Rutinní koagulační testy Interpretace výsledků Zavřelová J. Antitrombin Stanovení funkční aktivity - fotometricky princip  1/ inkubace ředěné vyš. plazmy s nadbytkem  trombinu  (F Xa)  v přítomnosti heparinu  za vzniku komplexu  trombin -AT-heparin  (F Xa - AT - heparin)  a zbytkového trombinu (F Xa) Antitrombin  2/ stanovení zbytkového  trombinu  (F Xa)  pomocí specifického chromogenního substrátu  end point (A)  kineticky (A/min) vyjádření výsledků v %  odečet z kalibrační křivky (lin/lin závislost) Stanovení antigenu - imunochemicky  - LIA, ELISA, EID Kalibrace - antitrombin kalibrační materiál  komerční vyšetření  různých ředění výchozí kalibrační plazmy s udanou hladinou antitrombinu kalibrace tří…více bodová závislost lin/lin Antitrombin - klinický význam klinický význam  snížení normální hodnoty: 80 – 120 %  zvýšené hodnoty bez klinického významu(> 120%) vyšetření dalších ředění vyšetřované plazmy  běžně se neprovádí  jen pro event. snížení vlivu zbarvení plazmy Antitrombin - klinický význam snížení AT vrozený nedostatek získaný nedostatek  snížená syntéza  zvýšené ztráty  zvýšená spotřeba (DIC, TEN, rozsáhlé operace)  jiné příčiny (těhotenství, kontraceptiva) D-Dimery Specifické štěpné produkty fibrinu marker aktivace koagulace i fibrinolýzy metody semikvantitativní  latexaglutinační (hemaglutinační)  imunofiltrace metody kvantitativní  LIA  ELISA  EID Kalibrace – LIA D-Dimery vyšetření  více standartních materiálů s různým hladinou D-Di  načtení kalibrace čárovým kódem  kalibrace vícebodová  závislost nelineární (polynom) vyjadřování výsledků v mg/l (norma < 0,5 mg/l)  klinický význam zvýšení omezení – rozsah kalibrace (např. 0 - 4 mg/l)  nutnost provedení vyšetření dalších ředění D-Dimery - klinický význam Zvýšení D-Di  TEN, DIC  poranění, po operaci  zánět  primární hyperfibrinolýza  trombolytická léčba  hepatopatie  odvržení transplantovaných štěpů  fyziologicky  těhotenství, porod, menstruace, fyzická zátěž D-Dimery - klinický význam Zvýšení D-Di  vysoká senzitivita testů  nízká specifita testů  význam má sledování dynamiky změn Negativní výsledek přínosnější  negativní prediktivní hodnota (96-98%) FDP Fibrin/fibrinogen degradační produkty průkaz aktivace fibrinogenolýzy / fibrinolýzy metody semikvantitativní  latexaglutinační  v séru  odběr do spec. zkumavek s trombinem a reptilázou  v plazmě  metody kvantitativní  LIA  EID Stanovení solubilního fibrinu Komlexy FM/oligomerů s fibrinogenem, FDP průkaz aktivace koagulace metody přímé  parakoagulační  etanolgelifikační test  protaminsulfátový test  hemaglutinační  LIA metody nepřímé  fibrinopeptid A… (ELISA) Etanolgelifikační test průkaz přítomnosti solubilních komplexů FM parakoagulační test  sledování tvorby gelu po přídavku 50% etanolu k vyšetřované plazmě (20 °C) Ovlivnění výsledku  odběr (aktivace) - falešná pozitivita  čas zpracování (do 30 min) - falešná negativita  teplota (20 °C) -  negativní,  pozitivní EGT - klinický význam DIC TEN sepse metastázující karcinomy SLE Monitorování léčby Antikoagulační léčba  kumariny  PT (INR) Antitrombotická  UFH  APTT (R)  (anti Xa, anti IIa)  LMWH  anti Xa  (anti IIa) Stanovení heparinu anti Xa (IIa) Princip: měření schopnosti heparinu katalyzovat inhibici F Xa (IIa) antitrombinem  inkubace ředěné plazmy s nadbytkem F Xa (IIa) -inhibiční působení komplexu AT-heparin na F Xa (IIa)  měření zbytkového F Xa (IIa) po přídavku chromogenního substrátu  vyjádření výsledků v IU/ml (kIU/l) odečtením z kalibrační křivky Provádění: preventivní/ léčebné podávání LMWH /UFH Kalibrace heparin antiXa/IIa kalibrační materiál  komerční (pro LMWH a/heparin) vyšetření  3-4 kalibrační plazmy s udanou různou hladinou anti Xa (IIa) kalibrace tří…více bodová závislost lin/lin (A/min na IU/ml) vyjadřování výsledků IU/ml (kIU/l) Jiná antitrombotika – anti Xa Bemiparin (Zibor)  LMWH s vyšším poměrem antiXa/antiIIa  vyjádření výsledků IU/ml (kIU/l) Fondaparinux (Arixtra)  pentasacharid  vyjádření výsledků mg/ml (mg/l) Rivaroxaban (Xarelto), Apixaban (Eliquis), Edoxaban (Lixiana)  přímé inhibitory F Xa  vyjádření výsledků mg/l Přímá antitrombotika – anti IIa Dabigatran (Pradaxa)  přímý inhibitor trombinu (IIa)  sledování inhibice konstantního množství trombinu Koagulační metoda (ředěný TT) set Hemoclot Thrombin inhibitors  ve směsi ředěné vyšetřované plazmy a normální plazmy  koagulační čas je přímo úměrný koncentraci dabigatranu Fotometrická metoda  v ředěné vyšetř. plazmě po přídavku chromogenního substrátu  A/min je nepřímo úměrná koncentraci dabigatranu Vyjádření výsledků mg/l Kalibrace jiná antitrombotika kalibrační materiál  komerční pro jednotlivé léky (s výjimkou Ziboru) vyšetření  3-4 kalibrační plazmy s udanou různou hladinou léku kalibrace tří…více bodová závislost lin/lin  antiXa A/min na IU/ml, mg/l, mg/l ..  antiIIa sec/ mg/l, A/min/ mg/l Globální testy Doba krvácení Euglobulinová lýza Analýza PFA Trombelastografie TGA Konzumpce protrombinu Doba srážlivosti Rekalcifikační čas Doba krvácení Globální test primární hemostázy měří se doba, za kterou dojde k zástavě krvácení v místě dle možnosti standardního vpichu nebo řezu metoda dle Duke - standardní řez do ucha  norma < 270 s metoda dle Ivyho - řez na předloktí pomocí firemních nožíků při zatažení paže tonometrem na 40 mm Hg sloupce  např. Surgicutt norma 120 - 480 s Doba krvácení - klinický význam Prodloužení DK trombocytopenie trombocytopatie von Willebrandova choroba porucha cévní stěny afibrinogenémie ovlivnění léky (salicyláty) Vyšetření PFA kvantitativní měření primární hemostázy zahrnující adhezi, degranulaci a tvorbu hemostatické zátky měřené v citrátové plné krvi sledování tvorby destičkového trombu, který postupně vyplňuje otvor v membráně  potažené bud kolagenem a epinefrinem  nebo kolagenem a ADP výsledek je čas potřebný k dosažení kompletního uzávěru otvoru membrány Vyšetření PFA Vyšetření PFA PFA - klinický význam přeoperační screening diagnostika vrozených a získaných trombocytopatií diagnostika vWF choroby (typ 1) sledování účinnosti léčby Euglobulinová lýza Globální test fibrinolytického systému měří se čas potřebný k rozpuštění koagula euglobulinové frakce (EF) plazmy (norma>180min)  příprava EF plazmy precipitací vyšetř. plazmy za specifických podmínek (pH = 5,2)  EF se skládá z fibrinogenu, fibrinolytických enzymů a z protrombinu (ev. trombinu), neobsahuje inhibitory fibrinolýzy  rozpuštění precipitátu (zvýšením pH)  vznik koagula EF po přídavku Ca2+  sledování rozpouštění koagula (cca po 15 min) Euglobulinová lýza Ovlivnění výsledku: odběr  aktivace čas zpracování  do 30 minut koncentrace fibrinogenu  hypofibrinogenémie rozpuštění precipitátu Euglobulinová lýza- klinický význam zkrácení  DIC (sekundární hyperfibrinolýza)  primární hyperfibrinolýza  trombolytická léčba  cirhóza  zvýšená duševní a tělesná zátěž  novorozenec prodloužení  podezření na hyperkoagulaci Tromboelastometrické vyšetření kontinuální monitorování procesu krevního srážení a následné lýzy v podobě grafického záznamu = tromboelastogramu klasická tromboelastometrie  sledování oscilace kyvety se srážlivou krví, ve které je zavěšen trn připojený k indikátoru světla rotační tromboelastometrie  sledování oscilace trnu v pevné kyvetě s krví Rotační tromboelastometr Tromboelastometrie Tromboelastometrie schopnost krevní sraženiny tvořit mechanické spojení mezi kyvetou a trnem rotační pohyb (kyvety nebo trnu)  brzděný tvořící se krevní sraženinou  je převáděn na amplitudu  je mírou pevnosti sraženiny záznam amplitud v čase  trombelastograf  symetrická křivka  nad a pod základní linií čas srážení (CT) [sec] čas tvorby sraženiny (CFT) [sec]maximálnípevnost sraženiny(MCF)[mm] lýza 20mm 60mm 90mm 10 min pevnostsraženiny čas roTEM analýza: parametry Klinický význam TEM  Poskytuje informaci o  tvorbě trombinu indukované aktivací vnějšího nebo vnitřního koagulačního systému  obsahu fibrinogenu a trombocytů  odpovídající polymerizaci sraženiny  rozpouštění fibrinu  Výhody  jednoduchost provedení vyš. z plné citrátové krve  dostupnost výsledku v krátkém časovém intervalu Nevýhody  použití k hrubé orientaci o stavu hemostázy  zejména k akutní analýze na operačních sálech a jednotkách intenzivní péče Trombin generační test (TGT, TGA) Globální test hemostázy  speciální přístroj fluorometr  vyšetření citrátové plazmy (PPP nebo PRP) Princip  k vyšetř. plazmě je přidán fluorogenní substrát  trombin vznikající aktivací koagulační kaskády směsí PL (jen u PPP), TF a Ca2+ přeměňuje fluorogenní substrát na fluorofor, jehož signál je zaznamenáván fluorometrem  při měření pacienta musí být použit trombinový kalibrátor Ceveron®Alpha (Technoclone, Medista) Grafické znázornění průběhu TGA • Lag Phase (iniciační fáze) [min] čas aktivace koagulačního systému • Peak time [min] • Peak Thrombin (výška píku) [nM] maximální koncentrace trombinu • Velocity Index (Slope) [nM/min] strmost křivky=peak thrombin / peak time • Inactivation phase pokles tvorby trombinu • Area Under the Curve (AUC – plocha pod křivkou) [nM] celkové množství vygenerovaného trombinu TGT – klinický význam vhodná metoda pro posouzení globální funkce hemostázy získání úplného obrazu trombotické či krvácivé tendence u pacientů  s vysokým rizikem trombózy  s vysokým rizikem krvácení přínosná při využití při monitorování léčby hemofiliků s inhibitorem, monitorování antikoagulační léčby Konzumpce protrombinu vyšetření destičkové i plazmatické funkce krve stanovuje se zbytkové množství protrombinu v séru po vysrážení krve za standartních podmínek  odběr (3 skleněné zkumavky, množství krve)  zpracování (ihned po odběru)  4 hodiny 37 °C  vlastní vyšetření zbytkového protrombinu v séru  inkubace séra s Ca2+tromboplastinem  stanovení koagulačního času po přídavku fibrinogenu (norma > 30 s) Interpretace základních koagulačních testů APTT +PT+TT N N N +DK APTT +PT+TT N N  +TT+ReT  heparin N dysfbg  +PT N N +DK APTT +PT+TT N N +TT  Korekční test Korekce Defekt FF VIII, IX, XI, XII Inhibitor ANO NE N +TT+ReT  heparin N dysfbg  +PT N N +DK APTT  PT N +TT +ReT  Dysfbg, játra  APTT  PT N +TT +ReT N Dysfbg, játra Defekt F VII kumariny APTT  PT N Korekční test Korekce Defekt FF II, V, VII, X, Inhibitor ANO NE N +TT +ReT  N TT  Heparin, odběr Dysfbg, játra Defekt F VII kumariny  APTT Prodloužené PT v normě deficit F VII zahájení léčby kumariny prodloužené Trombinový čas prodloužené v normě Korekční test částečně/bez korekce inhibitor: specifický nespecifický korekce vrozený deficit FF II,V,X získaný deficit FF II,VII,X a V v normě ( kumariny, deficit vit.K, jater. choroby, DIC) FF II,V, VII.X (jater. choroby, DIC) viz.TT PT Prodloužené APTT prodloužené Trombinový čas v normě Korekční test částečně/bez korekce inhibitor: specifický nespecifický korekce vrozený deficit FF VIII,IX,XI, XII,PK,HMWK získaný deficit (jaterní choroby, DIC) normální (viz PT) prodloužené (viz TT) Reptilázový čas Prodloužený TT v normě heparin prodloužené Fibrinogen v normě abnormální Fibrinogen imunologicky FDP negativní pozitivní abnormální antitrombiny (revmatoidní artritida nebo myelom) DIC fibrinolýza v normě abnormální dysfibrinogenemie vrozená hypofibrinogenemie nebo DIC Počet trombocytů Prodloužená DK snížený Trombocytopenie zvýšený Trombocytóza v normě prodloužené Fibrinogen Funkce trombocytů v normě abnormální izolované prodloužení DK dysfunkce trombocytů v normě abnormální vWF dys-, hypo-, afi- fibrinogenemie v normě APTT abnormálnívariabilní von Willebrandova choroba„varianty“ vWF choroby PT APTT TT norma norma norma  A) + trombo i DK norma Příčiny:  inic. DIC  B) +DK, trombo norma Příčiny:  v.Willebr. choroba  trombastenie, jiné trombocytopatie  C) + trombo, DK N/ Příčiny:  trombocytopenie  trombocytopatie  inic. DIC Doplňující vyšetření:  AT Doplňující vyšetření:  F VIII, vWF:RCo/Ac, vWF:Ag  funkce trombo Doplňující vyšetření:  počet trombo  vyšetření funkce trombo PT APTT TT patol norma norma Příčiny:  snížení F VII  snížení FF protrombin. komplexu  kumariny  novorozenec Doplňující vyšetření:  F VII  anamnéza, další vyš. (biochem.)  anamnéza PT APTT TT norma patol norma Příčiny:  snížení FF F VIII,IX,XI,XII  v.Willebr. choroba  specifický/nespecifický inhibitor  novorozenec Doplňující vyšetření:  F VIII, IX, XI, XII  F VIII,VWF:RCo/Ac,VWF:Ag  průkaz inhibitoru PT APTT TT norma norma patol Příčiny:  heparin  poruchy polymerizace fibrinu  dysfibrinogenémie Doplňující vyšetření:  reptilázový čas  fibrinogen, FDP  fibrinogen (LIA) PT APTT TT patol patol norma Příčiny:  komplexní koag. porucha různé geneze  snížení FF II, V, X  inhibitor F V  léčba kumariny  novorozenec Doplňující vyšetření:  fibrinogen, trombocyty, D-Dimery, bioch.  F II, V, X  průkaz inhibitoru  anamnéza PT APTT TT patol norma patol Příčiny:  kombinovaná koagulopatie Doplňující vyšetření:  fibrinogen, FF, FDP, biochemie PT APTT TT norma patol patol Příčiny:  heparin  kombinovaná koagulopatie Doplňující vyšetření:  reptilázový čas  FF, fibrinogen Interpretace výsledků Heparin UFH Kumariny Defekt FF vnitř.syst. Defekt F VII Defekt FF II,V, X PT N, (())  N   APTT    N  Fbg N N N N N TČ  N N N N