4. Interakce světla a tkáně, spektroskopie Interakce světla reflexelom absorpce rozptyl Interakce světlo – hmota Interakce světlo-hmota lze z pohledu přestupu energie rozdělit ● Absorbce fotonu ● Spontální emise fotonu ● Stimulovaná emise fotonu ● Ramanův rozptyl - produkuje fotony s energií (frekvencí) rozdílnou od energie (frekvence) dopadajícího fotonu. Zářivé Auto-fluorescence tkáně Fluorescence z různých částí tkáně Interakce světlo – tkáň Nezářivé Fotochemické - reakce v excitovaném stavu - dochází i při nízké optické hustotě výkonu Fotoablace - přímé porušení buněčných struktur - pomocí vysoké intenzity UV záření Fotodisrupce - vzniká rázová vlna generovaná světelným pulsem - tkáň je dělena mechanickým účinkem vlny - operace oka (šedého zákalu) Tepelné - absorbované světlo je převedeno na teplo - může produkovat srážení, odpaření, spálení a tavení Ablace s vývojem plasmatu - vysokointenzitní krátký puls - dielektrický průraz tvoří ionizované plasma, která interaguje se světlem ke vzniku ablace Rozptyl světla Pružný rozptyl Dopadající a rozptýlené fotony mají stejnou frekvenci Nepružný rozptyl Dopadající a rozptýlené fotony mají různou frekvenci Rayleighův rozptyl - rozptyl na částicích menších, než je vlnová délka - rozptyl závisí na λ-4 , tedy výrazněji pro modrou - rozptyl ve směru a v protisměru dopadajícího světla je stejný Mieův rozptyl - rozptyl na částicích větších oproti velikosti vlnové délky - slabší závislost na λ-X , 0.4 ≤ X ≤ 0.5 - je preferován rozptyl ve směru dopadajícího světla Brillouinův rozptyl - interakce elektromagnetické vlny se změnami indexu lomu materiálu způsobenými akustickým vlněním Ramanův rozptyl - rozdíl energie generuje vibrační excitaci v molekule Osud excitované molekuly (*) cis-but-2-ene trans-but-2-ene Vibrační stav molekuly ● je řešením Schrödingerovy rovnice molekuly ● dvouatomová molekula dovolující jen jeden vibrační stupeň volnosti (stlačení, natažení) má jednoduché řešení ● energie pro vibrační pohyb jader je dána Morseho potenciální energií , je silovou konstantou v místě minima pot. energie ● k popsání stacionárních stavů na Morseho potenciálu lze vyřešit Schrödingerovu rovnice, pomocí této harmonické aproximace s okrajovou podmínkou pro je Ev=(ν+ 1 2)hn Ψvib (x)=0 x=∞ ν = vibrační kvantové číslo = 0, 1, 2, atd., n = vibrační frekvence (k/μ)1/2 , μ = redukovaná hmota = ma ·mb /(ma + mb ) a ma a mb jsou hmotnosti jader, tvořících vazbu Vibrační stav molekuly ● Znázornění elektronových a vibračních stavů molekuly ● Přechody se řídí pomocí Franck–Condonova principu ● Celková energie molekuly závisí nejen na elektronovém stavu E0 a E1, ale také na vibračních číslech ν' a ν'' značící vybrační stavy základního elektronového stavu a elektronového excitovaného stavu. Absorpce Emise Spektroskopie ● Spektroskopie se zabývá charakteristikou a aplikací přechodu mezi dvěma kvantovaným stavy atomu, molekuly, nebo shluku molekul. ● Spektrum je závislost výstupní intenzity světla opouštějící vzorek na jeho frekvenci (nebo vlnové délky). Spektroskopie Elektronové Přechod mezi dvěma stavy elektronu; spojováno s vibracemi Vibrační přechody zahrnující současné změny elektronových a vibračních stavů Vibrační Absorpční Přechod z nízkého (obvykle základního) do excitovaného energetického stavu je používán širokopásmový zdroj světla. Spektrum je získáno zeslabením nebo absorpcí Elektronové Přechod mezi dvěma stavy elektronu; spojováno s vibracemi Infračervená absorpční Absorpce IR fotonu k přechodu ze základního do vyššího vibračního stavu Ramanův rozptyl Rozptyl fotonů ve viditelném spektru produkovaných změnou vibračního stavu Emisní Přechod z vyššího do nižšího stavu Fluorescenční Spin excitovaného elektronu se nemění Fosforescenční "zakázaný" přechodu spinu Pozn.: Pro emisí spektrum nebo pro Ramanovo spektrum je použito excitace na specifické vlnové délce (tzv. excitační vlnová délka). Spektrum je získáno detekcí emitovaného světla. Absorpční spektroskopie ● Beer-lambertův zákon k je molární útlumový koeficient, který je závislý na frekvenci ν, c je molární koncentrace (mol/L), b je optická dráha paprsku v měřeném prostředí Absorpční spektrum chlorofylu Fluorescenční spektroskopie ● Emise je spojena s přechodem z excitovaného elektronického stavu do nižšího stavu (zpravidla základního stavu). ● Absorpce fotonů produkuje fluorescenční pásmo, které je červeně posunuto (na nižší energii). Tento posun mezi maximem absorpčního a fluorescenčního pásma se nazývá Stokesův posun. Velikost Stokesova posunu je závislá na velikosti relaxačního procesu, který se dostaví po absorpci. Rozdíl v energii absorbovaného fotonu a emitovaného fotonu odpovídá energetickým ztrátám v důsledku nezářivých procesů. ● Zpravidla modul připojitelný ke konfokálnímu mikroskopu. Ramanova spektroskopie ● Foton viditelného spektra (argon-iontový laser s vlnovou délkou 488 nm nebo 514.5 nm) je rozptýlen a spektrálně posunut. Rozdíl frekvence je souvislý se změnou vibrační energie molekuly. ● Pokud je frekvence rozptýleného fotonu nižší, než dopadajícího fotonu, je indukován vibrační přechod z tepelně nižší úrovně na vyšší. Nazývá se StokesRamanův rozptyl a jemu odpovídají ve spektru Stokesovy Ramanovy čáry. ● Pokud je frekvence rozptýleného fotonu vyšší, než dopadajícího fotonu, je indukován přechod z vyšší vibrační úrovně na nižší úroveň. Vznikají antiStokesovy čáry. ● Efektivita Ramanova rozptylu je slabá. Typicky jeden ze 105ti fotonů je rozptýlen za vzniku frekvenčně posunutého fotonu. Pro excitaci se používá laser s vysokou intenzitou světla. ● Možnost měření vzorků bez nutnosti speciální přípravy, integrovatelné do mikroskopu, častá kombinace s optickou pinzetou. LIBS - LASER-INDUCED BREAKDOWN SPECTROSCOPY ● Atomová/molekulární spektroskopická technika, která využívá vysokovýkonných pulzů laseru k odpaření malého množství preparátu. ● Při odpaření vzniká plasma s vysokou teplotou (10 000 K – 20 000 K), ve které jsou molekuly excitovány a ionizovány. ● Při chladnutí plasmy ztrácejí atomy energii za vzniku spontální emise světla, které je sbíráno a spektrálně analyzováno. Tomografie tkání ● Využívá Roentgenovo záření ● Záření je při průchodu tkání absorbováno specificky dle druhu tkáně ● Princip snímání – postupné snímkování při rotaci dvojice zdroj – detektor okolo snímané tkáně Tomografie tkání ● Zaznamenávají se rentgenové snímky pomocí detektorů (PMT, maticové detektory) ● Z jednotlivých snímků je možno rekonstruovat 3D obraz vzorku pomocí numerických metod (Radonova transformace) na grafických kartách s CUDA jádry. ● CUDA (Compute Unified Device Architecture) je hardwarová a softwarová architektura, která umožňuje na GPU spouštět programy při paralelních výpočtech. https://www.youtube.com/watch?v=-P28LKWTzrI Tomografie tkání CT spočtené na grafické kartě za 2 vteřiny. Řez krysí kostí. Radioterapie ● Proces interakce radioaktivního záření lze rozdělit do několika stádií – Fyzikální stádium - ionizace a excitace atomů. Trvá 10-16 až 10-14s. – Fyzikálně-chemické stadium - vznik volných kyslíkových radikálů (hydroxylový, superoxidový, perhydroxylový). Trvá 10-14 až 10-10s. – Chemické stádium - volné radikály reagují a poškozují biomolekuly. V případě DNA dochází k poškození všech jejích složek (bází, cukrů, fosfátů), vazeb a zlomům vláken DNA. Jednoduché zlomy vznikají častěji a buňka je schopna je ve většině případů opravit. Dvojité zlomy vznikají při poškození obou vláken současně nebo ze dvou jednoduchých zlomů blízko u sebe. Toto poškození buňka již hůře opravuje. Chemické stadium trvá od tisícin sekundy do řádově jednotek sekundy. – Biologické stádium - dochází k rozvoji biologické odpovědi. V buňce jsou aktivovány signální řetězce, kterými buňka rozpozná signál o poškození DNA. Další postup závisí na míře poškození a stadiu buněčného cyklu, ve kterém se buňka nachází. ● Buněčný cyklus je kontrolován v několika kontrolních bodech. Nejdůležitější je místě přechodu G1/S fáze a dále G2/M fáze. Nejdůležitějšími proteiny kontrolující buněčný cyklus je p53, pRB a ATM/ATR. Protein p53 se označuje jako strážce genomu a působí v přechodu G1/S fáze. Jeho aktivace v G1 fázi vede k zastavení buněčného cyklu a zahájení oprav DNA. Po skončení oprav se množství p53 sníží a cyklus pokračuje dál k replikaci. Jestliže dojde k poškození v předmitotické fázi nebo je-li poškození tak závažné, že nelze opravit, p53 vede buňku k buněčné smrti cestou apoptózy (programovaná smrt). Radioterapie ● U rychle proliferujících buněk se radiační poškození projeví dříve (kostní dřeň, epitel, gonády) než u buněk neproliferujících (nervové buňky). Radiosenzitivní bývají také tkáně s rychle se dělícími a málo diferencovanými buňkami. Radiorezistentní jsou naopak tkáně s nedělícími se buňkami a dobře diferencované. U rychle proliferující tkáně se poškození projeví akutně. Pomalu proliferující tkáně mívají pozdní toxicitu. ● Mezi radiosenzitivní nádory patří hematologické malignity, seminom, meduloblastom, Ewingův sarkom. ● Mezi radiorezistentní nádory patří sarkomy, maligní melanom, meningeom. ● Patersonův graf znázorňuje počet zničených nádorových a zdravých buněk v závislosti na dávce záření. Křivka t představuje populaci zničených nádorových buněk. Dávkou v bodě L jsou usmrceny všechny nádorové buňky. Při aplikaci dávky nižší než v bodě O nedojde k ničení nádoru. Křivka z znázorňuje obdobnou situaci u zdravých buněk, přičemž v bodě Q se začíná prudce zvyšovat riziko nevratného poškození zdravé tkáně. Dle vlastností nádoru a tkání, které jej obklopují, se jednotlivé křivky od sebe vzdalují nebo přibližují. Posun křivky t doleva značí zvýšení radiosenzitivity, posun doprava znamená zvýšení radiorezistence. Radioterapie ● Konformní radioterapie, resp. trojrozměrná konformní radioterapie (3D-CRT) – standardní léčebná metoda. – ozařovaný objem je individuálně přizpůsoben nepravidelnému trojrozměrnému tvaru cílového objemu. – Základem pro 3D plánování je použití trojrozměrných zobrazovacích vyšetření - CT vyšetření, MR vyšetření ● IMRT radioterapie - Radioterapie s modulovanou intenzitou (IMRT - Intensity Modulated Radiation Therapy) – vyspělejší forma 3D-konformní radioterapie. – upravena intenzita (fluence) svazku záření. – možno ozařovat geometricky složitější cílové objemy a dosáhnout i většího šetření zdravých struktur. ● IGRT - Image Guided Radiation Therapy – poloha cílového objemu se mění v důsledku pohybů vnitřních orgánů – speciální zobrazovací 3D systém přímo na ozařovacím přístroji ● Stereotaktická radioterapie a radiochirguie – Léčba prováděna jednorázově a tím napodobuje chirurgický výkon. – vysoká dávka záření (12-25 Gy) je aplikována do ozařovaného ložiska o maximálním průměru 3-3,5 cm. – gama nůž a lineární urychlovače s mikrokolimátorem či konickými tubusy (X nůž), CyberKnife, TomoTherapy ● 4D-konformní radioterapie – zohledňuje změny cílového objemu v aktuálním čase způsobené fyziologickými pohyby orgánů, které nastávají v průběhu léčby (pohyb tumoru v průběhu dýchacího cyklu)