Metody molekulární cytogenetiky
Hana Filková
Oddělení lékařské genetiky
FN Brno
Oddělení lékařské genetiky FN Brno
Genetická
ambulance
Laboratoř DNA/RNA
diagnostiky
Cytogenetické
laboratoře
l. prenatální
cytogenetiky
l. onko-
cytogenetiky
l. postnatální
cytogenetiky
Oddělení lékařské genetiky FN Brno
Genetická
ambulance
Laboratoř DNA/RNA
diagnostiky
Cytogenetické
laboratoře
l. prenatální
cytogenetiky
l. onko-
cytogenetiky
l. molekulární
cytogenetiky
l. postnatální
cytogenetiky
Materiál pro cytogenetické
vyšetření
 periferní krev
 buňky kostní dřeně
 vzorky různých tkání (biopsie kožní)
 buňky plodové vody, choriových klků, placenty
 pupečníková krev
 vzorky solidních nádorů
Metody využívané na OLG FN Brno
FISH (fluorescenční in situ hybridizace) r. 1996
detekce balancovaných i nebalancovaných změn
r. 2000
CGH/HR-CGH(komparativní genomová hybridizace)
detekce nebalancovaných změn v celém genomu
CGH (5-10Mb), HR-CGH (do 3Mb)
Spektrální karyotypování (SKY) r.2002
detekce balancovaných i nebalancovaných změn v genomu
nutnost mitóz
Array-CGH r.2008
Agilent´s Human CGH Microarray Kit
Detekce nebalancovaných změn v celém genomu
MLPA (Multiple Ligation-dependend Probe Amplification)
Screening subtelomerových oblastí
DiGeorge syndrom
FISH = fluorescenční in situ hybridizace
 1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení
 1986 Pinkel a spol. - fluorescenční značení (FISH)
Hybridizace sondy (značené fluorescenčním barvivem) s chromozómy
na cytogenetickém preparátu
Postup FISH
Zhotovení kvalitních preparátů
1. Denaturace sondy i cílového místa
2. Hybridizace
3. Odmytí
4. Barvení pozadí
5. Hodnocení pomocí fluorescenčního mikroskopu
Umožňuje detekci balancovaných i nebalancovaných změn
v interfázních buňkách i v mitózách
FISH
Příprava
chromozomových
preparátů
Vyhodnocení
na fluorescenčním
mikroskopu
Značená sonda
hybridizovaná
s cílovou sekvencí
Sonda
D e n a t u r a c e
H y b r i d i z a c e
Značení
fluorochromem
Cílová sekvence
FISH
FISH : Typy sond
 Celogenomové
 Celochromozomové
 Centromerické
 Sondy telomerické,
ramenově či pruhově specifické
 Sondy pro jedinečné sekvence:
a) plazmidové (500pb-5 kb)
b) kosmidové (20-50 kb)
c) bakteriofág lambda (8-15 kb)
d) YAC klony (50-1000 kb)
Přítomnost, počet a poloha signálů
FISH - využití techniky
fluorescenční in situ hybridizace
 klinická cytogenetika
 nádorová cytogenetika
 evoluční studie karyotypu
 studium architektury interfázního jádra
 mapování lidského genomu
 genetická toxikologie
 forenzní genetika
 analýza virových infekcí
Využití FISH: detekce mikrodelečních
syndromů – např. del 22q11 (DiGeorge syndrom)
 SRDEČNÍ VADY
 ANOMÁLIE TVÁŘE
 PORUCHY IMUNITY
Využití FISH: detekce numerických změn
Downův syndrom
Využití FISH: detekce numerických změn
Klinefelterův syndrom
 47,XXY
 vysoká postava,
porucha růstu vousů,
ženská distribuce
podkožního tuku,PMR
Využití FISH: detekce numerických změn
Turnerův syndrom
 45,X
 chybí jeden chromozom X
 1/2500 dívek
 95 % SA
 malá postava, chybí vaječníky až
sterilita
 výskyt v populaci s četností asi 1 : 500
 neovlivňují jednoznačně fenotyp nositele (5 x vyšší výskyt v
populaci mentálně retardovaných pacientů)
 významná příčina sterilit u přenašečů
 v důsledku aberantní meiotické segregace vznik gamet s
nebalancovanými přestavbami (duplikace, delece)
Využití FISH: detekce strukturních změn
Balancované translokace
Philadelphský chromozóm
translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2)
Využití FISH: onkogenetika
Chronická myeloidní leukemie (CML)
Využití FISH:
Chronická myeloidní leukemie (CML)
 Ph obvykle přítomen ve 100% mitóz v době diagnózy, přítomen i
v průběhu onemocnění
 nejlepší prognózu mají pacienti, kteří mají v době diagnozy Ph
chromozom jako jedinou změnu
 v době diagnozy u některých nemocných kromě Ph další
chromozómové změny, jejich výskyt je nepříznivý prognostický
znak
 v době blastického zvratu až 70% nemocných má přídatné
chromozomové změny, nejčastěji +8, duplikace Ph, +19, i(17q)
 FISH detekujeme přestavbu BCR/ABL, specifická sonda
umožňuje vyšetřovat i interfázní jádra
Philadelphský chromozóm
translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2)
Philadelphský chromozóm
translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2)
Philadelphský chromozóm
translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2)
Využití FISH:
Akutní myeloidní leukemie (AML)
AML-M2
t(8;21)
 mapované geny ETO, AML1
 především u mladších pacientů,
často u dětí
 sekundární změny
-Y,-X, 9q-, 7q-, +8
 dobrá prognóza
• vyvinuta v roce 1996
• identifikace každého chromozómu pomocí
jedinečné kombinace 5 fluorochromů FITC,
Rhodamin, TexasRed, Cy5, Cy5.5
•referenční spektra - pseudobarvy, přiřazeny
každému chromozómovému páru na základě
měření vlnových délek
Nevýhody - potřeba kvalitních mitóz
- úspěšná hybridizace
- finančně nákladné
Umožňuje odhalení balancovaných a
nebalancovaných ( i kryptických )
přestaveb celého genomu v jednom
kroku
Spektrální karyotypování SKY
46,XY,del(1p),+del(9p),-20
46,XY,del(1p),der(20)t(17;20)
Chlapec, 1 rok, neuroblastom
SKY
Mnohobarevné pruhování
(M-banding)
 umožňuje během jediné hybridizační
reakce stanovit změny vedoucí ke ztrátám či
ziskům sekvencí DNA v celém genomu bez
ohledu na mitotickou aktivitu buněk
Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P. a kol., 1992
potřebný materiál: izolovaná DNA
 rozlišovací schopnost – 10 Mb
 klonální zastoupení – 50 %
Komparativní genomová hybridizace (CGH)
CGH A takto to funguje…
www.abbottmoleculars.com
www.abbottmoleculars.com
CGH A takto to funguje…
CGH interpretace výsledků
CGH interpretace výsledků
Referenční DNA Testovaná DNA
CGH interpretace výsledků
Zelená s červenou…
www.abbottmoleculars.com
CGH
enh  zisky, amplifikace
dim  ztráty, delece
heterochromatin
hodnota 1
hranice 0,8
hranice 1,2
č. chromozómu
počet hodnocených
chromozómů
zelená - zisk červená - ztráta
výsledný poměr
fluorescence
CGH interpretace výsledků
Ukázka profilu CGH zpracovaného počítačovou analýzou
obrazu u pacienta s neuroblastomem
rev ish enh (1q21-qter, 2p22-p24, 12q21-qter, 17q21-qter)
rev ish dim (1p31-pter, 10q22-qter)
enh  zisky, amplifikácie
dim  straty, delécie
 Solinas-Toldo a kol., 1997
 nahrazení chromozómů separovanými klony
 BAC, PAC, c-DNA klony, oligonukleotidy ~ 35 kb
princíp DNA/DNA hybridizácie, sondy fluorescenčne značené
BAC, P1 klony,
oligonukleotidy ~ 35 kb
Array CGH : ještě větší rozlišení
- detekce numerických změn v celém genomu v jedné reakci
- přesná lokalizace změn!

Array-CGHCGH
Array CGH : rozdíl je jen v podkladu
Takto to potom vypadá…
Ukázky CGH čipů firmy a) Affymetrix a b) Agilent.
a) b)
www.abbottmoleculars.com
www.affymetrix.com
www.agilent.com
DNA mikročipy využívané na OLG FN Brno
v klinické diagnostice /2007
Oligonukleotidové platformy (Agilent Technologies)
• Human Genome 4x44K CGH array, 8x60K CGH array
• SurePrint Human 4x180K CGH , ISCA 4x180K CGH+ SNP array
• spacing ~ 25 kbp, obohacené regiony s RefSeq a ISCA geny
Klinická interpretace významu detekovaných CNVs (copy
number variations)
 Původ CNV – de novo x familiární výskyt
 Funkce genů uvnitř CNV – korelace genotyp-fenotyp
 Informace v klinických databázích – PUBMED, UCSC, OMIM, DECIPHER
 Velikost CNV – je spolehlivým kritériem?
Gijsbers et al. Eur J Hum Genet. 2009, 17(1):1394-1402.
Celkový záchyt CNVs u pacientů s MR/VVV
vyšetřených pomocí array-CGH 2007-2015
Celkově 275 vyšetření pomocí array-CGH
(144 chlapců, 131 dívek)
 164 vyšetření s normálním karyotypem
 111 vyšetření s pozitivním nálezem, tj. 40,4 %
Nalezeno:
 51 patogenních /prav. patogenních CNVs (18,5 %)
 10 CNVs nejasného významu (3,6 %)
 36 benigních CNVs (13 %)
 15 nálezů dosud nedošetřeno (5,4 %)
2016 (I-X) 113 vyšetření / 26 patogenních CNVs (23 %)
0
5
10
15
20
25
30
0-100 kb 100-200 kb 200-500 kb 0,5 - 1 Mb 1-5Mb 5-10 Mb > 10 Mb
pravděpodobně benigní VOUS patogenní
početCNVs
Klinický význam CNVs vzhledem k velikosti
Mikrodelece: 67 kb – 31, 03 Mb
Mikroduplikace: 107 kb – 26,70 Mb
95 % patogenních CNVs > 0,5 Mb
aCGH Analytics Software, Agilent Technologies
Array CGH : vyhodnocení
Interpretace array CGH
Vždy v kontextu
• s fenotypem pacienta
• s vyšetřením rodičů
• s databázemi
46,XX,add(1)
 děvče, rok narození 2002
 dg: stigmata – mongoloidní postavení očí, hyperplastická gingivální
sliznice, soudkovitý hrudník, velké rozlité bříško
 matka 46,XX, inv(9), otec 46,XY,add(1)[87]/46,XY[13]
Kazuistika .1
CGH: rev ish enh (11p15-pter) – nebalancovaná translokace
FISH: der(1)t(1;11)
Kazuistika .1
chlapec, rok narození 2004
faciální dysmorfie, stigmata
45,XY,-22,der(14) 46,XX,der(14)t(14;22)(q32.3;q11.2)
Kazuistika .2
45,XY,der(14)t(14;22)(q32.3;q11.2)
DiGeorge sy
46,XX,der(14)t(14;22)(q32.3;q11.2)
Kazuistika .2
Výsledky array-CGH
Pacient s der(14)t(14;22)(q32.3;q11.2)mat
del(22)(q11.2)del(14qter)
Klinická interpretace významu detekovaných CNVs*
(*copy-number variant)
 Typ CNV – mikrodelece, mikroduplikace
 Původ CNV – de novo x familiární výskyt
 Funkce genů uvnitř CNV – korelace genotyp-fenotyp
 Informace v klinických databázích – PUBMED, UCSC, OMIM, DECIPHER
 Velikost CNV – je spolehlivým kritériem?
Děkuji za
pozornost