 2,2 Celková biologická variabilita 8,9 Celková chyba odvozená z biologických variabilit 6,9 qDoporučení ČDS a ČSKB; vydáno v únoru 2012, aktuální verze 2020 q www.westgard.cz Stanovení glykémie •Analyzovaný materiál: •B, S, P, U, CSF, výpotek •Preanalytické požadavky: •pro diagnostiku diabetu mellitu je nevhodný odběr krve bez antiglykolitických přísad; ČSKB a Česká diabetol. společnost (2020) doporučují: •odběr krve nalačno (min. 8h lačnění) •stanovení v plazmě žilní krve (EDTA + NaF); (EDTA + NaF + citrát sodný) •oddělení plazmy od krevních elementů ideálně do 60 min po odběru •při sběru moče uchovávat moč do doby analýzy při 4-8°C, je třeba zabránit bakteriální kontaminaci •Hexokinázová metoda • • •Glukózaoxidázová metoda Stanovení glykémie –plazma/sérum/moč/CSF Glukóza v moči •glykosurie: stanovení ztráty glukózy močí •pro diagnostiku DM není stanovení doporučeno •má jen orientační význam •prakticky byla nahrazena selfmonitoringem glykémií • •Spektrofotometricky nebo orientačně suchou chemií (glukózaoxidázová reakce) Stanovení glykémie •Elektrochemické metody •Clarkova kyslíková elektroda •Biosenzory s membránou s GOx • q automatický stolní analyzátor ke stanovení glukózy a laktátu (Biosen) q lanceta q glukometry Glykémie elektrochemicky •Princip: přímé elektrochemické stanovení glukózaoxidázou • 1. glukóza + O2 glukonolakton + H2O2 (glukózaoxidáza) • 2. elektrochemická redukce H2O2 na H2O • 3. vzniklý elektrický proud nebo náboj je úměrný koncentraci glukózy (amperometrické nebo coulometrické stanovení) • H2O2 2H+ + O2 + 2e- reakce na anodě • • 2e- + 2H+ + ½ O2 H2O reakce na katodě • Glykémie elektrochemicky •Princip: přímé elektrochemické stanovení glukózadehydrogenázou • 1. glukóza + NAD + glukonolakton + e + NADH (glukózadehydrogenáza) • 2. glukóza + e-akceptor glukonolakton + redukovaný e-ac (FAD dependentní GLU dehydrogenáza) • •Jako transducery elektronů slouží např. hexokyanoželezitan •Glukometry nemocniční •AccuChek Inform, Hemocue, Stat Strip •Umožňují přenos dat do LIS, monitoring kontroly kvality, do jisté míry vzdálenou správu http://www.hemocue.com/~/media/hemocue-images/hemocuedotcom-images/front-page-home/27853.jpg?mw=676 &mh=290 •Glukometry: •jsou určeny k selfmonitoringu pacientů s DM, dále pro ambulantní měření koncentrace glukózy •použití glukometrů k dg. DM se nedoporučuje •proti referenční metodě nesmí chyba měření překročit: • ± 0,83 mmol/l pro koncentrace < 5,6 mmol/l • ± 15% pro koncentrace ≥ 5,6 mmol/l •kontroly osobních glukometrů srovnáním s měřením v laboratoři se doporučuje provádět v pravidelných časových intervalech minimálně jednou ročně • Glykovaný hemoglobin •Vazba na N-terminální valin betařetězce hemoglobinu • • •rutinní a efektivní nástroj sledování průběhu DM (diabetu) •HbA1c ukazatel dlouhodobé průměrné koncentrace glukózy v krvi (období cca 6-8 týdnů nazpět) umožňuje posoudit dlouhodobou kompenzaci diabetu •diagnostické kritérium DM •kontrola terapie •včasné odhalení hrozících komplikací •hodnocení vyšetření: • Glykovaný hemoglobin HbA1c vs. glykémie •není třeba konzervovat krev (větší stabilita) •menší intraindividuální variabilita (CV<2%) •HbA1c není ovlivněn krátkodobou glykémií •nemocný nemusí být lačný •využití pro diagnostiku i kontrolu léčby • Jednotky HbA1c •od 1.1. 2012: mmol/mol dle IFCC • •V USA % (NGSP/DCCT) používají se paralelně, přepočet jednotek dle vzorce • • • • •Preanalytické požadavky: •Analyzovaný materiál: B – odběr do EDTA •stabilita: 2d (+20 až +25°C); 1 týden (+4 až +8°C); 1rok (<-20°C lépe při -80°C) •Poznámky: •snížená hodnota doby života erytrocytů •hemoglobinopatie, karbamylace (uremičtí pacienti) – ovlivnění koncentrace HbA1c v rutinních metodách • Požadavky na analytickou kvalitu Mezilehlá preciznost CV < 3 % Pravdivost (Bias) B < 2,0 % Celková chyba TE < 5,0 % Metrologická návaznost referenční metoda LC-ESI/MS qDoporučení ČDS a ČSKB; vydáno v únoru 2012, aktuální korekce 2020 Intraindividuální biologická variabilita 1,9 Preciznost odvozená z biologických variabilit 1,0 Interindividuální biologická variabilita 5,7 Pravdivost odvozená z biologických variabilit 1,5 Celková biologická variabilita Celková chyba odvozená z biologických variabilit 3,1 q www.westgard.cz HbA1c – metody stanovení •Referenční metody (2001): •1) izolace a hemolýza erytrocytů (+ odstranění labilních pre-HbA1c) •2) enzymové štěpení hemoglobinu (endoproteináza Glu-C) •3) analytické měření (detekce glykovaných hexapeptidů) pomocí •a) HPLC/ESI-MS: •Glykovaný hemoglobin (HbA1c) je ze směsi peptidů separován, detekován, identifikován hmotnostní spektrometrií a kvantifikován na podkladě rozdílných hodnot m/z. Z poměru hodnot m/z analyzovaných vzorků a kalibrátorů se vypočítá hodnota HbA1c. •b) HPLC/CE/UV: •První separace se provede pomocí HPLC, jednotlivé frakce se sbírají, následuje další separace této směsi pomocí CE. Glykovaný a neglykovaný hexapeptid jsou odděleny na základě různých elektromigračních časů a kvantifikovány UV detektorem. HbA1c – rutinní metody stanovení •Kapalinová chromatografie s výměnou iontů (IEC) •separace hemoglobinů a jeho složek na slabě kyselých ionexech •jednotlivé frakce hemoglobinu jsou rozděleny podle jejich různých fyzikálně-chemických vlastností (velikost náboje) v měnícím se prostředí (změna koncentrace iontů, změna pH) •frakce se po rozdělení detekují v mobilní fázi detektorem, který měří absorbance při 415 nm •koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu podle kalibrační křivky pomocí softwaru chromatografu • •HPLC (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie) • HbA1c – rutinní metody stanovení q HPLC HbA1c – rutinní metody stanovení q HPLC 34 HbA1c – rutinní metody stanovení q HPLC Biorad - Variant Biorad – D10 HbA1c – rutinní metody stanovení HA-8180V ADAMS™ A1c •2. Doporučené rutinní metody - elektroforetické: • elektroforéza v agarózovém gelu (ELFO) •izoelektrická fokusace (IEF) • kapilární elektroforéza (HPCE) • HbA1c – rutinní metody stanovení q CE Sebia - Capillarys HbA1c – rutinní metody stanovení HbA1c – rutinní metody stanovení •Chromatografické: •Afinitní chromatografie (aminofenylboronátová): •založena na interakci glykovaného hemoglobinu s imobilizovaným boronátovým aniontem •po eluci neglykovaných frakcí hemoglobinu, dojde k uvolnění vazby a po eluci se stanoví hemoglobinové frakce detektorem, který měří absorbance při 415 nm •koncentrace HbA1c se zjistí z velikosti plochy příslušného píku na chromatogramu • HbA1c – POCT q Boronátová afinitní chromatografie/ fotometrie Infopia Clover U nás v současnosti nejčetnější HbA1c – POCT q Boronátová afinitní chromatografie/ fotometrie Alere (Abbott) - Afinion FDA schválila používání pro diagnózu diabetu mellitu 2. typu HbA1c HbA1c – rutinní metody stanovení (fructosylvalineoxidase) Direct enzymatic HbA1c method HbA1c HbA1c – rutinní metody stanovení HbA1c – POCT q Imunochemický (aglutinace) Siemens - DCA Vantage Pozitivní hodnocení v rámci NGSP Latex enhanced immunoassay method HbA1c - nevýhody • doba života erytrocytů (120 ± 10 d) ! • přítomnost vzácnějších typů hemoglobinu (1165 variant Hb, např. HbS, HbC, HbE, HbD) • hemolýza, ikterus • těžké krvácení • věk, rasa, terapie,… • C-peptid a inzulin Stanovení C-peptidu a inzulinu není zakotveno v žádném doporučení pro diagnostiku diabetu a nemá význam při rutinním sledování pacientů s DM. Stanovení C-peptidu se provádí při rozhodování o vhodnosti volby terapie inzulinem u diabetu 2. typu, tj. při podezření na selhání sekrece inzulinu. Vyšetření inzulinu má význam při podezření na inzulinovou rezistenci u syndromu polycystických ovárií a při diagnostice inzulinomu. C-peptid a inzulin • Standardizace probíhá •Používají se imunoanalytické metody •C-peptid – standard WHO IRR 84/510 • • • • Autoprotilátky •Nejsou doporučovány k diagnóze diabetu •Jsou vhodné při podezření na kontrolu původu DM (LADA) • •Kombinované vyšetření 3 autoprotilátek – anti IAA, anti-GAD a anti IA-2 Glykovaný albumin •V doporučeních není zmiňován •Lze použít při snížení životnosti erytrocytů (nedostatek Fe, B12; hemolytická anémie, gestační diabetes...) •Glykace na ε-aminoskupinách lyzinu (12 vazebných míst) •Enzymatická metoda zakončená Trinderovou reakcí + stanovení celkového albuminu bromkresolovým purpurem •-> přepočet na % podíl •Lucica GA-L (Asahi Kasei Pharma) ;quantlLab IL (Werfen); Ref. Metoda: ID-LC-MS/MS Refereční materiál: JCC RM611 Albumin v moči •Včasná detekce predikuje diabetickou nefropatii •Mikroalbuminurie •Doporučené vyšetření 1x ročně u diabetiků • • Děkuji za pozornost •