Základy imunohematologie Imunohematologie • •Nauka o antigenech, protilátkách, imunitních reakcích aplikovaná na krevní buňky (erytrocyty, granulocyty, lymfocyty, trombocyty) •Multioborová věda klinicky využívaná při přípravě a podání transfuze a při některých jiných stavech •Řeší specifickou problematiku, např. hemolytické onemocnění novorozence, autoimunitní hemolytické anemie, potransfuzní reakce •Uplatnění v transplantologii (hematopoetické buňky, solidní orgány) • Základní pojmy •Imunita •Protilátky •Antigeny •Komplement •Imunitní reakce • •Imunohematologické vyšetření Imunita • •Obecná definice: odolnost proti nemocem/antigenům •Zajišťuje ji systém buněk, tkání a molekul, tzv. imunitní systém –prevence a eradikace infekcí, rozpoznání a odpověď na cizí tkáně a nové antigeny, obrana proti tumorům •Dva typy: imunita přirozená (iniciální protekce proti infekcím) a imunita získaná (více efektivní specifická obrana proti infekci) Přirozená/nespecifická/naivní •Okamžitá reakce, brání vstupu aloantigenů do organismu, rychle je eliminuje •Efektem je uniformní typ reakce proti mikrobům, nereaguje s neinfekčními antigeny • –Neporušený epitel, jeho enzymy a mikroflora –Humorální složka (plazmatické = komplement, cytokiny, interferony) –Buněčné složka (fagocyty, NK lymfocyty) – – Získaná/specifická/adaptivní –Pomalejší, ale specifická a více efektivní obrana (stimulují ji antigeny, které pronikly do tkání; rozpoznání antigenu v lymfatických orgánech) –Buňky lymfocyty exprimují specifické receptory, které rozpoznávají cizorodé substance –Má dvě specializované funkce •Humorální složku: protilátky tvořené B lymfocyty eliminují mikroby z extracelulárních tekutin •Buněčnou (celulární) složku: T lymfocyty CD4+ a CD8+ eliminují mikroby z buněk • –Lymfocyty působí spolu s nespecifickými mechanizmy (protilátky se navážou na mikroby, to vede k jejich snadnější fagocytóze) Specifická humorální imunita • •Rozpoznání antigenu v lymfatických orgánech –Imunitní systém rozliší více jak bilion různých Ag •Proliferace a klonální expanze B lymfocytů (rychlá protilátková odpověď buněk se stejným receptorem pro antigen) • • • • • • • Imunitní odpověď primární x sekundární Buňky v imunitní reakci •Lymfocyty •Exprimují specifické receptory pro antigeny /CD znaky –BCR pro B lymfocyty: reagují se solubilními Ag a s různými povrchovými antigeny, na které se navazují –TCR pro T lymfocyty: rozpoznává antigenní peptidy prezentované pomocí HLA – (Thelper, Tcytolytic, Treg ) – •Paměťové lymfocyty přežívají v klidu, po dalším kontaktu s původním antigenem navodí sekundární odpověď • Imunohematologie = protilátkový typ specifické imunitní odpovědi •Protilátky /imunoglobuliny • •produkty B lymfocytů •přítomné na povrchu membrány lymfocytů jako antigenní receptory nebo rozpuštěné jako proteiny v plazmě a v mukozních tekutinách •neutralizují a eliminují antigeny z krve a sliznic (nepůsobí uvnitř buněk) • • • • • Funkce protilátek Struktura protilátek •BCR –tvoří monomer IgM (příp. IgD ) zakotvený Fc fragmentem v membráně + signalizační molekuly – klony lymfocytů se vzájemně liší vazebným místem • Struktura protilátek •Řetězce těžké H a lehké L (H2L2) –Lehké řetězce: kappa, lambda –Těžké řetězce: alfa, gamma, delta, epsilon, mí •Fragment Fab + fragment Fc, pantová oblast •Variabilní část obsahuje oblast pro vazbu antigenu •Konstantní část pro jiné funkce (komplement, fagocytóza) • 0000007 1_16 Ig variable region Immunoglobulins (i.e., antibodies) Struktura protilátky •Monomery IgG, IgD, IgE = dvě vazebná místa pro Ag •Dimer IgA = čtyři vazebná místa pro Ag •Pentamer IgM (hexamer) = deset (dvanáct) míst pro Ag 0000007 0000005 0000004 Proteolytické štěpení protilátek •Štěpení papainem –2 monovalentní Fab fragmenty –Fc fragment – – – •Štěpení pepsinem –1 bivalentní Fab fragment –Fc fragment (štěpné produkty) • afinita Pojmy •Afinita: síla reakce mezi 1 antigenní determinantou a 1 vazebným místem protilátky • •Avidita: síla vazby mezi multivalentní protilátkou a antigenem s různými determinantami • •Specifita: schopnost protilátky reagovat s 1 antigenní determinantou • •Cross-reakce: schopnost protilátky reagovat s více antigenními determinantami • Typy protilátek dle vzniku •Polyklonální (lidské): z různých buněčných linií lymfocytů, rozeznávají různé epitopy stejného antigenu •Monoklonální Abs: identické protilátky jednoho klonu lymfocytů, rozeznávají jeden konkrétní epitop • • • • • • •Diagnostické použití (dg. séra) pro vyšetření krevních skupin • • Antigeny •Cizí substance navozující imunitní odpověď •antigenní determinanty (epitopy) = část antigenu, na kterou se váže protilátka –Jeden antigen může mít různé epitopy •Obvykle proteiny, polysacharidy, lipidy, NK • •Antigeny v imunohematologii –Krevní skupiny erytrocytů –HLA (histokompatibilní, transplantační) antigeny Vazba antigen - protilátka Krevní skupiny •Antigeny na buněčné membráně erytrocytů • • - zajišťují transport látek • - receptory pro mikroorganizmy • - adhesivní funkce • - jsou enzymaticky aktivní • - udržují morfologické a strukturální vlastnosti • erytrocytu KS Krevní skupiny •Obvykle velké molekuly, složené sloučeniny (proteiny, polysacharidy, lipidy) •Větší molekuly a komplexy molekul = lepší imunogeny •Imunogenicita závisí na stupni cizorodosti, strukturální stabilitě molekuly, dostatečném počtu Ag determinant, době expozice, způsobu podání •Autoprotilátky vznikají při selhání autotolerance •Hapten = malá molekula, neimunogenní, spojuje se s větším nosičem Komplementový systém •Komplex proteinů v plazmě a proteinů vázaných na povrchu různých buněk •Převážně proteolytické enzymy –enzymatická kaskáda při aktivaci –aktivované proteiny štěpí další složky komplementu (nejdůležitější proteiny C1-C9) –vzniká velký počet efektorových molekul •Funkce v obranyschopnosti –Opsonizace při fagocytóze –Chemotaxe fagocytů –Zánětlivá reakce –Lýza buněk (tvorba membránolytického komplexu) Aktivace komplementu •Mikrobiální nebo protilátkami navázanými na antigenech •3 cesty aktivace komplementové kaskády: ØKlasická (kontakt s protilátkou) – uplatňuje se v imunohematologii ØLektinová (vazba lektinu na bakteriální povrchy) ØAlternativní (s endotoxinem) Ø •Odlišné spouštěcí mechanizmy aktivace •V imunohematologii aktivace protilátkami: 1molekula IgM stačí pro vazbu C1q, ale pro stejnou vazbu musí být 2 molekuly IgG • • Působení komplementu na erytrocyty • •intravaskulární hemolýza erytrocytů •např. akutní HTR při AB0 neshodě, cold AIHA • •extravaskulární hemolýza v RES = fagocytóza •např. pozdní HTR, HON, warm AIHA • •Inhibiční mechanizmy působí na různých úrovních regulace (C1 INH, DAF, C4BP, CD59…) Imunologická tolerance, autoimunita •Intaktní imunitní systém rozezná vlastní tkáně od cizích •Selhání autoregulačních mechanizmů vede k poruše autotolerance •Reakce lymfocytů uniklých fyziologické regulaci s vlastními antigeny •Různé orgánové projevy – revmatoidní artritida, lupus erytematodes, autoimunní hemolytická anemie •Dědičná dispozice (MHC geny i non-HLA geny) + spouštěcí faktory z okolí (infekce, záněty) • • Laboratorní techniky používané v imunohematologii Cíl: detekce imunních komplexů Ag+Ab • •Aglutinační reakce (antigen = partikule erytrocytů) •Vzácně jiné metody (ELISA, imunofluorescence, FCM, DNA analýza…) •Různé aglutinační techniky - testy sklíčkové, zkumavkové, pevná fáze, sloupcová aglutinace v gelu •Testy při teplotě 20-23°C (RT), 4°C, 37°C • pasivní aglutinace titr Princip přímé aglutinace Titr / prozona - aglutinace kvantitativní Zeta potenciál – elektronegativní pole brání autoagregaci erytrocytů • vazeb Aglutinace •Použití při vyšetření krevních skupin, při vyšetření protilátek proti erytrocytům, v předtransfuzních testech •Vliv komplementu na výsledek reakce/ hemolýza – falešně negativní výsledek- prevence antikoagulací • • 1114-43586 Obrázek1 Aglutinace přímá •Solné prostředí = fyziologický roztok •IgM molekula překlene vzdálenost mezi 2 ery ØIgM = kompletní protilátky Ø Ø Imunohematologie a vyšetřovací metody v imunohematologii. Sláviková M., Holusková I., Galuszková D. Transfuzní oddělení FN Olomouc - PDF Stažení zdarma Přímá aglutinace •1. fáze senzibilizace erytrocytu protilátkou •Vytvoření slabé vazby mezi Ag a Ab závisí na: –Izotypu Ig (IgM, IgG, vzácně IgA) –Teplotě (klinický význam 37°C, při vyšší teplotě disociace molekul Ab z vazby, při nižší teplotě prodloužení inkubace) –Iontové síle prostředí (obsah iontů Na a Cl = izotonický roztok PBS, neutralizující efekt. Při použití LISS rychlejší vznik imunních komplexů) –pH prostředí (přijatelné cca 7. Pro některé Ab individuální. PBS zajišťuje alkalizaci. V nižším pH disociace Ab) –Počtu antigenních míst /densitě ( nadbytek Ag x nadbytek Ab), poměr sérum/erys (snížení vede k vyšší senzitivě testu) •2. fáze vytvoření pevného spojení mezi Ag a Ab (mezi erys) • –Vznik pevných chemických vazeb mezi senzibilizovanými erys (protilátky spolehlivě přemostí a vzájemně spojí erytrocyty) –Lze ovlivnit (vzdálenosti mezi erys) – centrifugací, koloidy, polymery, aditivy testů, chemickými úpravami diagnostik • Aglutinace nepřímá •Zásadní test v imunohematologii •Hlavně pro IgG protilátky, které nejsou schopné přímé aglutinace •Detekuje i jiné typy protilátek podle použitého AGH •Nepřímá aglutinace vyžaduje modifikovat 2. fázi a nějakým způsobem vizualizovat vzniklé imunní komplexy: 1.úprava erytrocytů pomocí enzymů 2.použití testu s AGH sérem (antiglobulin human) • Nepřímá aglutinace 1.Enzymové testy: •Bromelin, ficin, papain, trypsin -štěpí kyselinu sialovou (neuraminovou) na membráně erys, odkrývá antigenní místa a membránové antigeny se tak stávají dostupnější pro protilátky -snižují elektronegativní povrchový náboj erys a vzájemně je přibližují, umožňují tím navázání protilátky -v prostředí s enzymem získává protilátka vyšší schopnost aglutinovat erys (nevýhoda:mohou se demaskovat nežádoucí antigeny/kryptantigen) -Obtížná standardizace enzymových testů (nespecifické reakce) •Jednofázový test (přidání enzymu do reakce) •Dvoufázový test (enzymované erys) • Nepřímá aglutinace 2.Antiglobulinové (Coombsovy) testy: – –Pro vyšetření protilátek v séru a navázaných na erys, zkoušku kompatibility, vyšetření některých krevních skupin –Používají protilátky proti lidským proteinům (antiglobulin = AGH sérum) –Senzitivní technika (až cca 150 molekul Ab/ery) –Různé metody: testy zkumavkové, pevná fáze, sloupcová aglutinace –Modifikace testů se zkrácením doby inkubace v LISS, užití PEG –Riziko chyb a falešných výsledků – AGH testy •AGH detekuje lidské proteiny: protilátky a komplement •Reaktivita AGH s různými lidskými globuliny (anti-IgG,-IgM,-IgA,-C3d..) •AGH reaguje s navázanými nebo volnými protilátkami za vzniku aglutinace • •Dva typy AGH testů: • 1.Přímý AGH test (PAT) pro detekci protilátek navázaných na erys (při in vivo senzibilizaci) • 1.Nepřímý AGH test (NAT) pro detekci protilátek v plazmě/séru (po in vitro inkubaci s erys) Princip AGH reakce NAT Coombs_test_schematic AGH reagencie/séra •Polyspecifické AGH (-IgG, -C3d): •Zásadní důležitost: detekuje IgG protilátky navázané (senzibilizující) na erys i protilátky volně přítomné v séru •Detekuje všechny klinicky významné protilátky • •Monospecifická AGH: •Anti-IgG sérum: detekuje pouze protilátky IgG na erys •(lze použít) •Anti-C3 sérum: detekuje komplement na erys (jen pro •některé situace) • • • • • 18krvinky8 15krvinky5 16krvinky6 Co ovlivní senzitivitu AGH testu? • •Teplota prostředí •Ionty v prostředí •Poměr séra/erytrocytů ( 2kp séra : 1kp ery) •Doba inkubace (pro IgG 15min při 37°C v LISS) • • •Aktuální doporučení: AGH test s použitím roztoku o nízké •iontové síle (LISS), optimální je použití metody sloupcové aglutinace v •gelovém mediu • • • • Nevýhody AGH testů souvisí s promýváním erytrocytů (zkumavkové testy) •Výsledky falešně pozitivní • Spontánní aglutinace (silné aglutininy - aglut. již před promytím), autoprotilátky, kryptantigeny, hypercentrifugace, silikonové zkumavky, volumexpandery, kontaminovaný materiál aj. • • • • • • • •Výsledky falešně negativní • Chyba promytí s neutralizací přidaného AGH volnými protilátkami, časové prodlení, nedodržení teploty, kvalita AGH, podcentrifugování, prozona, technické chyby • • • Kontrola přidáním erytrocytů s navázanou slabou protilátkou k negativnímu test = vznikne aglutinace Pevná fáze, sloupcová aglutinace Automatizace v imunohematologické laboratoři •Automatizace vyšetření: • •Očekávaný technologický vývoj - trend všech laboratoří •Splňuje požadavky na kvalitu procesů/akreditace •Standardizace vyšetření •Zvýšení efektivity a produktivity •Omezení možnosti lidské chyby •Úplná automatizace od příjmu vzorku přes preanalýzu ke konečnému výsledku a vystavení nálezu •Propojení laboratorních modulů/informačních technologií Automatizace v imunohematologické laboratoři •PRO –Zkrácení doby odezvy –Eliminace chyb –Redukce materiálových nákladů –Úspora mzdových nákladů / lidských zdrojů –Využití biologického materiálu –Možnost změn systému • •PROTI –Průchodnost/centrifugace –Prostorová náročnost –Menší flexibilita P4070166 C:\Dokumenty\Lenka Kupská\ID_07_01.jpg Speciální testy v imunohematologii •Eluční testy k disociaci IgG protilátky z vazby na erys •Adsorpční testy k průkazu protilátky/autoprotilátky, k separaci protilátky ze směsi, k průkazu imunních komplexů a léků na erys, k potvrzení slabých antigenů •Určení tříd Ig – odlišení Ig - disociace aglutinátů tvořených IgM protilátkami •Neutralizace (inhibice) protilátky překrývající jinou protilátku (substance) •Stanovení rozpustných krevních skupin – vylučovatelství •Kombinace technik