HLA systém HLA (Human Leukocyte Antigens ) = Hlavní histokompatibilní systém člověka (MHC) Historie vHLA systém je soubor vázaných genů na krátkém raménku chromozomu 6 v vMHC geny nejdříve rozpoznány u myší na základě pokusů s transplantacemi tumorů u myší (1930-1940) v70. léta - již známy 3 lokusy I. třídy HLA-A, -B, -C - HLA antigeny definovány sérologickými a buněčnými technikami - účast HLA molekul v imunitní odpovědi v1974- fenomén HLA restrikce (T lymfocyty rozpoznávají cizorodý antigen pouze v komplexu s HLA molekulami I. nebo II. třídy v80. léta- objev lokusů II. třídy HLA-DR, -DQ, -DP v90. léta- objev tzv. neklasických antigenů lokusů HLA-E, -F, -G, -H, -J, -K, -X - zavedeny techniky HLA typizace na úrovni DNA Struktura HLA systému vNejkomplexnější a nejpolymorfnější systém, každý člověk nese unikátní sestavu HLA alel, výjimka – monozygotní dvojčata v vlokalizace na krátkém raménku 6. chromozomu ( 4100 kb, více než 200 genů ) v vgeny uspořádány do 3 oblastí: HLA I., II., III. třída HLA I. třída (transplantační, klasické antigeny) v vI. třída obsahuje geny HLA –A, -B, -C pro těžký řetězec α HLA molekul v v povrchové glykoproteiny, exprimovány na téměř všech buňkách v neklasické geny HLA-E, -F, -G (glykoproteiny - omezený výskyt) v pseudogeny HLA II. třída v geny pro –α a –β řetězec HLA molekul – DR, -DQ, -DP v v glykoproteiny exprimovány na povrchu tzv. antigen prezentujících buněk (buňky imunitního systému) v v HLA-DM, -DO geny – produkty výskyt v endozomech (naložení cizorodého peptidu na HLA molekulu II. třídy) v v geny LMP2, LMP7 - proteiny, které štěpí cizorodé částice na menší peptidy v v geny TAP1, TAP2- zahrnuty do procesu transportu peptidů do ER ◦ ◦ HLA III. třída vstrukturálně a funkčně odlišné proteiny ◦ v složky komplement C4, C2, faktor B, 21-hydroxylasa, TNF, heat shock protein Hsp 70 ◦ ◦ v v vHLA molekuly I. a II. třídy jsou glykoproteiny složené ze 2 různých proteinových řetězců (heterodimery) v vHLA molekuly I. třídy mají těžký α- řetězec nekovalentně vázaný s β2- mikroglobulinem (gen pro lehký řetězec β2- mikroglobulin lokalizován na chr. 15) vα- řetězec vytváří 3 domény α1, α2,α3 vα1 a α2 vytváří vazebný žlábek pro cizorodý peptid v vHLA molekuly II. třídy se skládají ze 2 glykoproteinových transmembránových řetězců α, β v vKaždý řetězec je složen do 2 domén - α1, α2, β1, β2 v α1, β1 vytváří vazebný žlábek pro cizorodý peptid v Struktura HLA molekul Polymorfismus HLA - počet alel stále roste Lokus Počet alel Proteiny HLA-A 6921 4156 HLA-B 8181 5090 HLA-C 6779 3927 HLA-E 271 110 HLA-F 45 6 HLA-G 88 26 HLA-DRB1 3018 2063 HLA-DQB1 2033 1324 HLA-DPB1 1862 1180 http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html Funkce HLA systému v vPrimární role imunitního systému je rozpoznat a eliminovat nebezpečné cizirodé agens, imunitní systém musí rozlišovat mezi „vlastními“ a „cizími“ antigeny ◦ vHlavní funkcí HLA molekul je předkládat (prezentovat) cizorodé antigeny buňkám imunitního systému, především T lymfocytům v vTato prezentace antigenu je prvním předpokladem pro rozvoj imunitní reakce a tím obrany proti napadení mikroorganismy ◦ vfenomén HLA restrikce - buněčné receptory T lymfocytů (TCR) rozpoznávají cizorodé peptidy pouze vázané v peptidovém žlábku HLA molekuly I. nebo II. třídy v v2 způsoby prezentace antigenů T lymfocytům – endogenní (HLA I. tř.) ◦ - exogenní (HLA II. tř.) q Peptidy prezentované pomocí HLA I. tř. – endogenní zdroj 1. HLA molekuly I. třídy 2. Syntéza virových proteinů na ribosomech 3. Ubiquitin – označení proteinů k likvidaci 4. Proteasom = proteinový komplex k rozštěpení nepotřebných a poškozených proteinů 5. TAP1/TAP2 – transport peptidů do endoplasmatického retikula 6. Naložení peptidu na molekulu HLA I a transport na povrch buňky 7. Cizorodý peptid + HLA I. tř. → CD8+ (Tc lymfocyty) - zabití napadených buněk Peptidy prezentované pomocí HLA II. tř. – exogenní zdroj 1. HLA molekuly II. třídy, vesikulární systém buňky 2. Exogenní antigeny jsou pohlcené (endocytóza, endozóm) - bakterie, paraziti - exogenní zdroj 3. ENDOSOMY,LYSOSOMY - proteolytické štěpení (katepsiny, endopeptidázy) 1. 4. ENDOPLASMATICKÉ RETIKULUM - α a β řetězec MHC II + invariantní řetězec (Ii, CD74) (zabraňuje obsazení vazebných míst vlastními peptidy)⇒ CLIP (CLass II associated Invariant Chain Peptide) 5. Endosom fúzuje s lysosomem (odstranění CLIP a záměna za antigenní fragment pomocí molekuly DM) 6.Transport na povrch buňky 7. Cizorodý peptid + HLA II. tř. → CD4+ (Th lymfocyty) - CD4+ Th1 – zánětlivá odpověď - aktivace makrofágů k zabití patogenu CD4+ Th2 - protilátková odpověd', aktivace B buněk k produkci protilátek HLA molekuly jsou ligandy pro receptory NK buněk vNK buňky (přirození zabíječi), obrana proti infekcím vNK buňky mají na povrchu HLA specifické aktivační a inhibiční receptory, kterými je regulována aktivita NK buněk vHLA molekuly aktivují nebo blokují aktivitu NK buněk vT lymfocyty rozpoznávají přítomnost HLA molekul (vlastní x cizí) vNK buňky rozpoznávají absenci HLA molekul na povrchu buňky (nádorové b., virem infikované b.) Aktivační a inhibiční receptory NK buněk ◦ ◦Zdroj: ◦Quatrini L, Della Chiesa M, Sivori S, Mingari MC, Pende D, Moretta L. Human NK cells, their receptors and function. Eur J Immunol. 2021 Jul;51(7):1566-1579. doi: 10.1002/eji.202049028. Epub 2021 May 10. PMID: 33899224; PMCID: PMC9292411. ◦ Ochrana fetálního allograftu vPlod v těle matky je z poloviny cizí štěp vKlasické HLA produkty I. třídy –A, -B, nejsou exprimovány na buňkách trofoblastu → T lymfocyty jsou k plodu ignorantní vna trofoblastu jsou syntetizovány HLA-C a neklasické molekuly HLA-E, -F,-G → inhibice cytotoxické aktivity mateřských buněk, angiogeneze, vaskulární remodelizace vZávěr: Neklasické HLA molekuly hrají speciální biologickou roli = ochrana vyvijejícího se fetu před mateřskými T a NK buňkami, hrají roli při potlačení imunitní odpovědi matky proti plodu – navození tolerance Úloha HLA molekul v transplantologii vHLA molekuly jsou silné aloantigeny indukující rejekci štěpu v snímek66 087 Zdroj: Lin XX, Xie YM, Zhao SJ, Liu CY, Mor G, Liao AH. Int J Biol Sci. (2022) 4043-4052 ◦ ◦Inhibice cytotoxické aktivity buněk ◦ ◦Sekrece cytokinů a chemokinů ◦ ◦Podpora přestavby placentárních cév ◦ ◦Stimulace placentární invaze trofoblastu ◦ Glioblastoma neoplastic cells– HLA –E, 400x Fig Fig Placental trophoblast cells – HLA – E, G Exprese HLA molekul v HLA I. tř. - všechny jaderné buňky v erytrocyty - mladé erytrocyty - atypický antigenní systém Bga, Bgb, Bgc ◦ - zralé erytrocyty nemají HLA antigeny v plazma – solubilní HLA antigeny v trombocyty – HLA I. třídy ◦ v HLA II. tř. – omezený výskyt: B lymfocyty, makrofágy, dendritické buňky ◦ v exprese HLA antigenů I. a II. třídy může být zvýšena během zánětu, nově indukována na určitých buňkách, na kterých se normálně neexprimují (myocyty, hepatocyty ). v zvýšená nebo nová exprese HLA antigenů je iniciována interferony ◦ v nová exprese HLA antigenů pravděpodobně hraje majoritní roli v patogenezi rejekce transplantovaného štěpu ◦ v snížená exprese HLA molekul - nádorové buňky, virem infikované buňky ◦ typ buňky, tkáně exprese HLA I HLA II BUŇKY IMUNITNÍHO SYSTÉMU dendritické buňky +++ + makrofágy +++ ++ T lymfocyty +++ + B lymfocyty +++ +++ JINÉ JADERNÉ BUŇKY neutrofilní granulocyty +++ - eosinofilní granulocyty +++ - epitelové buňky +++ - hepatocyty + - nervové buňky + - buňky ledvin + - NEJADERNÉ BUŇKY trombocyty ++ - erytrocyty - - Tab.1.: Odlišnosti v expresi molekul HLA I. a II. třídy na různých buněčných typech ( J. Krejsek a O. Kopecký, Klinická imunologie, str. 125, 2004) Srovnání vlastností a funkce HLA I a HLA II ◦Charakteristika HLA I HLA II ◦ ◦Struktura α řetězec + β2m α a β řetězce ◦ ◦Domény α1, α2 a α 3 + β2m α1, α2 a β1, β2 ◦ ◦Buněčná exprese téměř všechny jad.buňky APC (B buňky, dendritické ◦ buňky,makrofágy) ◦ ◦Peptidy vázající místo uzavřené,váže 8-9 amk otevřené, váže 12-17amk ◦ tvořené doménami α1 a α2 tvořené doménami α1 a β1 ◦ ◦Peptidy endogenní antigeny exogenní antigeny ◦ ◦Peptidy prezentované CD8+T buňkám CD4+T buňkám Dědičnost HLA systému v v geny vázané X geny volně kombinovatelné v v HLA geny jsou vázané → děděny „en bloc“ od rodičů jako haplotyp ◦ v HLA geny exprimovány kodominantně – dvě alely v každém HLA lokusu v v crossing-over v HLA oblasti během meiotického dělení = výměna genetického materiálu mezi homologickými chromozómy → rekombinantní sestavy alel (1%) v v frekvence rekombinace je závislá na vzdálenosti mezi geny ◦ v vazebná nerovnováha ( linkage disequilibrium ) - běžná v HLA systému ◦- určité kombinace alel se vyskytují častěji, než by se očekávalo na základě genových frekvencí ◦- určité kombinace HLA alel asi poskytují v některých populacích určitou selekční výhodu ◦Př.: HLA- A1 a HLA-B8 s genovými frekvencemi 0,16 a 0,1 v populaci. Očekávaná frekvence výskytu haplotypu HLA –A1, B8 v populaci by měla být 0,16x 0,1x100%= 1,6%. V některých kavkazských populacích frekvence tohoto haplotypu zdaleka přesahuje očekávanou frekvenci ( 8% ) ◦ Nejčastější haplotypy v různých etnických skupinách ◦ ◦ African Asian Caucasian ◦ Haplotype (freq.%) ◦ 1.A30,B42,DR3 (1,67) A33,B58,DR3 (1.58) A1,B8,DR3 ( 5,18) 2. 2.A1,B8,DR3 (1,25) A33,B44,DR6 (1,46) A3,B7,DR2 (2,63) 3. 3.A3,B7,DR2 (0,76) A24,B52,DR2 (1,38) A2,B44,DR4 (2,15) 4. 4.A2,B44,DR4 (0,65) A2,B46,DR9 (1,35) A2,B7,DR2 (1,8) 5. 5.A33,B53,DR8 (0,63) A33,B47,DR7 (1,34) A29,B44,DR7 (1,47) ♀ ♂ a b c d A2 A24 A1 A3 B7 B44 B8 B27 DR4 DR17 DR1 DR8 a c a d b c b d A2 A1 A2 A3 A24 A1 A24 A3 B7 B8 B7 B27 B44 B8 B44 B27 DR4 DR1 DR4 DR DR17 DR1 DR17 DR8 Dědičnost HLA haplotypů Vznik rekombinantních HLA haplotypů – crossing over ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ HLA-A1; B8; DR3 A1; B44; DR4 ◦ HLA-A2; B44; DR4 A2; B8; DR3 ◦ rekombinantní haplotypy HLA asociovaná onemocnění v 1967 – první zprávy o asociaci HLA systému s onemocněním u člověka v v 1973 – objevena asociace HLA-B27 s ankylozující spondylitidou ◦ (m. Bechtěrev) ◦ v u více než 50-ti onemocnění byla prokázána statisticky významná HLA asociace ◦ v HLA asociované choroby jsou nemaligní chronická onemocnění v v převážně autoimunitní onemocnění v v většina chorob je multifaktoriálních ( geny+ environmentální složka) ◦ v spouštěčem často environmentálním faktory (mikroorganismy, stres) ◦ Některé příklady asociace HLA alel s chorobou: Birdshot retinopathy -A29 RR=200 Ankylosing spondylitis -B27 81,8 Narcolepsy -DQB1*06:02 100 Psoriasis vulgaris -B13, Cw6 4,5 7,2 Celiac disease - DQB1*02, DQA1*05 (DQ2.5) 13,3 - DQB1*03:02, DQA1*03:01 (DQ8) Type I diabetes mellitus - DQB1*02, DQA1*05 10 - DQB1*03:02, DQA1*03:01 Multiple sclerosis -DQ6 4 Rheumatoid arthritis -DR4 4 ANKYLOSING SPONDYLITIS (AS, M. BECHTĚREV) vasociace s HLA-B27 v vzánětlivá forma artritidy, postižení ve větší míře mladí muži v vpostižení začíná obvykle v dolní části páteře, kde zánět napadá kloubní spojení mezi pánví a páteří , nemoc se může postupně šířit nahoru a dolů ke kyčelním a kolenním kloubům. v vdlouhodobý průběh onemocnění, může končit velmi vážnými deformitami v vostatní choroby asociované s HLA-B27 – Reiterova choroba (revmatické onem.,často vyvolávají chlamydie, trojice obtíží: neinf.zánět kloubů, moč.trubice a spojivek) v v Anterior uveitis (přední uveitida - zánět duhovky, řasnatého tělíska) - TYPE I DIABETES MELLITUS ( IDDM ) vsilná asociace s DQA1*05:01/DQB1*02:01 a DQA1*03:01/DQB1*03:02 v kavkazské populaci vprotektivní účinek vůči IDDM je asociován s DQB1*06:02 (DQA1*01:02/DQB1*06:02 ) vIDDM se vyvíjí postupně, dlouhá subklinická etapa spojená s postupujícím poškozením beta buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu, které tvoří inzulin vklinický projev – zničeno asi 90% buněk v vza rozvoj onemocnění zodpovědno více faktorů – geny a negenetická složka ( infekce enteroviry = polioviry, coxsackieviry A, B, echoviry ) vvětšina nákaz virem je asymptomatická CELIAC DISEASE (CD) Predispoziční haplotypy -DRB1*03- DQA1*05:01- DQB1*02:01 (DQ2.5) -DRB1*07- DQA1*02:01- DQB1*02:02 (DQ2.2) -DRB1*04 -DQA1*03:01-DQB1*03:02 (DQ8) v geneticky podmíněné autoimunitní onemocnění v vintolerance glutenu (lepek), trávicí soustava pacienta není schopna trávit potraviny obsahující lepek v vchronický zánět sliznice tenkého střeva, prevalence v ČR 1 : 200-250 obyv. v pro vývoj onemocnění nutné 3 podmínky: - genetické předpoklady - konzumace stravy obsahující lepek - spouštěč onemocnění (stres, trauma, virová infekce) v dlouhodobé průjmy, únava, bolesti kostí, břicha, svalů, u dětí také problémy se zuby, růstem a vývojem v léčba – celoživotní dodržování bezlepkové diety - - - - - - MULTIPLE SCLEROSIS (MS) v slabší asociace s HLA alelami DRB1*15:01, DQB1*06:02 a DQA1*01:02 v vliv faktory genetické i negenetické (vliv prostředí, neznámé imunologické procesy) vchronické zánětlivé demyelinizující onemocnění centrálného nervového systému s nejasnou etiologií a patogenezou - NARKOLEPSIE vneurologické onemocnění, v ČR 2500-5000 osob vhypersomnie – zvýšená denní spavost někdy doprovázená kataplexií (ochabnutí kosterního svalstva) vpravděpodobně autoimunitní onemocnění s dědičným sklonem nastartované vnějším faktorem (streptokoková infekce) namířené proti hypocretinovým neuronům, které mají budivou funkci HLA nomenklatura 1. Serologická definice HLA antigenů – maximálně 2 znaky 1. v antigeny základní – např. A9, A10, B51, B40, Cw3, DR2, DQ3…. v antigeny splitové (subtypy) - sdílejí společné sérologicky definované epitopy např. A10→ A25, 26, 34 B40→ B60, 61 Cw3→ Cw9, 10 DR2→ DR15, 16 DQ3→ DQ7, 8, 9 vantigeny obecné – DR51, DR52, DR53 v HLA= Hlavní histokompatibilní komplex člověka A, B, C, DR, DQ, DP..…lokusy číslo (A1, Cw3) = označení specifity molekuly (antigenu) 2. Molekulárně-genetická definice HLA alel používá znaky dvou a vícemístné HLA-A*02, *31, B*08, *44, C*02, *12, DRB1*04, *13, DQB1*03, *08 - úroveň „low resolution“ HLA-A*01:01, *02:02, B*07:01, *35:01, C*02:02, *03:03, DRB1*04:01, *13:05, DQB1*03:04, *03:05 - úroveň „high resolution“ - Někdy více jak 4 znaky: C*02:02:01, *02:02:02………alely se liší v nukleotidové substituci na úrovni DNA, ne v aminokyselinové sekvenci na úrovni polypeptidu (tichá mutace) A*24:02:01:01 7. a 8. pozice – polymorfismus v nekódující oblasti A*24:02:01:02L „ low expressed“ allele B*51:11N „ null“ allele Metody typizace HLA antigenů 1. serologické metody Complement –Dependent Cytotoxicity Assay ( CDC) = Lymfocytotoxický test ( LCT ) vlymfocyty typovaného jedince jsou nejdříve inkubovány se specifickými antiséry, která jsou rozkapána na mikrotitračních plotnách v vpřidáno králičí sérum jako zdroj komplementu vvazba protilátky se specifickým HLA antigenem na membráně lymfocytu aktivuje komplement, který poškozuje buněčnou membránu v vvitální barvení ( trypanová modř, eosin ), mrtvé buňky se obarví v vmikroskopické hodnocení, hodnotí se procento obarvených ( mrtvých ) buněk, síla reakce -, 2, 4, 6, 8 P1010737 Obraz040 C:\Users\7767\Documents\fotky HLA\LCT 1.jpg C:\Users\7767\Documents\fotky HLA\LCT 2.jpg C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_101456.jpg 2. molekulárně - genetické metody vPCR – polymerázová řetězová reakce vizolace DNA ( plná krev, bukání stěry, krevní skvrny, vlasové folikuly, parafínové tkáňové bloky) vamplifikace DNA ( PCR ) vdetekce PCR produktu Počet kopií DNA - 2n n – počet cyklů (30 – 35) ADN_animation HLA typizace pomocí PCR metod PCR – SSP( sequence – specific priming) PCR – SSO ( sequence – specific oligonukleotide probes ) PCR – SBT ( sequence based typing ) Real-Time PCR NGS – sekvenování nové generace C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_101125.jpg 1. PCR – SSP valelově a skupinově specifické primery určují jednu alelu nebo skupinu alel v vtolik primerových párů, aby mohly být amplifikovány a detekovány všechny známé alely daného lokusu vPCR – SSP může být užita pro „low resolution“ nebo „ high resolution“ vHLA typizace „ low resolution“pro lokusy -A, -B, -DR, -DQ vyžaduje 95 – 100 primerových párů vv každé amplifikační směsi interní kontrola amplifikace vkontrola kontaminace – zkumavka obsahuje všechny reagencie pro PCR kromě templátové DNA vDetekce elektroforeticky, amplikony s menší molekulovou hmotností migrují v gelu rychleji než amplikony s vyšší molekulovou hmotností vvizualizace – obarvení gelu fluorescenční barvou, která se inkorporuje do DNA, expozice gelu UV světlem na transiluminátoru vfotodokumentace Princip SSP-PCR ADN_animation úplná shoda – amplifikace proběhne neshoda – amplifikace neproběhne snímek66 027 snímek66 088 2. PCR–SSO typizace na analyzátoru Luminex Fluoroanalyzátor LUMINEX C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_100208.jpg 3. Real –Time PCR 4. PCR – SBT vpoužutí ddNTPs ( dideoxy nucleotide triphosphates, chybí 3´-OH skupina ), které fungují jako terminátory PCR reakce vddNTPs značeny 4 různými fluorescenčními barvivy, PCR probíhá v 1 zkumavce a elfo v 1 linii vsekvenátor – probíhá kapilární elektroforéza, produkty rozdělovány podle velikosti (rozdíly v délce o 1 nukleotid) vlaserový paprsek snímá koncový fluorescenčně značený ddNTP vinterpretace výsledků pomocí softwaru q 5. NGS = sekvenování nové generace vpříprava genové knihovny vsekvenování vanalýza Nanotype technology ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ gDNA – single tube amplification – quantitation DNA – barcoding – pooling and purification – add sequencing adapters – flow cell check – flow cell priming – mixing library with sequencing buffer and loading beads – library loading - sequencing