Průtoková cytometrie a stanovení lymfocytárních subpopulcí Jana Nechvátalová Ústav klinické imunologie a alergologie FN u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Rozdělení imunologických laboratorních metod serologické (humorální)- detekce antigenů a protilátek, průkaz tvorby protilátek proti infekčním agens buněčné- stanovení počtu (relativního, absolutního) a funkčnosti jednotlivých typů leukocytů - odběr nesrážlivé krve do EDTA, heparinu, citrátu sodného Cluster Designation (Cluster of Differentiation) • buňky exprimují ( vystavují) na svém povrchu různé specifické molekuly – znaky, které můžeme uspořádat do skupin charakterizujících buněčnou linii, stav diferenciace jednotlivé buňky a její aktivace • CD klasifikace: znak definované struktury rozpoznatelný monoklonální protilátkou je zařazen do skupiny diferenciačních CD znaků a označen číslem (CD1, CD2, CD3,…). V současné době je na lidských leukocytech charakterizováno asi 400 znaků. • Využití: CD znaky jsou používány k označení plně definovaných molekul. Molekuly zařazené do CD klasifikace jsou členěny podle funkce. Rozlišení adhezních membránových molekul, receptory pro rozmanité cytokiny, molekuly vyjádřené na T lymfocytech, B lymfocytech , trombocytech či jiných buněčných populacích. Blausen.com staff (2014). "Medical gallery of Blausen Medical 2014". WikiJournal of Medicine 1 (2). DOI:10.15347/wjm/2014.010. ISSN 2002-4436. Leukocyty: počet leukocytov v krvi – 4-9x109/l Granulocyty T-lymfocyty (Th CD4+; Tc CD8+) B-Lymfocyty NK bunky Imunofenotypizace buněk • stanovení leukocytárních subpopulací pomocí průtokové cytometrie (FACS- fluorescentactivated cell sorting) • odběr krve do zkumavky s EDTA T lymfocyty CD3 - povrchová molekula přítomná na všech T-lymfocytech Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 58-85 % z lymfocytů http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/GeneralBiology/Immunology/Re cognition/Tcell/Tcellcomplex/Tcellcomplex.htm CD4+ TH (TH1, TH2) pomocné T-lymfocyty (T helper cells) T- lymfocyty CD8+ TC cytotoxické T-lymfocyty (cytotoxic T-cells) fyziologické zastoupení z celkových lymfocytů 30-60 % 15-35 % Stavba T- bunečného receptoru TCR a umístění koreceptorových molekul CD3, CD4, CD8 zapojených do signalizace přes T-bunečný receptor TCR. CD19 B lymfocyty CD19, CD20 - povrchové molekuly využívané k detekci B lymfocytů v průtokové cytometrii Vhodně zvolená kombinace dalších CD znaků slouží k charakterizaci jednotlivých vývojových stadií a funkčních subpopulací (Warnatz K, Schlesier M 2008) Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 7-23 % z lymfocytov Exprese CD znaků na povrchu B lymfocytů během jejich vývoje v kostní dřeni, sekundárních lymfatických orgánech a periferní krvi CD19 součástí B-bunečného receptoru BCR NK (Natural Killer) bunky CD16+CD56+CD3- - charakteristické povrchové markery Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 6-20 % z lymfocytů - rozeznávají buňky, které mají na povrchu abnormálně málo MHC I - nádorové a virově infikované buňky - používají cytotoxické mechanismy (perforin, granzymy) Pozor!!! NKT bunky: CD16+CD56+ CD3+ Monocyty CD14 - povrchová molekula charakteristická pro monocyty Fyziologické zastoupení v periferní krvi: 0-10 % z leukocytů - součást nespecifické imunity - schopnost fagocytózy - tkaňová forma = makrofág Na svém povrchu exprimují HLA DR (Human Leukocyte Antigen DR isotype) - navázání peptidů z pohlcených patogenů → → rozpoznání pomocnými T-lymfocyty - APC = antigen prezentující buňka CD14 jako koreceptor TLR4 - rozpoznání bakteriálních lipopolysacharidů (LPS) Příprava vzorku na FACS Y YYY Y Y Y YY YY YY Y Y Y Protřepat (vortexovat) Y Y Y Y Y Y Y 30min. inkubace tma lab. teplota Y Y Y Y Y Vzorek krve 45µl Pipetovat MIX potřebných MPL Vzorek krve 45µl + MPL Volné MPL - vazba na receptory Plná krev značená MPL Erytrocyt Lymfocyt Trombocyt Lýza erytrocytů • Erytrocyty přítomné ve vzorku zahlcují cytometr proto po značení plné krve MPL je nutné erytrocyty lyzovat • Ke vzorku se postupně přidává: ➢ Roztok A: 600ul ➢ Příprava roztoku A: 1,5 l destilované vody + 1,8 ml 99% kyselina mravenčí – způsobuje lýzu erytrocyů v kyselém prostředí ➢ Roztok B: 300ul ➢ Příprava roztoku B: 1,5 l destilované vody + 9,0 g bezvodého Na2CO3, 21,75 g NaCl, 46,95 g bezvodého Na2SO4 – alkalický roztok = zastavení lýzy a úprava pH ➢ Roztok C: 100ul ➢ Příprava roztoku C.: 1,5 l PBS (pH 7-7,4) + 15 g paraformaldehydu – fixace buněk Vzorky se do začátku měřaní uchovávají ve tmě při 4°C Automatický lyzátor TQ-prep od firmy Beckman Coulter používaný na lýzu erytrocytů Monoklonální protilátky (MPL) • produkt jediného klonu B lymfocytů (klonů vzniklých fúzí buněk produkujících Ab a myelomových buněk, které schopnost produkce vlastních Ig ztratili) nastimulovaných príslušným antigenem • totožné a specifické proti jednomu epitopu na povrchu použitého antigenu Proces výroby MPL Průtoková cytometrie (Flow Cytometry, FACS) • možnosti analýzy mnoha vlastností a charakteristik na úrovni jedné buňky během krátkého časového úseku • měření současně více než 20 markerů na jedné buňce • určování fenotypu buněk, monitorování odpovědi na léčbu, výzkum signalizačních drah • klíčovým nástrojem pro výzkum poruch krvetvorby flow+cyto+metrie - „měření buněk v pohybu“ Průtoková cytomerie je technologie umožňující současně měření a analýzu několika fyzikálních a chemických vlastností jednotlivých částic, které jsou unášeny v proudu kapaliny a prochází paprskem světla. Využití ▪ Klinické využití (imunofenotypizace a měření funkčních vlastností buněk) ▪ Buněčná biologie (DNA, RNA analýza) ▪ Mikrobiologie (rezistence na antibiotika, kintetika) Co měříme: • Lomené a odražené světlo - při průchodu buněk laserovým paprskem dochází k jeho lomu a odrazu na bunečném povrchu a buněčných organelách • Emitovanú fluorescenciu – pokud použijeme MPL konjugované s fluorochromem • částice velikosti 0,2-150 µm - prokaryotické a eukaryotické buňky - virové částice, bakterie, houby - komplexy Ag-Ab Laser MPL konjugovaná s fluorochromem Buňka Emitovaná fluorescence Lomené a odražené světlo Princip průtokové cytometrie Při průchodu částic laserovým paprskem dochází k rozptylu světla a k fluorescenci navázaných fluorochromů Světelné signály jsou převedeny na elektrické pomocí detektorů (fotonásobiče) Na každé buňce je možné změřit několik parametrů zároveň Naměřená data se ukládají a dále analyzují Cytometr je tvořen třemi hlavními systémy Fluidní systém transport částic k laserovému paprsku Elektronický systém převod detekovaných světelných signálů na signály elektronické, vyhodnocované počítačem Optický systém laser, zrcadla, optické filtry Fluidika - zajišťuje transport bb. v nosné tekutině (pod tlakem) do průtokové komory - buňky se pohybují jedna za druhou Řez průtokovou komorou: uprostřed vzorek (bunečná suspenze) unášaná nosnou kvapalinou (sheath fluid) Hydrodynamická fokusace Vzorek Vzorek Nízky tlak vzorku Úzký proud vzorku Menší průtok buněk Přesnější měření vhodné např. pro DNA analýzu a měření funkčních vlastností Vysoký tlak vzorku Široký proud vzorku Sbírání velkého počtu částic vhodné např. na imunofenotypizaci buněk Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 - jev, který zabezpečuje uspořádání buněk jednotlivě za sebou - rozdíl v tlaku a rychlosti nosné tekutiny a suspenze částic - vzorek, např. bunečná suspenze je vstříknut doprostřed tzv. sheath fluid (nosná kapalina) - nosná kapalina postupně strháva jednotlivé buňky a uspořádává je do řady za sebou - tlak nosnej kapaliny je nastavený výrobcem, měnit můžeme tlak vzorku (nastavení rychlosti průtoku buněk) Optika • Excitační optika laser a systém čoček, které zaostřují a směřují laserový paprsek – před ozářením částic • Sběrná optika soustava čoček, která vede a rozděluje světlo do různých vlnových délek na příslušné detektory – odražené a fluorescenční záření po ozáření částic Excitační optika Sběrná optika Band pass filtre Dichroické zrcadla Long pass filtre (LP) excitace Ar-iontovým laserem (modrý) - 488 nm FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm) PE, RD1 - phycoerythrin (580 nm) ECD - tandem. konjugát PE-texaská červeň (620 nm) PerCP - perridin chlorophyl (678 nm) PerCPCy5.5 - (696 nm) PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm) PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm) excitace He-Ne laserem/red diode (červený) - 633 nm APC - allophycocyanin (670 nm) APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm) excitacweUV/violet diode (fialový laser) - 405 nm Pacific Blue (452nm) BV421 (421 nm) BV510 (510nm) Lasery – zdroj záření - každý cytometr obsahuje jako zdroj záření laser - dnes: najčasteji využívané 3 až 4 lasery v cytometru - každý laser má charakteristickou vlnovou délku záření → excitace různých fluorochromů Fluorochromyexcitovateľné jednotlivýmilasermi Emisný peak Emisní peak: při ozáření fluorochromu paprskem laseru je emitované záření určité vlnové délky. Podle najvyšší intenzity vlnové délky emitovaného záření se volí vhodný detektor pro daný fluorochrom. Sběr optického signálu v průtokové cytometrii • Fluorochrom – po ozáření paprskem laseru dochází k emisi světla v rozsahu určitých vlnových délek – například FITC po ozáření argonovým laserem s vlnovou délkou 488 nm emituje světlo v rozsahu 480 – 674 nm, emisní maximum = emisní pík má v 521 nm. • Detektor pro měření fluorescence emitované FITC by měl mít rozsah detekovaných vlnových délek mezi 500 – 560 nm – v závislosti na výrobci cytometru. Excitačné spektrum FITC Emisné spektrum FITC Detektor pre FITC • ve vícebervné průtokové cytometrii dochází k emisi několika fluorochromů najednou – tj. je emitované záření různých vlnových délek a je nutné takto vzniklé záření rozdělit tak, aby bylo jasné, co vyzařují jednotlivé fluorochromy • při výběru fluorochromů se v průtokové cytometrii postupuje tak, aby se píky emisních spekter nepřekrývali Sběr optického signálu v průtokové cytometrii Optické filtry Long Pass (LP) Propoští všechny délky vyšší než uvedená vlnová délka 500LP Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 - součást sběrné optiky - odfiltrování vhodné vlnové délky emitovaného světla před dopadem na detektor Slouží k rozdělení emitovaného světla například tak, že propouští záření vyšší než 500 nm – tím dojde k oddělení např. odraženého světla laseru, který má vlnovou délku 488 nm. Takto upravené propuštěné záření je rozdělené dalšími filtry. Pro usměrnění záření dopadajícího na detektory pro jednotlivé fluorochromy potřebujeme rozdělit emitované záření tak, aby na určitý detektor dopadalo záření v daném rozsahu vlnových délek. K tomu potřebujeme short pass filtry a band pass filtry. Short pass filter propouští záření kratší vlnové délky a záření s vyšší vlnovou délkou odrazí. Propuštěné záření putuje směrem k detektoru, kde je jeho rozsah upravený pomocí band pass filtrů – propuštěno je záření vlnové délky typické pro emisní pík jednoho určitého fluorochromu. Optické filtry Short Pass (SP) Prepoští všechny délkky kratší než daná vlnová délka Band Pass (BP) Propuští specifické rozmezí vlnových délek 500SP 500/50 500±25 Practical flow cytometry in haematology diagnosis, 2013 Odražené záření putuje k dalším short pass filtrům, které následně propouští záření vyšší vlnové délky než v předešlých short pass filtrech. Optické filtry Dichroické filtry (zrcadla) - usmerňují odražené a emitované záření do detekční dráhy směřující k detektorům - rozdelují odražené a fluorescenční záření tak, aby dopadalo na vhodný detektor - najčasteji umístěné pod uhlem 45°, v tom případě část světla odráží pod uhlem 90°, část propouští - jsou používané jako long pass a short pass filtry Elektronika • Světelné signály jsou převáděny na elektrické • Typy detektorů: - lavinové fotodiódy: detekce FSC - fotonásobiče PMT (PhotoMultiplierTube): detekce SSC a fluorescence PMT - velmi citlivé, jsou schopné zachytit i slabé signály - zvyšují signál primárního dopadajícího záření Princíp PMT Záření ve formě fotonů dopadá na fotokatodu. Z ní jsou na základě fotoelektrického jevu vyraženy eletrony, které jsou dále usměrněné na tzv. dynody (katody z pozitivním napětím). Na jednotlivé dynody je privádděné stále vyšší napětí, což umožňuje urychlení elektronů a zvýšení jejich energie. Urychlené elektrony mají dostatek energie na vyražení dalších elektronů z povrchu dynod. Počet elektronů exponenciálně roste. Vyražené elektrony dopadají nakonec na anodu, na které dochází ke vzniku napěťového pulzu. PMT umožňuje přeměnit slabý počátečný signál na silný napěťový pulz. Vznik napěťového pulzu / Intenzita fluorescence - přechod buňky laserovým paprskem generuje vznik napěťového pulzu na detektoru - velikost napěťového pulzu je daná intenzitou záření (intenzitou fluorescence), které dopadlo na PMT - intenzita fluorescence závisí na: • expresi jednotlivých povrchových znaků • počtu navázaných fluorochromů • na síle fluorochromu (fluorochromy nevykazují stejnou intenzitu fluorescence) - napěťovým pulzům jsou pomocí převodníků přidělené digitální hodnoty rozdělené do 0-1024 kanálů na základě velikosti pulzu - každý z těchto kanálů odpovídá určité intenzitě fluorescence Velikost vs. granularita • Velikost a členitost buňky určujeme na základě rozptylu záření (light scatter): procházející částice vychýlí dopadající záření Forward Scatter (FSC) – rozptyl záření v přímém směru → závisí na velikosti buněk = určuje velikost Side Scatter (SSC) – rozptyl záření do stran → závisí na členitosti buněk = určuje granularitu • Stačí jeden laser • Není to fluorescenční záření (nepotřebujeme MPL s fluorochromi) FSC vs. SSC Lymfocyty Granulocyty Monocyty RBC, debris, mrtvé buňky velikost FSC SSC granularita Kombinací FSC a SSC získáváme rozlišení základních subpopulací leukocytů Velikost: lymfocyty < monocyty < granulocyty Granularita: lymfocyty < monocyty ≤ granulocyty Diferenciální rozpočet Stanovení relativního počtu leukocytárních a lymfocytárních subpopulací pomocí průtokové cytometrie SSC SSC CD45 FITC CD45 FITC CD45- panleukocytární znak, přítomný na všech leukocytech x+y+z = 100 % = Leukocyty x % Lymfocyty + y % Monocyty + z % Granulocyty x1 % T-lym. + x2 % B-lym + x3 % NK bunky x1+x2+x3 = 100 % = Lymfocyty x11 % CD4 Th + x12 % CD8 Tc x11 + x12 = 100 % = T-lymfocyty Fluorescence Mnoho buněk má stejnou anebo podobnou morfologii- na základě exprese povrchových znaků je můžeme rozdělit do skupin: - využívají se k tomu monoklonální Ab značené fluorochromomy specifické k určitému epitopu - fluorochrom je molekula schopná absorbovat záření specifické vlnové délky (excitace) a následně vyzářit kvantum energie (emise) vo formě fluorescenčního záření - částečná ztráta energie (přeměna na teplo) = Stokesův posun Fluorochrom - charakteristické excitační a emisní spektrum - Stokesov posun je daný strukturou molekuly Fluorochromy • jsou excitované vhodnou vlnovou délkou (nutné zvolit správny laser) • emitují světlo specifické vlnové délky (nutné zvolit detektor ve správném pásmu vlnových délek) • i neznačené bunky mohou být fluorescenční kvůli slabé autofluorescenci • Polycyklické organické molekuly a jejich deriváty - Fluorescein isothiokyanát (FITC), Cyaniny, Texas Red, rada Alexa, Pacific a Cascade - AmCyan, Propidium Iodide, 7-AAD, CFSE • Fluorescenční proteiny - Phycoerythríny (PE), Allophycocyaniny, PerCP, GFP,... • Quantum Dots Schopné absorbovat fotony budícího záření (napr. 488 nm) a následně (10-8 s) emitovat fotony s delší vlnovou délkou (nap. 500 – 800 nm). Fluorescenční záření má tedy jinou „barvu“. Emisné spektrá Ukázka prekrytí emisních spekter některých fluorochromů Překrytí spekter • Fluorochromy typicky emitujú světlo v širokém spektru vlnových délek • V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekované v jiných kanálech (přesvit, překrytí) Překrytí spekter - potřebné odečíst signál FITC v kanále (detektor) pro PE = „kompenzace“ – matematicky se odečítá procento nárůstu signálu způsobeného druhým fluorochromem Vlnová Intenzita fluorescence Pásmo vlnových délek, které zachytí detektory pro FITC a PE Název gatu, z kterého se zobrazují buňky Gatovacia strategie: postupný výběr buněk Naměřené vzorky obsahují, kromě různých typů buněk, také slepené buňky, mrtvé buňky anebo prachové částice. Gatovací strategie slouží k odfiltrování nechtěných částic z analýzy a k výběru cílové populace buěk na základě různé kombinace použitých znaků. V grafu se následně ohraničí jen buňky, které nás zajímají (vytvoří se tzv. gate). Další graf už zobrazuje jen buňky výběru (ohraničené) z předcházejícího grafu. Analýza naměřených dat – Gating Strategy Oddělení doubletu - slepených buněk Mtvé buňky a prachové částice K zobrazení dat se používají různé typy grafů: Histogram, Dot Plot Z hodnot gatovaných buněk vytvoříme statistiku: - údaje o počtu buněk - relativním zastoupení (prcento buněk; %) buněčných subpopulací - porovnání mediánu intenzity fluorescence MFI = míra exprese sledovaných znaků Analýza naměřených dat – statistika Dot Plot Histogram CD3+ CD3- Počet buněk Intenzita fluorescence MFI CD3MFI CD3+ HISTOGRAM Percento CD3+ buněk DOT PLOT Intenzita fluorescence Intenzita fluorescence - každá tečka zobrazuje 1 buňku a vyjadřuje expresi daného znaku na buňce - příklad grafu: Dot Plot rozdělený do 4 kvadrantů, na základě exprese sledovaných znaků: 1. CD19+ CD3- = B-lymfocyty (11,40% z Lymfocytů) 2. CD19+ CD3+ 3. CD19- CD3+ = T-lymfocyty (83,91% z Lymfocytů) 4. CD19- CD3- v jednotlivých kvadrantech sa nachází buňky s podobnou expresí znaků 1. 2. 3.4. B-lymfocyty T-lymfocyty CD3- CD3+ CD19+ CD19- MPL Fluorochrom Percento buněk v jednotlivém kvadrantu Výhody a nevýhody průtokové cytometrie Výhody • Velké množství analyzovaného materiálu – velké množství dat • Analýza trvá několik minut • Kvalitativní + kvantitativní analýza • Možné manipulační operace např. třídění buněk podle vybraných vlastností (cell sorting) Nevýhody • Vysoká finanční náročnost • Sestavení experimentu, analýza a vyhodnocení dat závislé na zkšenostech obsluhy • Analýza vzorků co najdříve po odběru • Nevidíme lokalizaci signálu na buňce Krvení diferenciál Základní vyšetrení v imunologické laboratoři: stanovení lymfocytárních subpopulací Připravují se dvě zkumavky: Sledujeme počet: Lymfocytů (GADJ); Monocytů (Mono); Eosinofilů (Eo); množství Debris (spad = mrtvé buňky) Krevní diferenciál - základní vyšetrení v imunologické laboratoři: stanovení zastoupení lymfocytárních subpopulací v plné krvi Průtokovou cytometrií se stanovuje počet buněk v jednotlivých subpopulácích leukocytů a porovnáva se s referenčními hodnotami. Připravují se dvě zkumavky s nasledující kombinací monoklonálních protilátek MPL: Zkumavka A: 45µl krve + x µl MPL CD45 FITC CD3 PC5 CD4 RD-1 CD8 ECD Zkumavka B: 45µl krve + x µl MPL CD45 FITC CD3 PC5 CD19 ECD CD16/56 RD-1 MPL + Fluorochrom Vzorky krve s MPL se inkubují 30 min, následuje lýza erytrocytů a měření na průtokovém cytometru Krevní diferenciál – gatovací strategie + výsledky Z obou zkumavek získáme relativní počet (%): Lymfocytů + Monocytů + Granulocytů Do výsledku se zapisuje průměrná hodnota z obou zkumavek Krevní diferenciál – gatovací strategie Zkumavka A: CD3+ CD3+ CD3+ CD8+ CD4+ Zkumavka B: CD19+ CD16/56+ Krevní diferenciál – výsledky Cytometrické měření: Ze zkumavky A získáme relativní počet: CD3+ T-lymfocytů CD3+CD4+ pomocných Th-lymfocytů CD3+CD8+ cytotoxických Tc-lymfocytů Ze zkumavky B získáme relativní počet: CD3+ T-lymfocytů CD19+ B-lymfocytů CD16/56+ NK buněk Eosinofilů (z granulocytů) Ze zkumavky A+B získáme relativní počet: Monocytů Lymfocytů Granulocytů Relativní počet: procentuální zastoupení dané populace buněk Absolutní počet: počet buněk na 1l krve - pomocí počítače leukocytů stanovíme počet leukocytů na 1l krve - z relativního počtu dané subpopulace a absolutního počtu leukocytů dopočítáme absolutní počet dané subpopulace buněk Ve výsledkovém listě se udává relatívní a taktéž absolutní počet buněk jednotlivých subpopulací a porovnává se s fyziologickými/referenčními hodnotami Stanovení absolutního počtu lymfocytárních subpopulací !Počet leukocytů 3,6-10 x109l lymfocyty 20-55 % monocyty 0-10 % granulocyty – neutrofily, eosinofily, bazofily 37-75 % Příklad: relatívny počet abs. počet Leukocyty 5 x109l Lymfocyty: 20% 1,0 x109l CD3: 75% 0,75 x109l CD19: 10% 0,1 x109l CD15,56: 15% 0,15 x109l Hodnocení výsledků • Byla dostatečná lýza erytrocytů? Pokud ne, výsledky mohou být zkreslené, málo načtených událostí, vysoký spad (debris) • Jsou zobrazeny všechny MPL → Pokud ne → byly přidané? ; je to pacientem? ; léčbou? • Jsou data správně zkompenzované? • Byla dodržena gatovací strategie? • Výsledné hodnoty: fyziologický rozsah hodnot zastoupení leukocytárních subpopulací závisí na věku, k hodnocení jsou dostupné tabulky uvádějící referenční rozmezí pro dané věkové kategorie) v normě – výsledky sa mohou uvolnit zvýšené/snížené oproti normě? → je nutné dovyšetriť s použitím jiných MPL, případně opakovat měření, u patologických hodnot je nutné opakovat odběr v jiný den Vyšetření lymfocytů periferní krve ZNAK EXPRESE FUNKCE ZASTOUPENÍ NA LYMFOCYTECH PERIFERNÍ KRVE (%) CD3 všechny T-lymfocyty asociován s TCR, přenos signálu 58-85 CD4 pomocné T-lymfocyty receptor pro MHC II, aktivace 30-60 CD8 cytotoxické T-lymfocyty receptor pro MHC I, aktivace 15-35 CD19 B-lymfocyty regulátor aktivace 7-23 CD16/CD56 NK-buňky FcR pro IgG/mediátor adheze 6-20 HLA-DR B-lymfocyty, monocyty, aktivované T-lymfocyty MHC II, prezentace Ag B-lymfocyty konstitutivně (na všech B-lymfocytech), T-lymfocyty 3-7 (na aktivovaných T-lymfocytech) Hodnocení nálezu jednotlivých subpopulací Snížení/ zvýšení subpopulace onemocnění  CD19+, CD3+, CD4+, CD8+ při imunosupresi – např. cyklosporin (způsobuje lymfopenii)  CD19+ u některých pacientů s CVID  CD19+ B – buněčná leukémie  CD3+ při expozici člověka toxickými chemikáliemi  CD3+ T – buněčná leukémie  CD4+ u některých pacientů s CVID (běžný variabilní imunodeficit – common variable immunodeficiency) - virové infekce (EBV, CMV, HIV)  CD4+ autoimunity, alergie  CD8+ autoimunity (roztroušená skleróza, systémový lupus erythematodes-SLE)  CD8+ u některých pacientů s CVID - virové infekce (EBV, CMV, HIV) Zkumavka A Obsahuje: vzorek krve + MPL (anti-CD45; anti-CD3; anti-CD4; anti-CD8) Získame relativní počet: T-lymfocytů CD3+ Pomocných Th-lymfocytů CD3+ CD4+ Cytotoxických Tc-lymfocytů CD3+ CD8+ Skúmavka B Obsahuje: vzorek krve + MPL (anti-CD45; anti-CD3; anti-CD56, anti-CD19) Získame relatívny počet: B-lymfocytov CD19+ NK buniek CD56+CD3- Eosinofilov Příklady využití FACS v praxi Základem imunologického vyšetření je krevní diferenciál a určení základních lymfocytárních subpopulací. V případě patologických hodnot je nutné měření doplnit s využitím jiných MPL a blíže charakterizovat možný patologický stav. Zdravá osoba CD3+CD3+ CD3+ CD8+CD4+ CD19+ CD16/56+ Fyziologické hodnoty: T LYMFOCYTY • CD3+ : 82 (58-85)% • CD3+ 4+: 57 (30-60)% • CD3+ 8+: 19 (15-35)% B LYMFOCYTY • CD19+ : 11 (7-23) % NK LYMFOCYTY • CD16,56+: 6 (6-20)% 6,37% Vliv infekce Bakteriální infekce • Počet leukocytů:  Th: CD3+ 4+:  • Lymfocyty:  Monocyty: CD14+HLA DR+ :  • Granulocyty:  Virová infekce • Počet leukocytů:  Tc: CD3+ 8+:  • Lymfocyty:  CD3+8+HLA DR+ :  • Granulocyty:  CD3+8+38+ :  Pacientka: Ž, *1957 - v krevním diferenciálu chybí B-lymfocyty (0,0 % z celkových lymfocytov) - v nemocničním systému zjištěná léčba rituximabem – pacientka revmatologie - výsledok: deplecia B lymfocytů vlivem léčby (po 4-6 měsících návrat k normálním hodnotám) X-vázaná agamaglobulinémie • mutace v genu kódujícím Brutonovu tyrosinkinázu – důležitá pro diferenciaci B lymfocytů • ženy prenašečky, manifestace u mužů • dochází k zastavení vývoje B lymfocytů • nepřítomnost B lymfocytů v krevním oběhu - v krevním diferenciálu chybí B-lymfocyty (0,0 % z celkových lymfocytů) - zastoupení ostatních lymfocytárních subpopulací v normě - výsledok: X-vázaná agamaglobulinémie T LYMFOCYTY • CD3+ : 59 (58-85)% • CD3+ 4+: 41 (30-60)% • CD3+ 8+: 15 (15-35)% B LYMFOCYTY • CD19+ : 0 (7-23) % NK LYMFOCYTY • CD16,56+: 34 (6-20)% 41% 15% 0% 34% 59% 59% Pacient: M, *1966 - v krevním diferenciálu vysoké B-lymfocyty (95,50 % z celkových lymfocytů) - Prvo-záchyt: bez historie v nemocničním systému - výsledek: podezření na leukémii - nutné doplnit vyšetrení CD5+CD19+ buněk Doplnění vyšetření na přítomnost CD5+CD19+ buněk CD5+CD19+ : 94.8% - CD5+CD19+ buňky = marker chronické lymfoproliferativní choroby - u zdravé osoby se znak CD5 vyskytuje na T-lymfocytech, normální hodnoty CD5+ na B-lymfocytech u zdravého dospělého človeka: do 10% ze všech B-lymfocytů Pacient: M, *1966 Výsledek: vysoký počet CD5+CD19+ = doporučaní na hematoonkologické vyšetření Vzorka: periferní krev odebraná do EDTA Značení MPL: CD45 KO - panleukocytární znak CD19 PC7- B-lymfocyty CD5 FITC Pacient: M, *1999 - v krevním diferenciálu zjištěný obrácený poměr CD3+CD4+ k CD3+CD8+ (13,2 : 50,9) - Fyziologické hodnoty: poměr CD3+CD4+ > CD3+CD8+ - Prvo-záchyt: bez histórie v nemocničním systému - výsledek: podozření na virovou infekci (často EBV, CMV) - nutné doplnit vyšetření CD8+CD38+ buněk Pacient: M, *1999 Fyziologický obraz Nastavení polohy gatů je fixnínastavené podle zdravých kontrol CD8+CD38+ 83,2% CD8++CD38++ 92,2% Doplnění vyšetření na přítomnost zvýšené exprese znaku CD38 na CD3+CD8+ T- lymfocytech - CD8+CD38+ buňky = marker virových infekcí - u zdravé osoby je zastoupení CD8+CD38+ T- buněk nízke, u virových infekcí se zvyšuje, patologické hodnoty = ??? - hodnoty vyšší než 50% CD8+CD38+ T-buněk z celkových CD3+CD8+ T-buněk nutné výsleděk hlásit ošetřujícímu lékaři Výsledek: vysoký počet CD8+CD38+ T-lymfocytů = možná např. EBV infekce (mononukleoza), doporučeno mikrobiologické vyšetření Vzorek: periférní krev odebraná do EDTA Značení MPL: CD45 KO- panleukocytární znak CD3 PC7- T-lymfocyty CD8 APC H700 – cytotoxické T-lymfocyty CD38 APC H750 – aktivační znak T-lymfocytů SCID - Severe Combined Immunodeficiency Ťažké kombinované imunodeficiencie • Primární imunodeficience (vrozená), postižena je buněčná složka imunity • Jedná o nejzávažnější vrozenou imunodeficienci (záhy po narození těžké infekce) • Bez léčby (transplantace kostní dřeně) úmrtí v prvním roce života (vyvíjí se také genová terapie) • Klinické projevy: • Infekce způsobené atypickými patogeny (pneumocysty, kandidózy, atypické mykobakteriózy, cytomegalová pneumotitida) • Chronické průjmy (bez průkazu etiologického agens), neprospívání, kožní infekce, komplikace po vakcinaci BCG • Molekulární podstata je heterogenní, rozlišuje se několik skupin SCID: 1. Porucha ADA (adenosindeaminázy): Dysfunkce nebo absence tohoto enzymu způsobuje akumulaci produktů metabolismu purinů, které jsou pro časné thymocyty toxické → rozvíjí se těžká T lymfopenie 2. SCID T-B-NK+: Absence T i B lymfocytů, NK buňky zachovány. Molekulární podstata heterogenní (některé případy deficit rekombinázy RAG- 2, porucha exprese receptoru pro IL-7) 3. SCID T-B+NK-: Chybí T lymfocyty a NK buňky, B lymfocyty zachovány. Nejčastější forma SCID (60% všech případů). 70% případů vázáno na chromosom X – mutace genu pro gama řetězec receptoru pro IL-2. Tento gama řetězec je ale společný i receptorům pro IL-4, IL-7, IL-9 a IL-15 → funkční porucha mnoha cytokinů. 4. Retikulární dysgeneze: Postižení kmenové buňky, blokován vývoj myeloidní i lymfoidní linie. SCID Severe Combined Immunodeficiency – Těžký kombinovaný imunodeficit Příklad pacienta se SCID - záchyt u novorozenců a dětí - nízký absolutní počet leukocytů a lymfocytů, v podstatě chybí CD3+ T-lymfocyty, počet B-lymfocytů a NK buněk může být taktéž snížený Leukocyty: 5,0x10*9/l Lymfocyty: 4,0x10*9/l Nízký počet leukocytů i lymfocytů vzhledem k věku pacienta SCID Leu : 5,0x109/l Ly: : 4,0x109/l T LYMFOCYTY • CD3+ : 14 (58-85)% • CD3+ 4+: 8 (30-60)% • CD3+ 8+: 2 (15-35)% B LYMFOCYTY • CD19+ : 71 (7-23) % NK LYMFOCYTY • CD16,56+: 13 (6-20)% 8% 2% 71% 13% 14% 14% Výsledok: T-B+NK+ SCID - všechny T-lymfocyty byly mateřské, aktivované, rozpoznávají HLA antigeny kojence jako „cizí“ - možné doplnit funkční test proliferace T-lymfocytů; dítě je směřované k transplantaci kostní dřeně DiGeorgův syndrom • embryonální porucha – narušení vývoje v oblasti 3. a 4. žaberního oblouku • abnormality v arteriálním oběhu, srdci, jícnu a čelistech • porucha vo vývoji thymu – snížené zastoupení T lymfocytů - v krvním diferenciálu výrazně snížené T-lymfocyty (pomocné CD4+ i cytotoxické CD8+) - zastoupení ostatních lymfocytárních subpopulácí v normě Krevní diferenciál: DiGeorgův syndrom T LYMFOCYTY • CD3+ : 40 (58-85)% • CD3+ 4+: 22 (30-60)% • CD3+ 8+: 4 (15-35)% B LYMFOCYTY • CD19+ : 22 (7-23) % NK LYMFOCYTY • CD16,56+ : 36 (6-20)% 22% 4% 22% 36% 40% 40% HLA-B27 negativní pozitivní Znak HLA-B27 je asociovaný s řadou zánětlivých onemocnění jako zánět kloubů, vnitřních struktur oka (uveitida), krátkych kostí rukou, noh a šlach, dále psoriázou, chronickými bolestmi spodní částmi zad a spondyloarthropatiou najznáméjší je ankylózující spondylitida (zánětlivé systémové onemocnění páteře a kloubů – Bechtěrevova choroba) Vzorek: periferní krev odebraná do EDTA Značení MPL: CD3 PE- T-lymfocyty HLA-B27 FITC Výsledek: cytometrické vyšetrenie HLA-B27 je jen screeningová metoda, pozitivní výsledek je třeba konfirmovat metodou PCR Vyšetrení HLA-B27 není doplňujícím měřením ke krvnímu diferenciálu, je to samostatné měření Bronchoalveolární laváž - BAL • diagnostické bronchoskopické vyšetrenie • pacientovi se do bronchu (větve bronchu) pomocí fibrobronchoskopu aplikuje a následně zpět aspiruje 150-200 ml fyziologického roztoku • sleduje se procentuální zastoupení jednotlivých typů leukocytů • indikuje se u zánětlivých plicních onemocnění, nádorových onemocnění, intersticiálních plicních procesech, pneumokoniózách - vzorek: bronchoalveolární tekutina - zpracování: - filtrace vzorku kvůli případnému obsahu nečistot, promytí, značení MPL: CD45 FITC – panleukocytární znak CD3 PC5 – T-lymfocyty CD4 RD1 – Th- lymfocyty CD8 ECD – Tc-lymfocyty Pozn. Vzorek BAL nesmí obsahovat krev. V krvi je jiné zastoupení lymfocytárních subpopulací než v BAL, v případě kontaminace BAL krví není možné rozpoznat, které lymfocyty pocházejí z krve a které z BAL, což vede ke zkresleným výsledkům. Bronchoalveolární laváž - BAL v v - Diagnosticky důležitý je poměr CD3+CD4+ k CD3+CD8+ T-lymfocytů (= imunoregulační index) - Fyziologické hodnoty: poměr CD3+CD4+/CD3+CD8+ = 1,1 až 3,5 - Patologické hodnoty: - výrazná převaha pomocných CD4+ T-lymfocytů = podozření např. na sarkoidózu, pneumónii, nádory dýchacích cest,... - převaha cytotoxických CD8+ T-lymfocytov = podozrenie na hypersenzitívnu pneumonitídu,... CD4-RD1 CD8-ECD CD4-RD1CD8-ECD CD8- CD4- Využití průtokové cytometrie v alergologii Test aktivace bazofilů (bazotest - BAT) funkční test umožňující vyšetření aktivace bazofilů po setkání se s určitým alergenem in vitro Na povrchu bazofilů - FcεRI (receptor pro IgE) CD203c Založen na expresi aktivačního znaku (CD63) na povrchu periferních bazofilů po jejich expozici alergenem in vitro ohraničíme subpopulaci bazofilů (IgE pozitivní) - sledujeme expresi CD63 (viz.obr.) a CD203c (není uvedeno) Sledujeme expresi CD63 na povrchu bazofilů Reakce přecitlivělosti jsou podstatou alergických onemocnění. Reakce přecitlivělosti I. typu neboli IgE mediovaná alergie - je zprostředkovaná protilátkami IgE. IgE se naváže na bazofily ve fázi senzibilizace. Při dálším setkání s alergenem – alergen přemostí IgE, to vede k aktivaci bazofilů - masivnímu uvolnění produktů degranulace bazofilů a mastocytů zvýšená exprese CD63 a CD203c na aktivovaných bazofilech. Obrázky převzaty z prezentace MUDr. Zity Chovancové PhD., FNUSA ÚKIA Brno Vyšetření periferní heparinizované krve, stimulace alergenem při 37 °C ve vodní lázni, zastavení reakce, lýza erytrocytů a měření na průtokovém cytometru Test aktivace bazofilů – gatovací strategie (Pacient alergický na kočku – alergen Fel) 1. Na Forward scatteru a Side scatteru gatovány lymfocyty 2. Z lymfocytů gatovány pouze IgE pozitivní buňky - bazofily 3. Bazofily – sledujeme CD63 a CD203c Negativní kontrola Bazofily jsou CD63 neg. Pozitivní pacient – vidíme populaci CD63 pozitivních bazofilů