5. Světelná mikroskopie AúúalLookaxT) everyone! ^ IVs Q coverskpíj Eyepiece In Draw Tube - Coarse Focussing Adjustment Body Tube—^ Dustproof Triple Nosepiece Fine Adjustment Mechanism Life on a microscope slide Limb Substa^e Rackwork Focussing Mech anism Mikroskopový objektiv Manufacturer, Flat-Field Correction Linear Magnification Specialized Optical Properties Tube Length Cover Slip Thickness Screw Thread Aberration Correction merical Aperture Immersion Medium Working Distance Color Code Finger Grip Spring-Loaded Front Lens Otvorová vada objektivu nulová pozitivní • lze způsobit také krycím sklíčkem či vrstvou preparátu Ohraničení svazku aperturní clona (výstupní pupila) Flat-Field Correction Linear Magnification Specialized Optical Properties Tube Length Cover Slip Thickness Aberration Correction Numerical Aperture Immersion Medium Working Distance Color Code Finger Grip Spring-Loaded Front Lens NA - n sin a Zobrazení bodu - PSF (point spread function) Airy Disk (a) Tube Lens — Objective Point Source The Airy Disk and Point-Spread Function (c) 84 Percent 4» I of Intensity J x-z Intensity Distribution A A Point-Spread Function Figure 3 Rozlišení mikroskopu d0=0.61 Á/NA The Rayleigh Criterion Airy Disk 2 a%A--A A Figure 4 Airy Patterns and the Limit of Resolution Resolution Um« I Resolved. Unresolved I 7 M \ / v Airy / Patterns — 3 Dimensional Point Spread Function Figure 1 Složený mikroskop -světlé pole pupila oka okular m = mob,mokul Flat-Field Correction Linear Magnification Specialized Optical Properties Tube Length Cover Slip Thickness polní clona (měřicí rysky) primární zobrazení aperturní clona objektivu ohnisková rovina objektiv vzorek kondenzor aperturní clona kondenzoru ohnisková rovina polní clona kolektor zdroj Složený mikroskop s nekonečnou tubusovou délkou do oka okular primární zobrazení v ohnisku tubusové V V I cocky Flat-Field Correction. Linear Magnification ■ Specialized Optical' Properties Tube Lane plan 60X/1. -DIC ,/D.17 \ Cover Slip y m* ^^^^ Thickness^ tubusová čočka objektiv vzorek v ohnisku objektivu kondenzor aperturní clona kondenzoru ohnisková rovina Barevná vada i (index lomu materiálu pro Abbeovo číslo: A - l™f°fe™l ?ry d'/c'cC; „ j- 587,6 nm, 486,1 nm, 656,3 "F " nC nm) podmínka pro achromaticky dublet:--1--—U Al A2 FK fluorite crown PK phosphate crown PSK dense phosphate crown BK borosilicate crown BaK barium crown SK dense crown K crown LaK lanlhanum crown SSK very dense crown BaLF barium light flint KF crown/flint LaSF lanthanum dense flint LaF lanlhanum flint BaF barium flint BaSF barium dense flint LLF very light flint LF light flint F flinl SF dense flint ZK zinc crown KzSF special short flint 5iA Si PK •S1A FK 90 80 70 60 50 Abbe number V 40 30 20 Apochromaticky objektiv apochromát (Abbe 1886) Á Flat-Field Correction Linear Magnification Specialized Optical Properties Tube Length Cover Slip Thickness Aberration ^Correction Numerical Aperture Immersion Medium Working Distance Color Code Finger Grip Spring-Loaded Front Lens "I \-*t»m jeden z prvních apochromatických objektivů Také: • superachromát (korigovány 4 barvy) • semiapochromát (fluorit CaF2/ fluoritová skla, A = 80 - 95) Temné pole • první kondenzory pro temné pole kolem 1855 (G. Shadbolt, F, H. Wenham) • metoda odstínění nerozptýleného světla • rozlišení jako u světlého pole, kontrast podstatně zesílen Darkfield Microscope Optical Configurations Zern i ků v fázový kontrast Umožňuje kontrastní zobrazení fázového vzorku pomocí fázové destičky vložené do zadní ohniskové roviny objektivu. (Světlo rozptýlené fázovým vzorkem je fázově posunuto. Fázové posunutí mezi paprsky nerozptýlenými a rozptýlenými je dále (a vhodně) zesíleno fázovou destičkou. V obrazové rovině pak dochází k interferenci.) Nevýhody: halo efekt, neznalost velikosti fázového posunutí paprsků, které prošly vzorkem (fázový kontrast není kvantitativní) nemožno určit rozložení hmoty buňky. fázová deska obrazová rovina Zernikův fázový kontrast Phase Contrast Objective Zern i kův fázový kontrast zobrazení buněk Rousova sarkomu pomocí fázového kontrastu „halo-efekt" zobrazení lidských fibroblastů pomocí fázového kontrastu JANEČKOVÁ, H.; VESELÝ, R; CHMELÍK, R.: Proving Tumour Cells by Acute Nutritional/Energy Deprivation as a Survival Threat: A Task for Microscopy, Anticancer Research, 29 (2009) 2339-2345 Mikroskopie s polarizovaným světlem Polarized Light Microscope Configuration Recombined Light Rays After Interference Eyepieces DXM 1200 —Digital Eclipse Camera System Camera ^Extension Tube Extra-Ordinary— Ray Plane Polarized Light Light From Source -Analyzer— —Ordinary Ray Birefringent Specimen —Polarizer Epi-lllurninator for Reflected Polarized Investigations Strain-Free Objectives Circular Rotating Stage —Microscope Stand Focus http://micro.magnet.fsu.edu/ Mikroskopie s polarizovaným světlem Birefringent Crystals Between Crossed Polarizers Sample — h~ Tw0 ComPonents Thickness Resulting From /{) Birefringence http://micro.magnet.fsu.edu/ Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) Differential Interference Contrast Schematic Light to -Eyepieces Analyzer Objective Objective —Wollaston (Nomarski) Prism Orthogonal Sheared •ST > š Condenser Condenser —Wollaston (Nomarski) Prism —Polarizer Litjht from -Semi-Coherent Source http://micro.magnet.fsu.edu/ Transmisní interferenční mikroskop HORN Eyepiece o- Objectives H> (gj^ Specimen jj^- Object beam X JV <- Condensers -> V # Optical \^ wedge|íŕ \ Beam splitter,. Dummy specimen Reference beam \ Stepper motor JAMIN-LEBEDEFF Eyepiece Analyzer t Sénarmont [ compensator Reference _|> beam n. jí. Stepper ^ motor Objective Beam combiner Specimen <$ o- Object j beam Beam splitter Condenser i Polarizer Kvantitativní fázový kontrast I(x, y) = /0{1 + ycos[(p(x,y) + ô]} 4.5 Trasmisni uspořádaní ON aktivace několika molekul vzdálenost > 0,61 X/NA _L PSF jedné fluoreskující molekuly vytváření kumulativní mapy souřadnic všech fluorochromů 4 superrezoluční obraz objektu ► Superresolution Imaging of Microtubules with STORM STORM -DO rim 300.00 run 100.00 nm 0jQ0 Tim IQO 00 nm ■20Ú.0Ů nm ■300.00 nit> 4ŮŮ.0Ů nm ■300.00 fitrt Struktura tubulinu STORM Tungsten-Halogen Lamphouse Microscope Configuration for Two- and Three-Dimensional STORM Imaging Filter Wheel Shutter Combination Precision Motorized Stage EM CCD Camera System Stage Controller Figure 2 Axial Focus dSTORM/GSD (Ground State Depletion) A objekt s fluorescenční sondou OFF^ ON aktivace několika molekul vzdálenost > 0.6U/NA PSF jedné fluores kující molekuly vytváření kumulativní mapy souřadnic všech fluorochromů ► superrezoluční obraz objektu Struktura vimentinu SIM (structured illumination microscopy) Do roviny vzorku jsou promítány moiré proužky s různou fází a orientací. Proces je snímkován a výsledný obraz je pomocí Fourierovských metod skládán v prostorově frekvenční oblasti. Rozlišení výsledného obrazu odpovídá použití objektivu s dvojnásobnou NA. Kombinuje se s metodou TIRF 100 nm fluoreskující kuličky SIM (structured illumination microscopy) Srovnání 3D zobrazení synapsí. Konfokální mikroskop (vlevo) a 3D-SIM (Zeiss Elyra, vpravo). Zeleně je synaptický F-aktin značený F-Tractin. Červeně je aktivní zóna, značená protilátkou. Citovaná literatura P. N. Prasad: „Introduction to Biophotonics", John Wiley & Sons, Inc., 2003. J. Čolláková a kol. "Multimodální holografický mikroskop - společný projekt VUT a TESCAN". Jemná mechanika a optika, 2014, roč. 59, č. 6-7/ 2014, s. 160-162. ISSN: 0447- 6441. Z. Dostál: "Interferenční a holografická mikroskopie", přednáška, ÚFI VUT P. N. Prasad: „Introduction to Biophotonics", John Wiley & Sons, Inc., 2003. M. Mir, B. Bhaduri, R. Wang, R. Zhu, G. Popescu, „Quantitative Phase Imaging". In E. Wolf (Ed.), Progress in Optics, Vol. 57 (pp. 133-217). Amsterdam: Elsevier, 2012 G. Popescu, „Quantitative phase imaging of cells and tissues". New York: McGrawHill, 2011 M. K. Kim, Digital Holographic Microscopy. Principles, Techniques, and Applications. New York: Springer, 2011 W. Drexler, M. Liu, A. Kumar, T. Kamali, A. Unterhuber, R. A. Leitgeb, „Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality", Journal of Biomedical Optics 19(7), 071412 (July 2014) J. Pawley, „Handbook of Biological Confocal Microscopy", Springer, 2006 Nikon microscopy, [online], http://www.microscopyu.com/moviegallery/sweptfield/index.html Ziess microscopy, [online], http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/home.html Leica microscopy, [online],http://www.leica-microsystems.com/