Molekulární diagnostika geneticky podmíněných chorob Iveta Valášková VLKG7X1c Klinická genetika 1) genetický v genetické příčiny jsou dnes odhalovány u stále většího počtu onemocnění 2) diagnostický v v okamžiku, kdy jsou genetické faktory podílející se na vzniku onemocnění jsou zavedeny diagnostické testy do běžné klinické praxe v musí však být potvrzena jejich klinická validita a ověřen jejich užitek v dokážou určit nebo upřesnit diagnózu 3) prediktivní v slouží k určení nositele patologické varianty genu asociovaného s nemocí odhalení genetické predispozice nebo náchylnosti k nemoci v vyšetření, která předpovídají geneticky podmíněné nemoci před její manifestací 4) prognostický v stanovení rizika dědičného přenosu 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky 6) terapeuticko-indikační v pomocí genetických testů je možné dopředu určit, kteří jedinci budou mít největší prospěch z užívání konkrétního léku a u kterých pacientů bude naopak podávání léku spojeno se špatnou odpovědí a častými a závažnými nežádoucími účinky v motor personalizované medicíny a cílené biologické léčby Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy 1) genetický v genetické příčiny jsou dnes odhalovány u stále většího počtu onemocnění , Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Fernandeze-Marmiesse et al. Current Medicinal Chemistry 2018 Identifikace genů asociovaných s chorobani 2) diagnostický v v okamžiku, kdy jsou genetické faktory podílející se na vzniku onemocnění jsou zavedeny diagnostické testy do běžné klinické praxe v musí však být potvrzena jejich klinická validita a ověřen jejich užitek v dokážou určit nebo upřesnit diagnózu , Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy stanoví nebo upřesní diagnózu 3) prediktivní v slouží k určení nositele patologické varianty genu asociovaného s nemocí odhalení genetické predispozice nebo náchylnosti k nemoci v vyšetření, která předpovídají geneticky podmíněné nemoci před její manifestací , Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy umožňují prediktivní diagnózu, tzn. identifikaci genetických onemocnění před jejich manifestací 3) prediktivní Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Huntingtonova choroba též Huntingtonova chorea • Je porucha poprvé popsaná v roce 1872 americkým lékařem Georgem Huntingtonem. • Jedná se o neurodegenerativníautosomálně dominantně dědičné onemocnění • Patří mezi polyglutaminové poruchy • Má incidenci 4–10 na 100 000. • Manifestuje se nejčastěji ve středním věku. • Mezi příznaky dominuje porucha motoriky, změny osobnosti,progredujícídemence a nakonec smrt. Asociována s genem HTT (objeven v roce 1993). Gen kóduje protein huntingtin. • Přesná funkce proteinu stále není známa • Predominantně je exprimován v CNS. • Interaguje s řadou transkripčních faktorů, je tedy pravděpodobná jeho významná role při normálním vývoji CNS, • Rovněž byla demonstrována jeho důležitostpro normální průběh mitózy v CNS http://sk.tdmed.ru/diagnoz/24849-hvoroba-gentngtona-simptomi-lkuvannya.html 3) prediktivní Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Huntingtonova choroba též Huntingtonova chorea Příčina onemocnění zmnožené opakovánítripletů CAG, což je kodon pro glutamin •normálníjedinci nesou ve svém genu 9–35 repetic CAG, •postiženíjedinci jich mají více než 40. Čím je počet repetic větší, tím je nástup onemocněníčasnější. Expandovaná repetice se dědíod postiženého rodiče. Při přenosu ovšem někdy dochází během replikace před tvorbou gamety k další expanzi této repetice. Může proto nastat situace, kdy má rodič počet repetic při horní hranici normy - premutace, tj. je zdravý, potomek však získává alelu expandovanou,takže u něj nemoc propukne. Expanze se u HD objevuje častěji během mužské gametogeneze což je důvod,proč jsou těžké, časně se objevujícíformy s počtem repetic 70–120 děděny od otce. Mohou se objeviti nové mutace – asi 25 % pacientů má negativnírodinnou anamnézu. 3) prediktivní Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Huntingtonova choroba též Huntingtonova chorea K dispozici je přímé genetické testování na přítomnost expanze v genu HTT • zjištění statutu pacienta v genetickém riziku •prenatální •preimplantační diagnostice Vzhledem k neexistenci léčby je testování spojeno s psychickými a etickými problémy •hrozí psychická traumatizace pacienta, •deprese •v krajním případě i sebevražda. Proto je k testování třeba přistupovat s rozvahou a pečlivě informovat pacienta o veškerých aspektech testování. Před prediktivním (presymptomatickým) molekulárně genetickým vyšetřením na HD se postupuje podle speciálního protokolu, který kromě opakovaných konzultací s klinickým genetikem zahrnuje také vyšetření neurologické, psychiatrické a psychologické. Vyšetření dětí a nezletilých osob v riziku na základě zájmu/žádosti jejich rodičů je nepřípustné (zachování práva nevědět). HD je charakterizovaná selektivní ztrátou neuronů v bazálních gangliích, která se podílejí na koordinaci pohybů. Oranžové inkluzní tělísko v jádře postiženého neuronu v popředí, modrá jádra zdravých neuronů v pozadí 4) prognostický v stanovení rizika dědičného přenosu Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Příklad Frekvence heterozygotů Frekvence postižených jedincůFrekvence nepostižených jedinců A2 x 2Aa x a2 = 1 DÁRCOVSKÝ PROGRAM IVF Riziko vybraných recesivních chorob pro potomky pacientek využívajících dárcovské spermie/vajíčka/embrya počítané dle Hardy-Weinbergova zákona 4) prognostický v stanovení rizika dědičného přenosu Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Příklad Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocnění Metoda detekce Pravděpodobn ost stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Nevyšetřený Nevyšetřený CF Devyser 90,84 % 1/30* 1/30 * 1/30 * 1/4 a 1/3600; 0,028 % SMA MLPA 95,00 % 1/40** 1/40 * 1/40 * 1/4 a 1/6400; 0,016 % Prelinguální hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30*** 1/30 * 1/30 * 1/4 a 1/3600; 0,028 % Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocnění Metoda detekce Pravděpodobn ost stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Homozygot b (AA) Nevyšetřený CF Devyser 90,84 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9084)] * 1/30 * 1/4 a 1/39 301 SMA MLPA 95,00 % 1/40 [1/40 * (1 – 0,9500)] * 1/40 * 1/4 a 1/128 000 Prelinguální hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9900)] * 1/30 * 1/4 a 1/360 000 4) prognostický v stanovení rizika dědičného přenosu Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Příklad Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocně ní Metoda detekce Pravděpodobn ost stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Homozygot b (AA) Homozygot b (AA) CF Devyser 90,84 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9084)]2 * 1/4 a 1/429 053 SMA MLPA 95,00 % 1/40 [1/40 * (1 – 0,9500)]2 * 1/4 a 1/2 560 000 Prelinguál ní hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30 [1/30 * (1 – 0,9900)]2 * 1/4 a 1/36 000 000 Dárce genotyp Pacient genotyp Onemocn ění Metoda detekce Pravděpodobn ost stanovení Frekvence heterozygotů v populaci Výpočet frekvence postižených potomků (genotyp: aa) Riziko pro potomka Heterozygot (Aa) Nevyšetřený CF Devyser 90,84 % 1/30 1/1 * 1/30 * 1/4 a 1/120; 0,833 % SMA MLPA 95,00 % 1/40 1/1 * 1/40 * 1/4 a 1/160; 0,625 % Prelinguál ní hluchota (connexin 26) Sekvenace exonu 2 99,00 % 1/30 1/1 * 1/30 * 1/4 a 1/120; 0,833 % 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy umožňují identifikaci přenašečů genetických onemocnění (např. Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob umožňují prenatální a preimplantační diagnostiku odhalují závažné genetické onemocnění před narozením dítěte 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob v Za nejvhodnější dobu k provedení screeningu je považováno období před početím. v Většinou se jedná o období rané dospělosti. v V tomto období je k dispozici nejvíce reprodukčních možností, pokud se zjistí, že jsou oba partneři přenašeči autozomálně recesivní choroby K reprodukčním možnostem dostupným před početím patří • upuštění od (dalšího) těhotenství • přijetí rizika, že se narodí dítě ovlivněné chorobou • adopce • prenatální diagnostika s možností ukončit nebo neukončit ovlivněné těhotenství • preimplantační genetická diagnostika při technikách in vitro fertilizace (IVF) • náhradní mateřství • použití darovaných spermií/vajíčka od jedince, který není přenašeč. 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Kritéria volby nemocí (1) Screeningový program by měl odpovídat na potřeby společnosti. (2) Věcný cíl screeningu by měl být jasně definován na počátku programu. (3) Měla by být definovaná cílová populace. (4) Efektivita screeningového programu by měla být vědeckypodložena. (5) Screeningový program by měl zahrnovat vzdělávání,testování a klinickéslužby a management. (6) Měly by existovat záruky kvality a mechanismy k minimalizaci možných rizikscreeningu. (7) Program by měl zaručovat důvěrnost, respekt k autonomii jedince, a účast v něm by měla být podmíněna informovaným souhlasem. (8) Program by měl podporovat rovnost a přístup ke screeningu pro celou cílovou populaci. (9) Závěrečné zhodnocení screeningového programu by mělo být naplánováno na jeho začátku. (10) Celkový přínos screeningu by měl převažovat nad negativy. Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Prekoncepční testování autozomálně recesivních a X-vázaných recesivních chorob Etické otázky V souvislosti se screeningem se objevuje několik etických otázek, které byly formulovány zdravotnickými odborníky i laickou veřejností: • Možná diskriminace, soukromí pacientů a ochranu dat nebo podávání informací třetím stranám. • Domněnka, že by jedinci určení jako přenašeči mohli cítit tlak ze strany širší společnosti, aby učinili specifická rozhodnutí o reprodukci, patří k nejzávažnějším etickým tématům. • Screening a následná selekce nezasažených potomků v rámci preimplantační diagnosticky nebo prenatálního testování může být vnímána jako eugenický nebo diskriminační přístup. • Na osoby s nemocemi, na které bývá prováděn screening, však nesmí být nahlíženo jako na zátěž pro společnost a je proto nutné zaručit nadále podporu a zdravotní péči pro děti, které se narodily se specifickým onemocnění, ač jejich rodiče věděli o jejich stavu ještě před jejich narozením. Součástí nastavení screeningového programu měl být i systém řádné ochrany takovýchto osob, který zaručuje reprodukční svobodu, nedirektivní genetické poradenství a interpretaci testů a nutnost informovaného souhlasu. V rámci Evropské unie, Evropského hospodářského společenství a Švýcarské federace je toto zakotveno v Úmluvě na ochranu lidských práv a důstojnosti lidské bytosti v souvislosti s aplikací biologie a medicíny. V kapitole IV, článku 11 s uvádí: ‚Jakákoliv forma diskriminace osoby z důvodu jejího genetického dědictví je zakázána.‘ To je upřesněno v zákoně č 373/2011 Sb., kde se uvádí, že výsledky genetických vyšetření nesmějí být využity k diskriminaci testovaného ani geneticky příbuzných osob. nejčastější autozomálně recesivní onemocnění u evropských populací multiorgánové onemocnění •nadměrné množství solí v potu •plíce a dýchací cesty •slinivka břišní •mužská sterilita •primární příčina – mutace v genu kódujícím CFTR protein → iontový kanál hlavní funkce CFTR proteinu – chloridový kanál → přenos chloridových aniontů přes membránu •chybějící/nefunkční protein → nerovnováha iontového prostředí → porucha transportu vody → abnormálně viskózní hlenovitý sekret na epitelech → klinické projevy Cystická fibróza Cystická fibróza • především u evropských populací, v neevropských populacích je výskyt CF výrazně nižší • frekvence přenašečů – přibližně 1 z 26-30 • výskyt u 1 dítěte na 2500-4500 novorozenců • v ČR udáván 1 ze 4023 (dle výsledků NS nižší – 1 z 6946)→? vliv prenatální/preimplantační diagnostiky a možných důsledků z pozitivního nálezu? Riziko u dítěte Oba rodiče nemocného dítěte jsou zdravými nosiči patologie způsobujícího CF. Riziko narození dítěte s CF je u každého těhotenství takového páru 25%. Cystická fibróza CFTR gen 2000 patologických variant Cystic Fibrosis Mutation Database http://www.genet.sickkids.on.ca/StatisticsPage.html Cystická fibróza Třída I – Narušená syntéza proteinu Třída II – Abnormální zpracování a intracelulární transport proteinu Třída III – Porucha regulace proteinu Třída IV – Narušení vodivosti chloridového kanálu Třída V – Redukovaná syntéza a zhoršený intracelulární transport proteinu Třída VI – Snížená stabilita proteinu Amaral, M.D., 2015. Novel personalized therapies for cystic fibrosis: treating the basic defect in all patients. J. Intern. Med. 277, 155–166. upraveno Cystická fibróza Molekulární diagnostika Metoda analýza teploty tání pomocí real-time PCR Cystická fibróza Molekulární diagnostika Metoda fluorescenční multiplex ARMS (amplification refractory mutation system) Elucigene CF-EU Cystická fibróza Pokud chloridový kanál na povrchu buněk zcela chybí, což odpovídá stavu u vůbec nejčastějšímutace způsobujícíCF, tj. F508del,samotný ivacaftor zůstává neúčinný. Pro takový typ molekulárního poškozeníje zapotřebívyužít jiné skupiny léků, které dovedou ovlivnitvlastnítvorbu bílkoviny ve vnitru buňky a jimž se souhrnně říká korektory proteinu CFTR. Mezi nejlépe prozkoumané korektory CFTR patří léčebný přípravek lumacaftor (někdy označovaný jako látka VX-809; Vertex Pharmaceuticals). lumacaftor usnadňuje transportproteinu CFTR na buněčnou membránu a interferuje s potranslačním procesem jeho seskládání Ivacaftor Pro pacienty s cystickou fibrózou (CF), kteří mají mutaci třídy III G551D, je od roku 2012 k dispozici kauzálníléčba. Mechanismus účinku léku spočívá v opravě funkce chloridového kanálu CFTR, poškozeného touto mutací. Aktivuje nefunkční CFTR na povrchu buněk a otevírá jej pro chloridové ionty. Potvrzená účinnostnového léčebného postupu, reprezentovaného právě lékem ivacaftor,přinášíreálnou naději, že bude časem možné řešit základnípříčinu onemocněníi u pacientů s dalšími typy mutací v genu CFTR. Molekulární diagnostika ovlivňuje léčbu Karen 5. 11. 1982 – 25. 3. 2002 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Srdeční kanalopatie Dědičná arytmogenní onemocnění ⇒ defektní iontové kanály, jejich podjednotky nebo asociované proteiny => chyba v akčním srdečním potenciálu => arrhythmie Syndromy - Long QT Syndromes - Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia - Brugada Syndrome Manifestace krátká pauza v srdečním tepu, chvění srdce, závratě a blackout =>synkopa, náhlá smrt Long QT syndromy Prevalence 1:2000 13 genů – 3 major genů => 3 major syndromy LQT 1 (physical exercise and emotional stress; KCNQ1) LQT 2 (sudden noices; KCNH2) LQT 3 (sleep and rest; SCNA5) 40 a více asociovaných genů Long QT syndromy Diagnostika Kardiologická vyšetření – ECG, testing after physical exercise, Holter Genetické testování – Sanger sequencing, Next generation sequencing SeqNext (JSI Medical Systems) 5) preventivní kroky s minimalizovanými vedlejšími účinky Molekulární diagnostika má dnes tyto hlavní praktické přínosy Prenatální vyšetření Prenatální vyšetření Zdroje fetální DNA - invazivní výkony • amniové fibroblasty – při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů, • choriové klky 0,5-1% riziko spontánních potratů • fetální krevní buňky – při kordocentéze vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vysoké riziko aloimunizace matky Prenatální vyšetření Krev je složena z buněk a plazmy. V plazmě každému z nás kolují krví úlomky jeho vlastní dědičné informace, jeho DNA. Pocházejí z rozpadlých jader uhynulých a zničených buněk nejrůznějších orgánů. 1 Plazma 2 Destičky 3 Bílé krvinky 4 Červené krvin Volná fetální DNA cfDNA Zdroje fetální DNA - neinvazivní výkony Prenatální vyšetření Volná fetální DNA cfDNA Zdroje fetální DNA - neinvazivní výkony Ženám se poměrně záhy po otěhotnění objeví v krvi také zlomky dědičné informace vyvíjejícího se embrya. V plazmě těhotné ženy se nachází směs úlomků DNA matky a plodu. „Dětské“ fragmenty tvoří asi desetinu všech zlomků DNA, jež lze v krvi matky najít. https://doi.org/10.1111/tog.12388 Prenatální vyšetření Analýza volné fetální DNA cfDNA Zdroje fetální DNA - neinvazivní výkony NIPS - A • detekce chromosomálních aneuploidií NIPS - M • genotypizace fetální RhD • determinae fetálníh pohlaví pro X,Y-vázané choroby • diagostika monogeních chorob https://doi.org/10.1073/pnas.1617112113 RNA DNA PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ analýza mikrosatelitů SCORING • Restrikční analýza PCR produktu • Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy • detekce variant pomocísond • ARMS • MLPA • TripletPrimed PCR SCANNING • analýza teploty tání (SYBR Green) • sekvenování EXPRESE SESTŘIH „SEKV. EXONŮ“ Molekulární diagnostika genetických chorob Lékařská fakulta Masarykovy univerzity 2021