Alergologické vyšetření Mgr. Julie Štíchová MUDr. Zita Chovancová, Ph.D ÚKIA - FNUSA Obor: Bioanalytik, jaro 2021 Alergie „Alergická onemocnění jsou způsobena nepřiměřenou reakcí imunitního systému na běžné neškodné antigeny pocházející z vnějšího prostředí.“ Tyto antigeny se nazývají alergeny. Typy přecitlivělosti dle Coombse a Gella 1. I. Typ přecitlivělosti s účastí IgE – atopická 2. II. Typ - reakce s účastí IgG a IgM Podtyp IIa - cytotoxická reakce – potransfuzní reakce, hemolytické onemocnění novorozence Podtyp IIb – blokující a stimulující autoprotilátky (myasthenia gravis, thyreotoxikóza) 3. III. Typ – imunokomplexová reakce – sérová nemoc, SLE 4. IV. Typ – reakce oddálené přecitlivělosti o S převažující účastí Th1 + makrofágy  granulom (TBC, sarkoidóza) o S Th1 s převažujícími (Th17) a CD8 cytotoxickými T-lymfocyty  kontaktní dermatitida 5. Reakce na cizí těleso 6. Septický šok Přecitlivělost I. Typu Probíhá ve 3 fázích: 1. fáze senzibilizace •zpracování alergenu, indukce Th2 odpovědi  produkce IgE •Vazba IgE na vysokoafinitní Fcε receptory žírných buněk 2. Časná fáze alergické reakce (minuty po styku) •Aktivace žírných buněk alergenem  degranulace 3. Pozdní fáze alergické reakce (hodiny po styku) •Syntéza metabolitů kyseliny arachidonové – leukotrieny 1. fáze senzibilizace2. Časná a pozdní fáze alergická reakce Přecitlivělost I. Typu oLokální reakce: oSenná rýma (sezónní, celoroční) oKonjunktivitida oAstma bronchiale typ I (eozinofilní) oAtopický exém oKopřivka oSystémová reakce oAnafylaktický šok 1. fáze senzibilizace2. Časná a pozdní fáze alergická reakce Alergen oExogenní antigen, který u vnímavých jedinců vyvolá patologickou imunitní reakci oNázvosloví alergenů: vychází z latiny, např. kočka domácí: Felis domestica Fel d 1 První 3 písmena jména rodového První písmeno jména druhového Číslice udává pořadí alergenů kočky, na které reaguje nejvíce pacientů alergických na kočku – zde číslice 1 – hlavní alergen kočky lipokalin, na který reaguje 95% pacientů alergických na kočku Alergeny hlavní a vedlejší oV současnosti je známo aminokyselinové složení většiny alergenů oRozlišení 2 skupin: oAlergeny hlavní – látka, na kterou reaguje 50-90 % jedinců přecitlivělých na daný alergen (IgE) např. Fel d1, Bet v 1, Ara h 1, 2, 3 oAlergeny vedlejší – reaguje na ně menšina osob vnímavých na daný alergen (<10 %) Alergeny I. a II. třídy Alergeny I. třídy – alergeny potravinové, senzibilizace orální cestou o Spouští se do pár minut od konzumace potraviny o Klinické příznaky variabilní – od svědění dutiny ústní, rtů (orální alergický syndrom, OAS) až po život ohrožující anafylaxi Alergeny II. Třídy – alergeny inhalační o Často proteiny rostlin s různou enzymatickou aktivitou, např. o Skladovací proteiny – semena, ořechy o Inhibitory enzymů (amyláz, antitrypsin) – brání štěpení škrobů a proteinů v obilných zrnech o Regulační proteiny – podílí se na rozmnožování rostlin o Proteiny související s patogenezí (obrana rostliny – hevaminy – funkce podobná lysozymu) Zkřížená reaktivita oVelká část alergenů si je velmi podobná ve svém aminokyselinovém složení oAlergeny s vyšší než 50% homologií vykazují zkříženou reaktivitu oJe-li homologie vyšší než 80 %  PANALERGENY – obsahují fylogeneticky konzervativní sekvence AK o Způsobují potravinovou alergii asociovanou s pyly o 1. fáze – senzibilizace pacienta inhalačními alergeny o 2. fáze – zkřížená reaktivita mezi proteiny inhalačních alergenů a potravinami  potravinová alergie Originally published December 2015 by Ellen Avery, MS, RD, CNSC Panalergeny Panalergeny - stabilita Termolabilní alergeny: • Profiliny a PR-10 proteiny • V nativním stavu – alergenní potenciál, Povařením narušení 3D struktury molekuly  narušení epitopu  ztráta alergenicity • Projevuje se většinou jen orálním syndromem Termostabilní alergeny: • LTP a zásobní proteiny • Alergenní epitop tvořen blízkými aminokyselinami ve struktuře molekuly • Není ovlivněn varem  molekuly povařením neztrácí alergenicitu • Může hrozit závažná alergická reakce! Pozn. Vzácně se vyšší teplotou může alergenicita potraviny zvýšit  burské oříšky  pražení změna konformace molekuly  vytvoření alergenního epitopu Panalergeny 1. Profiliny ◦ Cytoplazmatické bílkoviny v rostlinách vážící aktin Podílí se na rozmnožování rostlin ◦ Jsou termolabilní ◦ Hojně obsaženy v pylech trav, plevelů a stromů ◦ Patří sem např. vedlejší alergeny břízy ◦ U pacientů s alergií na profiliny zkřížená alergie: Pyl  Ovoce (hruška, banán, pomeranč)  Zelenina (mrkev, paprika, rajče)  Ořechy Panalergeny 2. PR-10 proteiny (pathogenesis related proteins 10) ◦ Termolabilní ◦ V dužině ovoce ◦ Funkce – ochrana rostliny proti bakteriím a plísním ◦ Proteiny homologní s hlavním alergenem břízy Bet v 1 ◦ U pacientů pozorujeme zkříženou reaktivitu na: Pyl břízy  ovoce (jabko, hruška)  zelenina (celer, mrkev) 3. LTP (lipid transfer proteiny) ◦ Bílkoviny transportující fosfolipidy v buněčných stěnách buněk rostlin ◦ Výskyt hlavně v ovoci (broskve, meruňky), arašídech (Ara h 9) ◦ Termostabilní ◦ Zde není asociace s alergií na pyly Panalergeny 4. Zásobní proteiny o Termostabilní o Viciliny, leguminy, 2S albumin o Vyskytují se hlavně v ořeších, semenech, peckách, arašídech (Ara h), luštěninách o Povaření potraviny nezmění alergenicitu o Hrozí vážná alergická reakce po pozření potraviny CCD determinanty oVětšina alergenů jsou glykoproteiny – obsahují také sacharidové struktury oZkříženě reagující IgE protilátky se mohou tvořit i proti těmto sacharidovým strukturám (Cross-reactive Carbohydrate Determinants) oAnti-CCD protilátky většinou nemají klinický význam oAle často v alergologických testech (kde se používají alergenové extrakty) způsobují falešnou pozitivitu oPopsány byly např. u hrušky, mrkve, celeru, měkkýšů atd. CCD determinanty oJestli bude mít vazba IgE se sacharidovou složkou klinický význam závisí na tom, zda se IgE váže na: o 1 epitop alergenu (monovalentní glykoalergen)  nedochází ke klinickým projevům o Více epitopů alergenu (polyvalentní glykoalergen)  dochází ke klinickým projevům  nutno určit přesný alergenový epitop CCD determinanty oPokud existuje rozpor mezi klinikou pacienta a výsledky stanovení specifických IgE protilátek, je třeba zvážit možnou falešnou pozitivitu testů způsobenou anti-CCD IgE oModerní testy používají postupy, které anti-CCD IgE blokují – přídavek blokátoru (např. ALEX) Alergeny pro laboratorní diagnostiku Standardizované alergenové extrakty o Purifikace z přírodních zdrojů o Výrobce stanoví obsah hlavních alergenů kvantitativně (ELISA) o Množství a aktivita alergenu se srovná se standardem o Kromě alergenu obsahují extrakty také nealergenní složky (proteiny, sacharidy…) o Ty mohou vést k falešné pozitivitě testů Rekombinantní alergeny o Ze zdroje alergenu izolována RNA o Přepis do DNA o Vložení DNA bakteriofága o Hostitelem bakteriofága E.Coli o E.Coli produkuje alergen v čisté formě o Rekombinantní alergeny umožňují komponentovou diagnostiku Komponentová diagnostika oUrčí u pacienta konkrétní molekulu (epitop), která vyvolává senzibilizaci oNapř. třídy panalergenů – profiliny, PR-10, LTP, zásobní proteiny  oDokážeme rozlišit, zda u pacienta po podání určité potraviny hrozí závažná reakce  význam pro alergenovou imunoterapii (složení alergenů, zda má význam je pacientovi podávat) oDále např. reakce na včelu a vosu o U klasického stanovení specifického IgE na včelu a vosu s použitím alergenových extraktů bývá často přítomna zkřížená reaktivita – pacient falešně pozitivní na obojí o Komponentová diagnostika dokáže odlišit, na který konkrétní epitop se specifická IgE protilátka váže  určí, zda je pacient opravdu alergický na včelu nebo vosu Včela nebo vosa? 21-letá studentka medicíny byla vyšetřena 3 roky po anafylaktické reakci … způsobené bodnutím neznámým hmyzem … Jednalo se pravděpodobně o … … vosu… včelu IgG 9,800 g/l (7,510 – 15,600) IgA 1,180 g/l (0,820 – 4,530) IgM 0,763 g/l (0,460 – 3,040) IgE 594 U/ml (0 – 100) ANA negativní Tryptáza 3.07 g/l (0.00 – 13.50) ALERGENOVÉ EXTRAKTY sIgE A. mellifera 4.30 kU/l (class III) V. spp. 15.20 kU/l (class III) P. spp. 5.34 kU/l (class III) V. crabro 15.10 kU/l (class III) Test aktivace basofilů CD63 CD203c Negativní kontrola 1 % 1 % Pozitivní kontrola 60 % 55 % A. mellifera 24 % 25 % V. spp. 83 % 85 % ZKŘÍŽENÁ REAKTIVITA nebo DVOJÍ POZITIVITA … … THAT is the question! … THAT is the question! rApi m 1: 0.01 kU/l (třída 0) rVes v 1: 1.28 kU/l (třída II) rVes v 5: 12.8 kU/l (třída III) REKOMBINANTNÍ ALERGENY Laboratorní diagnostika zahrnující kombinaci vyšetření specifických IgE protilátek proti alergenovým extraktům a rekombinantním alergenům pomohla postavit správně diagnózu u naší pacientky. Pacientka potom podstoupila alergenovou imunoterapii proti vose. Vyšetřování koncentrace specifických IgE protilátek proti alergenovým extraktům není někdy v diagnostice alergií dostačující. Alergologické vyšetření 1. Anamnéza ◦ Rodinná – výskyt alergií u členů rodiny ◦ Osobní ◦ Výskyt klinických obtíží po kontaktu s určitými alergeny ◦ Inhalační alergeny, potravinové, léky, hmyz, údaje o domácím a pracovním prostředí, zvířatech ◦ Jaké klinické příznaky, jak rychle se vyvíjí, jaká závažnost, jak dlouho trvají, v jakých periodách se opakují ◦ Vyvíjí se vyrážka na kůži po kontaktu se šperky, pásky apod.? Snaha vytipovat potenciální alergeny, na které bude provedeno vyšetření Alergologické vyšetření 2. Odběr krve oPro zhodnocení celkového zdravotního stavu pacienta se odebírá krev kromě alergologických parametrů také na: o Biochemie – základní biochemické parametry (glukóza, tryacylglyceroly, cholesterol, hormony štítné žlázy…) o Hematologie – krevní obraz o Imunologie – základní screening autoprotilátek (ANA), komplement, subpopulace lymfocytů oPacient nemusí trpět pouze alergickým onemocněním ale i dalšími komorbiditami … 3. Alergologické vyšetření -in vivo testy Lze je provést přímo v ordinaci alergologa 1. Prick testy – inhalační, potravní a zvířecí alergeny 2. Intradermální testy – blanokřídlý hmyz, léky 3. Epikutánní testy – kontaktní alergie (IV. Typ) 1. Prick testy o Preanalytická fáze – pacient cca týden před provedením testu vyloučí léčbu antihistaminiky/kortikoidy o Aplikace standardizovaných alergenů na volární stranu předloktí o Součástí je také negativní kontrola (fyziol.roztok) a pozitivní kontrola (histamin) o Kontraindikace: nespolupracující pacient, pacient co má kožní onemocnění v místě provedení testu a lidé, kterým není možné vysadit léčbu 1. Aplikace kapky alergenu 2. Narušení kůže plastovým kopíčkem 3. Inkubace cca 20 min 4. Odečet velikost pupene Aplikace alergenu do podkoží injekčně Intradermální test oIV. Typ přecitlivělosti oAlergie na léky, jedy blanokřídlého hmyzu oAplikace alergenu do podkoží pomocí injekční jehly oNevýhoda – výsledky testu závisí na hloubce vpichu – závislé na zkušenosti zdravotní sestry (příliš hluboký vpich – může být falešná negativita testu) oExistuje nízké riziko vážné reakce (léky jsou ale výrazně naředěny, proto je riziko závažné reakce sníženo na minimum) oPodráždění kůže může přetrvávat až 36h po provedení testu Epikutánní test oDiagnostika kontaktní alergie (IV.typ) – nízkomolekulární chemické látky oPrincip – aplikace podezřelých látek ve formě náplasti na zdravou kůži zad  odečet za 48, 72 a 96h o Pozitivní výsledek – exém v místě kontaktu oKontraindikace: o Kožní onemocnění v místě aplikace testů (záda) o Gravidita o Příliš opálená kůže o Imunosupresivní/imunostimulační terapie oNelze testovat látky toxické a s extrémními hodnotami pH https://www.dermatologiepropraxi.cz/pdfs/der/2011/03/14.pdf 4. Vyšetření dýchacích cest - astma oMěření FeNO (frakční expirační NO) – měření oxidu dusnatého ve vydechovaném vzduchu o Při eozinofilním zánětu dýchacích cest se ve vyšší míře tvoří NO o Koncentrace NO ve vydechovaném vzduchu koreluje se závažností eozinofilního zánětu o Výsledky se vyjadřují v ppb oSpirometrie o Vyšetření funkčních parametrů dýchacích cest, diagnostika obstrukce oBronchomotorické testy o Bronchodilatační test – podání bronchodilatancia  sleduje se reverzibilita obstrukce dýchacích cest (reverzibilita ukazuje na astma) o Bronchokonstrikční test – podání metacholinu (nebo fyzická zátěž)  sleduje se, zda jsou průdušky schopny konstrikce pod vlivem vyvolávající látky (svědčí pro zánět průduškové stěny) 5. Alergologické testy in vitro - přehled Serologické testy 1. Nefelometrie – stanovení celkového IgE 2. Immulite 2000 – stanovení specifického IgE, eozinofilní kationický protein (ECP) Pozn. dříve se ke stanovení specifického IgE používala i ELISA, dnes už ne!! – nahrazení přístrojovými metodami 3. AlaSTAT – stanovení specifického IgE 4. ImmunoCap Phadia – stanovení tryptázy a vybraných rekombinantních alergenů 5. MADx Allergy Explorer, Immunocap ISAC – multiplex metody - stanovení až 280 alergenů 6. (ELISA – stanovení koncentrace DAO (diaminooxidázy) a histamin degradační test) Buněčné testy 1. Stanovení počtu eozinofilů 2. Test aktivace bazofilů (BAT) 3. Proliferace lymfocytů Immulite 2000 – specifické IgE •Enzymově zesílená chemiluminiscence •Pevná fáze – 1 velká plastová kulička potažená biotinem •Přidáme alergen konjugovaný se streptavidinem  naváže se na kuličku •Přidáme pacientovo sérum  vazba alergen specifického IgE •V dalším kroku – přidáme anti-IgE protilátku značenou alkalickou fosfatázou  po přídavku adamantyl-dioxetan-fosfátu odštěpí enzym fosfát  vzniká nestabilní aniont, který při rozkladu uvolní emisi fotonů – zaznamená se počet záblesků Celkové IgE hranice pozitivity: 100 IU/ml AlaSTAT oJamky destičky potaženy biotinem oDo jamek se přidá alergen značený biotinem + pacientovo sérum oProtilátky IgE reagují v tekutém prostředí s alergenem oPřídavek avidinu  vazba komplexu alergen-IgE na stěnu jamky oPromytí oPřídavek ani-IgE značeného enzymem  inkubace  promytí oPřídavek substrátu  přeměna na barevný produkt oKolorimetrická detekce Stanovení specifického IgE a alergenová imunoterapie oAlergenová imunoterapie  cílem navodit u pacienta tvorbu alergen specifického IgG4 oIgG4 nemá schopnost vázat se na Fc-ε receptory bazofilů  nedochází k rozvoji alergické reakce oAlergen specifické IgG4 ale může v testu obsadit alergen a zabránit tak vazbě IgE  detekujeme falešně nízké hladiny IgE oŘešení – reverzní uspořádání detekčního systému Celkové a specifické IgE oCelkové IgE - norma 0-100 IU/ml oCelková koncentrace IgE koreluje s přítomností alergického onemocnění (většinou) o Specifita 90 %, ale senzitivita jen 30-40 % oPouhé stanovení celkového IgE k určení přítomnosti alergie nestačí, protože: o Vysoké IgE také u jiných diagnóz, např. nosní polypóza, Wiskot-Aldrich syndrom, hyper IgE syndrom, AIDS, parazitární onemocnění o Nízké IgE - 60 -70 % alergiků nemusí mít celkové IgE zvýšeno nad 100 UI/ml oSpecifické IgE (alergenové extrakty) o Interpretace výsledků někdy nemusí být jednoznačná (zkřížená reaktivita) o Specifita 95 %, senzitivita 75-85 % senná rýma celoroční rýma astma atopický ekzém Immulite 2000 – stanovení ECP oPrincip stanovení stejný jako stanovení specifického IgE (rozdíl- na kuličce je anti-ECP protilátka) oEozinofilní kationický protein je produkt aktivovaných eozinofilů oJeho hladina koreluje se závažností eozinofilního zánětu oPoužívá se k monitorování průběhu a léčby eozinofilního alergického astmatu oNormální hladina v séru < 13,5 ng/ml ImunoCap/Phadia – fluorimetrie Pevná fáze – kepíky, které obsahují aktivovanou celulózu – velká plocha Na celulózu navázán alergen  na něj vazba pacientova IgE V dalším kroku přídavek anti-IgE protilátky značené β-D-galaktosidázou Přídavek substrátu  Methylumbelliferyl- β-D-galaktosid  enzym odštěpí β-D-galaktosid a vznikne methylumberiferon  excitace světlem  emise fluorescenčního záření (na rozdíl od Immulitu zde potřebujeme žárovku (Hg-Výbojka) k excitaci methylumbeliferonu!) • Stanovení tryptázy • Stanovení rekombinantních alergenů (RAL) ImmunoCap - Tryptáza oUvolňuje se po aktivaci žírných buněk alergenem  marker anafylaktické reakce o Diferenciální diagnostika anafylaktických reakcí polékových, po bodnutí hmyzem o Také stanovení post mortem – určení anafylaktické reakce jako příčiny úmrtí oTryptázu tvoří také mastocyty  výrazné zvýšení u systémových mastocytóz oVýhoda tryptázy (např. v porovnání s histaminem): o Není na rozdíl od histaminu uvolňována bazofily v krvi – vyloučena falešná pozitivita in vitro o Je v krvi stabilní kolem 48 h  možno stanovit post mortem o Při uchování vzorku při chladničkové teplotě – stabilní až týden oNorma – do 13,5 ug/l ImmunoCap – RAL rekombinantní alergeny oKoncentrace specifického IgE vůči komponentám členěna do 6 tříd: 0-6 o Nultá třída – koncentrace <0,35 IU/ml = negativní o Čím vyšší třída, tím má pacient více specifického IgE vůči dané komponentě o S rostoucí třídou (koncentrací) roste pravděpodobnost klinických příznaků onemocnění sIgE A. mellifera 4.30 kU/l (class III) V. spp. 15.20 kU/l (class III) P. spp. 5.34 kU/l (class III) V. crabro 15.10 kU/l (class III) Buněčné testy v alergologii 1. Stanovení počtu eozinofilů (I.typ přecitlivělosti) 2. Test aktivace bazofilů (BAT) (I.typ přecitlivělosti) 3. Test proliferace lymfocytů na pozdní alergickou reakci (IV. typ přecitlivělosti) Stanovení počtu eozinofilů oPrincip – hematologický analyzátor o Hydrodynamická fokusace vzorku o Impedanční vlastnosti buněk - počet o Průchod světelným paprskem – informace o velikosti a granularitě oKrevní diferenciál dospělého člověka: o Lymfocyty: 20-45 % o Monocyty 2-12 % o Neutrofily 50-70 % o Eosinofily 1-3 % o Bazofily < 1 % oZvýšení eozinofilů – alergická, parazitární onemocnění… oPoužití – pro monitoring eozinofilního astmatu oPři znalosti absolutního počtu leukocytů lze absolutní počty buněk dopočítat o Leukocyty 4-10*109/l Test aktivace bazofilů (BAT) oBazofily v klidovém stavu exprimují v nízké míře znak CD203c, jsou CD63 negativní oPři aktivaci a degranulaci se zvyšují znaky CD63 a CD203c  měření pomocí průtokové cytometrie oProvedení testu – prestimulace plné krve s IL-3  následuje přídavek alergenu  inkubace  promytí  značení protilátkami (anti-CD63, anti-CD203c, anti-IgE)  promytí  lýza erytrocytů BAT – alergeny oVětšinou se používají alergeny z prick testů (alergenové extrakty) oU podezření na lékové alergie doktor spolu s krví zasílá do laboratoře podezřelý lék, nejlépe v injekční formě (pokud tablety, tak nutno rozdrtit a naředit) oU každého BAT testu se požívá ředění alergenu v pořadí 10krát, 100krát a 1000krát  proč? oNěkdy může být koncentrace alergenu natolik vysoká, že bazofily se výrazně naaktivují a během inkubace podlehnou nekróze  výsledkem měření je falešná negativita oProto se může stát, že např. při ředění 10krát je reakce negativní, ale pozitivní v ředění 100krát! BAT – gatovací strategie (Pacient alergický na kočku – alergen Fel d) 1. Na Forward scatteru a Side scatteru gatovány lymfocyty 2. Z lymfocytů gatovány pouze IgE pozitivní buňky - bazofily 3. Bazofily – sledujeme CD63 a CD203c Negativní kontrola Bazofily jsou CD63 neg. Pozitivní pacient – vidíme populaci CD63 pozitivních bazofilů o Při vyšetření BAT u pacienta je součástí testu vždy: o Pozitivní kontrola (stimulace fMLP) o Negativní kontrola (PBS) o U BAT totiž neexistují konkrétní referenční meze Proliferace lymfocytů oPacienti se závažnými reakcemi na léky  IV. Typ přecitlivělosti dle Coombse a Gella oPrincip: inkubace lymfocytů pacienta s podezřelým lékem 7 dní v médiu  poté měření proliferace o Součástí testu též negativní kontrola (PBS), pozitivní kontrola (PHA, ConA) a zdravá kontrolní osoba! oPokud lymfocyty proliferují, je daný lék považován za spouštěč pozdní alergické reakce oÚskalí: o Testován je přímo lék, ale ne jeho metabolity (některé léky se biotransformují na metabolity které mají daný účinek) o Některé léky přímo působí jako inhibitory proliferace (např. prostaglandin E2  útlum produkce IL-2) o Možnost falešné pozitivity bez klinických příznaků pacienta  nutno vždy hodnotit výsledky spolu s klinickými daty