Laboratorní diagnostika v těhotenství Jana Flášarová OKB FNB Brno 10.2.2019 Laboratorní vyšetření v těhotenství Laboratorní vyšetření do 14. týdne (14+0): • stanovení krevní skupiny AB0 + RhD, • screening nepravidelných antierytrocytárních protilátek, • stanovení hematokritu a počtu erytrocytů, leukocytů i trombocytů, hladiny hemoglobinu, • sérologické vyšetření HIV, HBsAg a protilátek proti syfilis, • glykémie na lačno. Orální glukózo-toleranční test (24+0 – 28+0): (blíže viz Doporučení k provádění screeningu poruch glukózové tolerance v graviditě). Laboratorní vyšetření (27+1 – 32+0): • stanovení hematokritu a počtu erytrocytů, leukocytů i trombocytů, hladiny hemoglobinu • (sérologické vyšetření HIV, HBsAg a protilátek proti syfilis se provádí pouze výběrově). oGTT a diagnostika gestačního diabetu Používá se zátěž 75 g glukózy a hodnotí se koncentrace glukózy v plazmě před zátěží, 1 a 2 hodiny po zátěži. Gestační diabetes je laboratorně diagnostikován, je-li dosaženo aspoň jednoho ze tří uvedených kritérií:  FPG ≥ 5,1 mmol/l  P-glukóza po 1 hodině ≥ 10,0 mmol/l  P-glukóza po 2 hodinách ≥ 8,5 mmol/l oGTT se provádí ve 24. - 28. týdnu gravidity u všech těhotných žen, u nichž byl screening GDM na začátku těhotenství negativní. oGTT Gynekologická a perinatologická péče o GDM • I. GDM s nízkým rizikem = GDM splňující všechny následující podmínky: - léčba pouze dietou nebo malými dávkami metforminu (do cca 1000 mg/den) nebo malými dávkami inzulinu (do cca 10 j/den) - uspokojivá kompenzace - eutrofický plod podle vyšetření ultrazvukem - bez dalších přidružených rizik • II. GDM se zvýšeným rizikem = GDM splňující kteroukoliv z následujících podmínek: - léčba vyššími dávkami inzulinu (nad cca 10 j/den) nebo vyššími dávkami metforminu (nad cca 1000 mg/den) - neuspokojivá kompenzace - abnormální růst plodu podle vyšetření ultrazvukem - přidružené riziko, např. obezita (BMI pregestačně ≥ 30), hypertenze, nadměrný hmotnostní přírůstek matky v těhotenství Hlavní perinatální rizika pro novorozence matek s GDM riziko etiopatogeneze hypoglykémie Přetrvávající hyperinzulinismus v postnatálním období, inhibice glykogenolýzy a glukoneoge-neze, snížená dostupnost alternativních zdrojů energie Hypertrofie (hmotnost nad 95 percentil), makrosomie plodu (hmotnost 4000g), organomegalie, hypertrofická kardiomyopatie Intrauterinní hyperinzulinismus, stimulace růstových faktorů Porodní trauma Hypertrofie plodu Hypotrofie (IUGR, SGA) Hrozící předčasný porod Dysfunkce placenty Hypokalcémie, hypomagnezémie Přechodný hypoparathyreoidismus, asfyxie Syndrom dechové tísně (RDS) Nižší produkce surfaktantu pneumocyty II. řádu Perinatální asfyxie Vaskulární poškození placenty, vyšší hodnoty glykovaného hemoglobinu, vyšší konzumpce kyslíku plodem, preeklampsie Hyperbilirubinémie, polycytémie, hyperviskózní sy. Stimulace erytropoézy hypoxií, inzulinem a dalšími faktory, zvýšený rozpad erytrocytů Trombózy Hyperviskózní syndrom, snížená hladina faktorů C, S, AT III. U dětí matek s GDM jsou morfologické projevy přechodné a v průběhu času (měsíce) dochází k jejich vymizení. Rizika z pohledu dlouhodobého neurologického vývoje těchto novorozenců jsou zvýšená (zvláště pokud dojde k těžké nebo dlouhodobé hypoglykémii). Jsou popsány neuropsychické odchylky nejrůznějšího typu, v dospělosti pak mají větší riziko metabolického syndromu (obezity, kardiovaskulárních a cerebrovaskulárních chorob a diabetu). Screening thyreoidálních poruch v těhotenství • Význam jodu v těhotenství  Dostačující přívod jodu se uvádí pro běžnou dospělou populaci hodnotou 150 μg/den.  Těhotenství (a také kojení) mění situaci v tom smyslu, že je nutno zajistit dva organizmy (těhotnou ženu a vyvíjející se plod). Samo těhotenství zvyšuje spotřebu jodu u gravidní ženy vlivem na zvýšenou potřebu tyreoidálních hormonů, změnami koncentrace přenosových vazebných proteinů (především TBG), zvýšeným vylučováním jodu močí při zvýšené glomerulární filtraci.  K nedostatku jodu může přispět i změna životosprávy těhotné ženy, zejména doporučované omezení solení (jodovaná sůl je u nás a ve většině zemí převažujícím a nejdůležitějším zdrojem jodu). Na zvýšené potřebě jodu v těhotenství se podílí vyvíjející se plod dvěma základními mechanizmy: 1. spotřebovává hormony štítné žlázy, které získává z organizmu matky cestou placentárního oběhu, 2. štítná žláza plodu začíná zhruba od 12.−14. týdne gravidity produkovat hormony štítné žlázy. • V těhotenství vzhledem ke zvýšené potřebě jodu stoupá hranice minimálního přívodu na 250 μg denně. Jod v graviditě a nepříznivé důsledky jodopenie • Optimální přísun jodu 250 μg/den • Horní hranice přívodu jodu Jodurie 500 (600)* μg/l • Nepříznivé důsledky jodopenie • Matka Růst a nodulizace strumy Komplikace gravidity: potrat, předčasný porod poruchy vývoje placenty Poporodní změny: poruchy laktace (?) • Plod Odumření (vzácně) Poruchy růstu a diferenciace (vrozené vady?) Poruchy diferenciace CNS Psychické změny Poporodní změny: zvýšená morbidita, mortalita (?) Screening thyreoidálních poruch v těhotenství Načasování screeningu  Závažnou a diskutovanou otázkou je načasování screeningu. Štítná žláza plodu začíná tvořit tyreoidální hormony od 12. gestačního týdne, nicméně až do 18.−20. týdne je sekrece nedostatečná a plod je závislý na mateřském tyroxinu. Kritické období vývoje CNS spojené s radiální migrací neuronů do mozkové kůry začíná již v 11. gestačním týdnu (17. Auso et al., 2004), možná i dříve. Plod je tedy do 12. týdne zcela a později minimálně částečně závislý na sekreci tyroxinu matkou.  Podle doporučení je vhodné, aby žena plánující graviditu neměla TSH v krvi vyšší než 2,5 mIU/l ( Stagnaro-Green et al., 2011); přesněji řečeno by TSH nemělo být vyšší než je horní limit dané metody snížený o 1,5 mIU/l, nebo nejlépe horní limit normálního rozmezí pro 1. trimestr gravidity, pokud jsou normy pro danou metodu pro těhotné ženy k dispozici  V případě těhotenského screeningu je optimální odběr v 5.−6. týdnu gravidity a má zahrnout kromě TSH vždy i Anti- TPO. TSH (a rovněž FT4) může být v této časné fázi těhotenství i falešně negativní. Druhou možností je využít prvního krevního odběru v těhotenství v rámci screeningu vrozených vývojových vad a HBsAg v 1. trimestru (9.−11. týdnu gravidity).  Metody stanovení imunoanalýza ( RIA, EIA, FIA, LIA) PREEKLAMPSIE • Postihuje 4-8 % těhotných • Typickým projevem zvýšený krevní tlak, bílkovina v moči • Symptomy: bolest hlavy, poruchy vidění, rychlý váhový přírůstek, nauzea, otoky končetin a obličeje • zvýšené jaterní testy, urea, kreatinin, kys.močová • Možnost selhání jater, ledvin, plic, porucha srážlivosti • Komplikace eklampsie / tonicko- klonické křeče) a HELLP syndrom Posouzení rizika PREEKLAMPSIE • PIGF - Proangiogenní placentární růstový faktor • sFlt-1-solubilní receptor tyrozinkinázového typuI, antiangiogenní • U preeklapsie je ↑ sFlt-1 a ↓PIGF • Poměr stanovení koncentrací sFlt-1 a PIGF v 2. a 3. trimestru (ECLIA Roche). • Stanovení PIGF v 1 .trimestru a hodnota do 10 pg/ml znamená vysoké rizik preeklampsie Prenatální screening vrozených vývojových vad (VVV) Screening VVV • Screening- vyhledávání osoby s rizikem vzniku choroby ještě před její manifestací • Pozitivní výsledek screeningu zahajuje sérii specifických diagnostických postupů ( v případě prenatálního screeningu ultrazvuková vyšetření, genetické vyšetření buněk plodu získaných odběrem plodové vody (AMC) nebo choriových kliků (CVS) • V optimálně vyladěných systémech prenatálního screeningu je skutečně postižen VV jen asi každý desátý až dvacátý plod s pozitivním výsledkem screeningu (falešná pozitivita 5%pozitivní screening má každá dvacátá žena s nepostižený plodem). Prenatální screening VVV •• Defekty kožního krytí ploduDefekty kožního krytí plodu-- defekty neurálnídefekty neurální trubice, rozštěpy břišní stěnytrubice, rozštěpy břišní stěny •• Chromozomální vady ploduChromozomální vady plodu-- trisomietrisomie 2121 ((morbusmorbus Down), 18Down), 18-- EdwardsůvEdwardsův sysy, 13, 13-- PPataůvataův •• Vady metabolismu cholesterolu (SmithVady metabolismu cholesterolu (Smith--LemliLemli-- OpitzůvOpitzův sysy)) I.trimestr • Kombinovaný test PAPP-A, free β hCG, NT • Kontingenční- měření dalších ultrazvukových markerů- identifikace 90% plodů s aneuploidií, fetální anomálie • Provádět 10+0 až 13+6 gestačního stáří • Zvýšení výtěžnosti na 97% při 5% FP oproti současným 60% při 15%FP vyšetření pouze ve II.trimestru PAPPPAPP-- AA (pregnancy associated plasma protein) • Glykoprotein, v ELFO -2, maximum na konci 3.trimestru • Metaloproteinasa • uvolňuje IGF ten hraje roli při regulaci lokálních proliferačních reakcí- reprodukční pochody, hojení ran, aterosklerosa • Jeho funkce v těhotenství není zcela prokázána, zřejmě regulace fetoplacentárního růstu •• V těhotenství snížen uV těhotenství snížen u chromos.aberacíchromos.aberací (M.Down pouze v I.trimestru) • In vitro fertilizace nebo ovulační indukce jsou hodnoty PAPP-A nižší, naopak u intrauterinní inseminace jsou vyšší • Marker akutního koronárního syndromu, při kostní remodelaci, hojení FreeFree ββ hCGhCG • Část hCG, náročné z hlediska preanalytiky (rozpad ve vzorku)!! • Zvýšené hodnoty mohou být spojeny s Downovým sy a preeklampsií • Snížené hodnoty u ektopického těhotenství a T18, T 13 • Mírně zvýšené hladiny u těhotenství po technik asist.reprodukce II.trimestr • Double test- hCG, AFP • Triple test- hCG, AFP, volný estriol • (Kvadruple test) -hCG, AFP,volný estriol,inhibin A • Provádět ve 14+0 až 20+0 gestačního stáří AFP (alfa fetoprotein) • Produkován žloutkovým váčkem, během fyziolog.těhotenství klesá AFP v plodové vodě a stoupá v mateřském séru. • ↑ Defekty neurální trubice a břišní stěny, anencefalie, rachischizy • Vznik defektů souvisí i s poruchami metabolismu kys.listové (acidum folicum) • Riziko postižení stoupá s hodnotou AFP • Těhotné jsou pak indikovány k UZ vyšetření v oblasti páteře a břišní oblasti plodu • Kontrola AFP a dalších markerů přímo v plodové vodě • Další možné příčiny ↑ AFP: hrozící potrat, mnohočetné těhotenství, intrauterinní krvácení, syndrom mizejícího dvojčete, stenoza/atresie GIT, triplodie • ↓↓ Downův sy, Edwardsův sy, • Těhotenství po intrauterinní inseminaci jsou zvýšené • Ženy s IDDM jsou hodnoty AFP mírně sníženy • AFP jako tumorový marker- hepatocelulární ca, neseminomované testikulární ca, nádory z germinativní tkáně hCG • Lidský choriový gonadotropin • Produkovaný syncitiotrofoblastem placenty • Udržuje funkci žlutého tělíska (produkce progesteronu) • V mateřské krvi se objevuje 8.-9. den po koncepci. • Fyziologický výskyt v těhotenství-dosahuje maxima ve 8.-10. t.t. a pak klesá, v druhé polovině těhotenství se udržuje na stálé hladině • ↓mimoděložní těhotenství, hrozící potrat, zmlklé těhotenství • ↑Downův syndrom, hydatiformní mola (až miliony hCG) • ↓ trizomie 18. a 13. chromozomu • U těhotenství , která vznikla technikami asistované reprodukce jsou hladiny hCG mírně zvýšené • hCG jako tumorový marker: choriokarcinom, germinální nádory testes a ovarií Volný ( nekonjugovaný) estriol • V průběhu těhotenství se zvyšuje • Produkován placentou, konjugace v játrech • Je vylučován močí • Ve fyziolog.těhotenství stoupá až do 40.t.t. • Pro monitorování funkce fetoplacentární jednotky • ↓ nitroděložní tíseň plodu, Downův sy, • ↓↓ Smith-Lemli-Opitzův sy • Mírně snížené hodnoty u asistované reprodukce Inhibin A • Reguluje produkci FSH a GnRh • V těhotenství inhibuje produkce FSH • ↑ vyšší riziko Downova syndromu Přístupy testování • Integrovaný- PAPP-A, (free β hCG), NT, AFP, HCG, uE3společné vyhodnocení po dokončení všech vyšetření • Sérum integrovaný- v místě kde není možné měřit NT, měří se PAPP-A, (free β hCG), AFP, HCG, uE3-společné vyhodnocení; u těhotných kde PAPP-A je pod 0,35MoM doporučit změřit NT • Sekvenční forma- PAPP-A, (free β hCG), NT- předběžné vyhodnocení testu, vysoce pozitivní se řeší okamžitě, ostatní do II. Trimestru; společné vyhodnocení všech • Pokud žena v 1.trimestru má riziko 1:30 nebo 1:50- neprovádí se další screenig.vyšetření, a rovnou invazivní metody Falešná pozitivita a výtěžnost Falešná pozitivita (FP) při 85% výtěžnosti Výtěžnost při 5% FP Kombinovaný test 3,8-6,8% 85% Triple nebo double 9,3-14% 69% Integrovaný test 0,8-1,2% 94% Sérum integrovaný test (bez NT) 2,7-5,2% 85% UZ parametry • Měření NT (šíjové projasnění)- v 1.trimestru těhotenství, měření dle metodiky Fetal Medicine Foundation (Londýn) • Pro stanovení gestačního stáří je nutné změřit CRL (vzdálenost temeno- kostrč páteře)doporučeno 11+0- 13+6 t.t. • Měření NB (nosní kost) , trikuspidální regurgitace, vyšetření ductus venosus (11-13+6 t.t.) • Ostatní UZ parametry: BPP, HC •• NT (NT (nuchálnínuchální transluciencetranslucience))- Jedná se o fyziologický otok za hlavičkou plodu. Jeho velikost je přímo úměrná nejen riziku Downovy choroby, ale i riziku desítek dalších genetických, morfologických a funkčních vývojových vad. Vyšší rozsah otoku v oblasti šíje je důsledkem mnoha faktorů jako je například změna složení vaziva, kterou mají plody s Downovou chorobou nebo plody metabolickými vadami, vyšší hodnoty nalézáme i u vrozených srdečních a jiných strukturálních vad hlavně v oblasti krku a hlavy, u poruch lymfatické drenáže, apod •• CRLCRL ( =( = crowncrown rumprump lengthlength)) - vzdálenost od temene hlavičky k zadečku. Pro stanovení stáří plodu. To je obzvláště důležité, pokud panují nejasnosti o době posledních měsíčků těhotné. • V případě vícečetného těhotenství je v tomto období nejvyšší čas stanovit typ vícečetného těhotenství, vyšší riziko v případě jednovaječných dvojčat. •• Nosní kostNosní kost-- je posuzována podle charakteru vývoje a osifikace. Při chromozomálních poruchách je vysoký výskyt absence nebo hypoplazie už v 1.trimestu- varovný signál a indikace k dalšímu vyšetření • U žen s nízkým rizikem DS, kterých je zhruba 80%, není třeba dalších vyšetření. Po vysvětlení významu příznivého výsledku následuje další povinné ultrazvukové vyšetření až ve 20. - 22. týdnu těhotenství. • U žen se středním rizikem nám pomáhá vyšetření dalších ultrazvukových markerů, které dokáží výsledek kombinovaného testu více specifikovat. Mezi tyto markery patří posouzení přítomnosti nosní kůstky, měření obličejového úhlu, měření průtoku mezi pravou srdeční síní a komorou a zhodnocení průtoku ve venosním duktu. Všechna tato vyšetření dohromady dokáží odhalit až 95% plodů s Downovou chorobou. • Těhotným s vysokým rizikem kombinovaného testu je detailně vysvětlena celá problematika a následně je doporučena genetická konzultace a invazivní vyšetření - odběr choriových klků, amniocentéza Metody stanovení biochemických parametrů Imunochemické metody stanovení: TRACE – free βhCG, hCG, AFP, PAPP-A ILMA- free βhCG, hCG, AFP, PAPP-A IRMA- free βhCG, hCG, AFP, PAPP-A RIA- volný estriolvolný estriol Chemiluminiscence-free βhCG, hCG, AFP, PAPP-A, volný estriolvolný estriol Elektrochemiluminiscence-free βhCG, hCG, AFP, PAPP-A Fluorescenční imunoanalýza- hCG, AFP Analytické požadavky metod: opakovatelnost do 6 % a reprodukovatelnost do 10%., bias max 15%. Vyhodnocení biochemických stanovení • Výpočet rizika VVV musí být prováděn pomocí spolehlivého validovaného počítačového programu (Astraia, PRISCA, ALPHA, Life-cycle…..) • Hodnoty biochemických markerů jsou vyjadřovány v násobcích střední hodnoty mediánu (MoM-multiple of median) pro dané gestační stáří. • Upozornění rizika trisomií (21., 18., 13. chromosomu), ve 2. trimestru defekt NT (NTD) • Vyjádření rizika 1:XXX zahrnuje anamnestická data těhotné ženy, data měření biochem. a ultrazvuk.parametrů • cut off hodnota rizika 1:300, 1:250, 1:200 dle nastavení programu Stavy komplikující výpočet rizika VVV • Choriokarcinom, mola hydatidosa – vysoké hCG, AFP (imituje D.s. či gemini) • Redukce počtu plodů při vícečetném těhotenství po IVF-měnící se hodnoty AFP, hCG • Vícečetné těhotenství- biochem. markery nejsou symetrické • Darovaný oocyt- komplikace při výpočtu ( hmotnostní korekce na nositelku, věková na biologickou matku) • Ostatní-IDDM, kouření…. Historie provádění screeningu v ČR Riziko DS a trisomie 18 podle věku matky Věk matky Riziko DS Další chromozomální abnormality 20 1/1480 1/525 25 1/1350 1/475 30 1/940 1/384 35 1/353 1/178 40 1/85 1/62 45 1/30 1/18 • V posledních letech se posunula populace těhotných do vyšší věkové kategorie než například před 30 lety. • Tehdy představovala populace těhotných nad 35 let v rozvinutých zemích kolem 5%, • dnes je těhotných nad 35 let již kolem 20%. • s věkem stoupá riziko vrozených vývojových vad. Mezi nejznámější a nejčastější genetické vady patří Downova choroba (trizomie 21. chromozomu), vzácněji pak Edwardsův (trisomie 18. chromozomu) a Pataův syndrom (trizomie 13. chromozomu). • Věk 35 let je jen jakousi pomyslnou hranicí, kdy riziko vzniku Downovy choroby u těhotných začíná významněji stoupat • Věk matky hraje výchozí, nikoliv ale zásadní roli pro výpočet individuálního rizika každé těhotné. MATEŘSKY VĚK RIZIKO DOWNOVA SYNDROMU ve 12. týdnu při narození 20 1:1070 1:1530 25 1:950 1:1350 30 1:630 1:900 32 1:460 1:660 34 1:310 1:450 35 1:250 1:360 36 1:200 1:280 38 1:120 1:170 40 1:70 1:100 42 1:40 1:55 44 1:20 1:30 www.vrozene- vady.cz Nové trendy screeningu VVV Nové trendy screeningu VVV • Neinvazivní prenatální testování NIPT • Příslib pro budoucnost • Vysoká technologická náročnost ale vysoká cena testu Výhody využití cíleného sekvenování v neinvazivním prenatálním testování Putzová Martina, Hasch Marcel, Gomolčáková Barbora, Šubrt Ivan, Michal Michal NIPT testování • V současné chvíli jsou dostupné v zásadě tři principiálně rozdílné typy NIPT testů. Prvním typem jsou testy založené na masivním paralelním sekvenování a následném statistickém hodnocení poměru počtu náhodných sekvencí na testovaných chromozomech v porovnání s referenčními chromozomy (BGI, Sequenom a mnoho typů tzv. „homemade“ testů). Tyto testy jsou z hlediska nákladů na provedení nejlevnější a k hodnocení dat jsou dostupné softwarové nástroje. Proto je tento typ testů tak rozšířený. Mají však některé zásadní nevýhody. • Odhad fetální frakce je u těchto typů testů prováděn buď na základě předpokladu, že kratší fragmenty cfDNA pochází převážně z placenty, anebo na základě rozdílů v metylaci. • Do této skupiny testů patří např. NIFTY test (BGI) u nás nabízen pod komerčním názvem Prenascan, Materni T21 (Sequenom). Verifi test (Illumina). Výhody využití cíleného sekvenování v neinvazivním prenatálním testování Putzová Martina, Hasch Marcel, Gomolčáková Barbora, Šubrt Ivan, Michal Michal • Druhým typem testů jsou testy, které kombinují masivní paralelní sekvenování s analýzou SNPs („single nucleotide“ polymorfismů v DNA, které jsou běžné u každého jedince). Analýza SNP markerů je v těchto typech testů využívána výhradně k analýze zastoupení fetální frakce (v DNA plodu se nacházejí SNPs, které jsou odlišné od mateřských a umožňují proto spolehlivé určení zastoupení fragmentů plodu). Do této skupiny testů patří např. komerčně dostupné testy Harmony (Ariosa), nebo test Clarigo (Multiplicom). Výhody využití cíleného sekvenování v neinvazivním prenatálním testování Putzová Martina, Hasch Marcel, Gomolčáková Barbora, Šubrt Ivan, Michal Michal • Třetím typem testu je test, jehož celé hodnocení je založeno na analýze SNPs. Tento test je jako jediný schopen vyhodnotit zvlášť maternální a fetální frakci v sekvenovaných fragmentech, což umožňuje snížení falešné pozitivity u aternálních mozaik a CNV’s (Copy Number Variation - delece či duplikace nekódujících či kódujících úseků chromozomů). • V současné chvíli je tento test pod komerčním názvem Panorama® firmy Natera Ltd. nabízen i v České republice, kde je prováděno i laboratorní zpracování. Výhody využití cíleného sekvenování v neinvazivním prenatálním testování Putzová Martina, Hasch Marcel, Gomolčáková Barbora, Šubrt Ivan, Michal Michal NIPT test nelze v žádném případě považovat za samospasitelný test, který by umožnil odhalit všechny chromozomální vady plodu. Dobře známé jsou biologické limitace testu: základní limitací všech typů NIPT testů je původ volné DNA, která pochází z placenty, nikoli z plodu samotného a která proto nemusí být v důsledku placentárního mozaicizmu s DNA plodu zcela shodná. I v případě, že se v budoucnu stane tato metoda zlatým standardem ve screeningu nejčastějších trizomií, kvalitní USG vyšetření v I. i II. trimestru nenahradí, ale bude ho zcela jistě výborně doplňovat. Dnes již validované studie detekce mikrodelečních syndromů ukazují úžasné možnosti vyšetření cfDNA. Je to poměrně silná “zbraň” na poli prenatální diagnostiky a jako s takovou je třeba s ní umět adekvátně zacházet. Výhody využití cíleného sekvenování v neinvazivním prenatálním testování Putzová Martina, Hasch Marcel, Gomolčáková Barbora, Šubrt Ivan, Michal Michal Děkuji za pozornost Děkuji za pozornost