CYTOGENETIKA základní pojmy vytvořilo CMBG FN Brno zpracovala Mgr. Navaříková [USEMAP] DEFINICE A HISTORIE •klinická cytogenetika se zabývá analýzou chromosomů (jejich počtem a morfologií), jejich segregací v meióze • a mitóze a vztahem mezi nálezy chromosomových • abnormalit a fenotypovými projevy. •vznik moderní lidské cytogenetiky se datuje od roku 1956, kdy Tjio a Levan vyvinuli efektivní metodiky analýzy chromosomů a stanovili, že normální počet lidských chromosomů je 46. [USEMAP] SCHEMA LIDSKÉ SOMATICKÉ BUŇKY • buněčné jádro •(DNA +proteiny + RNA) img003 cytoplasma s organelami (DNA v mitochondriích) klinická cytogenetika se zabývá analýzou chromosomů, které vznikají spiralizací molekul DNA lokalizovaných v buněčném jádře [USEMAP] interf buňka ZMĚNA ORGANIZACE GENETICKÉHO MATERIÁLU BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU SOMATICKÝCH BUNĚK chromosomy = spiralizované molekuly DNA počet chromosomů člověka = 46 (mitóza) DNA rozptýlená v buněčném jádře (interfáze) img001 chromosomy vznikají při buněčném dělení [USEMAP] GENETICKÝ MATERIÁL JÁDRA BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU • •Buněčný cyklus somatických buněk (interfáze, mitóza, cytokineze) • •- G1, S, G2 fáze = INTERFÁZE • nejdelší fáze buněčného cyklu, • chromatin je málo kondenzovaný • (různé stupně spiralizace) •- M fáze = MITÓZA + cytokineze • dělení jádra a následně buňky - • kondenzace chromatinu, • vznik chromosomů, rozchod • chromosomů do dceřiných buněk bun cyklus img008 img008 img008 Spiralizované chromosomy v metafázi mitózy vyšetřujeme ve světelném mikroskopu. [USEMAP] CHROMATIN A CHROMOSOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromosomů •Během buněčného cyklu se chromatin nachází •v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký •stupeň spiralizace, během mitózy postupná •kondenzace, maximální v metafázi mitózy) C:\Users\3750\Desktop\struktura chromosomu.jpg Ou H.D. et.al: ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells Science. 2017 July 28; 357(6349): . doi:10.1126/science.aag0025. Hierarchical chromatin-folding model. [USEMAP] CHROMOSOMY V PRAXI •metafázní chromosom – součástí jsou 2 sesterské chromatidy schema chromosomu chromosom s G- pruhy 12-8 zlomy1 img001 chromosom konvenčně barvený q dl ram text p kr ram text centrom text sest chromatidy text 1151-06wcp chromosom metoda FISH telomerická oblast telomerická oblast [USEMAP] CHROMOSOM •centromera = heterochromatinová oblast, místo rozdělení krátkých a dlouhých ramének, místo spojení sesterských chromatid, místo tvorby kinetochorů v meióze a mitóze, (primární konstrikce, zaškrcení) • •telomera = specifická DNA sekvence na koncích každého chromosomu (každé chromatidy, dvoušroubovice DNA), která zajišťuje integritu chromosomu během buněčného dělení (repetitivní hexamer (TTAGGG)n) v komplexu s proteiny [USEMAP] Světelný mikroskop + systém analýzy obrazu mikroskop 004 Chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení 1000x – 1250x za použití imerzních objektivů. Při vyšetření je preparát prosvěcován viditelným světlem. Dokumentaci mitóz a třídění chromosomů, sestavení obrázku – karyogramu provádíme v dokumentačním systému (Lucia, Laboratory Imaging,s r.o.) přednáška 059 přednáška 054 přednáška 056 kamera [USEMAP] CHROMOSOMY - KARYOTYP •karyotyp = soubor chromosomů v somatických buňkách pacienta, který po zhodnocení minimálně 10 mitóz získaných z vyšetřované tkáně charakterizujeme zápisem a doplňujeme karyogramem (obrázkem vytvořeným z nasnímaných chromosomů z jedné mitózy, které jsou utříděné do párů a skupin). Zápis karyotypu pacienta souhrnně vyjadřuje karyotyp všech zhodnocených mitóz v jeho vyšetřované tkáni. V zápisu označujeme počet chromosomů, pohlavní chromosomy a případné patologické změny (zápis karyotypu pacienta, jehož karyogram je vpravo, je 46,XY) •normální lidský karyotyp se skládá • ze 46 chromosomů, z toho je 22 párů • autosomů (nepohlavních chromosomů) • a 2 gonosomy (pohlavní chromosomy) • • chromosomový pár (homologní chromosomy) obrázek karyotypu - karyogram = utříděný a zhodnocený soubor chromosomů jedné buňky [USEMAP] ZÁPIS KARYOTYPU •46,XX - normální ženský karyotyp •46,XY - normální mužský karyotyp počet chromosomů v buňkách pacienta typ pohlavních chromosomů [USEMAP] KARYOTYP normální mužský karyotyp 46,XY [USEMAP] KARYOTYP normální ženský karyotyp 46,XX [USEMAP] CHROMOSOMY - třídění do skupin podle velikosti a centromerického indexu normální mužský karyotyp 46, XY norm mužský A text B text C text D text E text F text G text Pohlavní chromosomy: Chromosom X řadíme do skupiny C, chromosom Y do skupiny G Centromerický index (CI) – na základě této veličiny dělíme lidské chromosomy na metacentrické, submetacentrické a akrocentrické. CI se vypočítá jako poměr délky krátkých ramen chromosomu (p) vůči délce celého chromosomu (součtu délek krátkého a dlouhého raménka p+q) CI = p/(p+q) [USEMAP] CHROMOSOMY - třídění podle umístění centromery (centromerického indexu CI) •metacentrické chromosomy • centromera blízko středu chromosomu • nebo uprostřed, krátká a dlouhá raménka • jsou přibližně stejně dlouhá • •submetacentrické chromosomy • centromera mimo střed chromosomu, p a • q raménka jsou jasně délkově odlišena • submetacentr metacentr Poloha centromery označena modrou šipkou norm mužský 18 20 norm mužský 3 1 8 5 norm mužský [USEMAP] CHROMOSOMY - třídění podle umístění centromery (centromerického indexu CI) •akrocentrické chromosomy - centromera je umístěna velmi • blízko jednomu konci chromosomu, ale není úplně na konci, • chromosom nese krátká i dlouhá raménka • • 1) Pro chromosomy 13, 14, 15, 21, 22 platí: • od krátkých ramének jsou odškrceny satelity • (malé výrazné části chromatinu); místo • odškrcení = sekundární konstrikce (tenké • stopky); (sekundární konstrikce obsahuje kopie • genů kódujících rRNA = organizátor jadérka NOR • nucleolus organizer region) • • akrocentr 13 22 Poloha centromery označena modrou šipkou 2) K akrocentrickým chromosomům řadíme na základě centromerického indexu i chromosom Y, i když narozdíl od chromosomů 13, 14, 15, 21, 22 nenese na krátkých raméncích satelity [USEMAP] JADÉRKO •difuzní struktura v jádře, která není ohraničena membránou •dochází v ní k syntéze podjednotek ribosomů (ribosomy – bílkovinné struktury, které se účastní syntézy bílkovin v cytoplazmě) – geny pro syntézu lokalizovány v oblasti sekundární konstrikce akrocentrických chromosomů •je přítomno v interfázním jádře, mizí v mitóze img010 norm mužský jaderná membrána jadérko [USEMAP] VARIANTY NORMY – není patologie! 1 9 16 U všech akrocentrických chromosomů: 13,14,15,21,22 Y C:\Users\3750\Desktop\1.jpg [USEMAP] Spiralizace chromosomů v mitóze 400 pruhů 550 pruhů 850 pruhů v haploidní sadě chromosomů (bphs – bands per haploid set) skala spiralizace Směr postupné spiralizace chromosomů během mitózy IDIOGRAMY pro chromosom 1 [USEMAP] IDIOGRAMY číslování pruhů na chromosomech •pruhy na každém raménku jsou očíslovány vzestupně od centromery k telomeře •s postupnou kondenzací chromosomu během mitózy se zmenšuje počet pruhů •číslo pruhu umožňuje jednoznačnou identifikaci každého pruhu • Směr číslování pruhů (od centromery k telomeře) [USEMAP] Kritéria pro posouzení počtu pruhů v haploidní sadě chromosomů [USEMAP] STANOVENÍ POČTU PRUHŮ V HAPLOIDNÍ SADĚ CHROMOSOMŮ bphs – bands per haploid set Při analýze karyotypu u pacientů je třeba pracovat s dostatečně dlouhými chromosomy aby mohly být odhaleny menší strukturní aberace, jejichž velikost je na hranici rozlišovací schopnosti metody G-pruhování chromosomů (5-10Mb). Chromosomy v mitóze by měly být tak dlouhé aby počet proužků v haploidní sadě chromosomů byl alespoň 550. V praxi není možné počítat v každé mitóze všechny proužky na každém chromosomu, proto byl vypracován jiný systém pro posouzení délky chromosomů. Jestli naše mitóza, se kterou pracujeme, má alespoň 550 pruhů, zjistíme následujícím způsobem. Tabulka 1.2 na předchozí stránce zahrnuje výčet proužků na konkrétních chromosomech, které je třeba v preparátu vidět, aby bylo možné usuzovat na konkrétní délku chromosomů. Na následujících stránkách je patrné, že proužky, které jsou v tabulce uvedené jako rozlišovací pro délku 550 pruhů, nejsou patrné na kratších chromosomech. Systém analýzy obrazu, program Lucia, počítá počet pruhů na chromosomech automaticky, ale tento počet je pouze orientační. [USEMAP] Kritéria pro posouzení počtu pruhů v haploidní sadě chromosomů C:\Users\3750\Desktop\8.jpg 8 Modrou šipkou označen světlý pruh p21 – nepřítomnost tmavého pruhu p21.2 na příliš krátkém chromosomu 8. Červenou šipkou je označen tmavý pruh p21.2, který je přítomen na dostatečně dlouhých chromosomech 8. [USEMAP] TYPY CHROMOSOMOVÝCH ZMĚN, které lze laboratorně vyšetřit - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ZMĚN – prenatální a postnatální vyšetření konstitučního karyotypu konstituční karyotyp se nemění v průběhu života pacienta - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření % aberantních buněk lze snížit % aberantních buněk na normu vitamínovou léčbou - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT (u onkologických onemocnění) vyšetření z nádorové tkáně karyotypu maligních klonů (toto téma bude předmětem prezentace přednášejícího z onkocytogenetické laboratoře) [USEMAP] •Kontakt pro dotazy: Navarikova.Marta@fnbrno.cz