Klasickým cytogenetickým vyšetřením v nádorové cytogenetice rozumíme kultivaci nádorových buněk za účelem získání metafázických chromosomů. U hematologických malignit se nejčastěji provádí krátkodobá, 1-3 denní kultivace buněk kostní dřeně, periferní krve, uzliny, sleziny nebo jater. Kultivací in vitro se rozumí kultivace buněk v kultivačním médiu s obsahem řady látek umožňující in vitro buněčný růst a dělení. Buňky kostní dřeně mohou být kultivovány bez použitím stimulačních látek, zatím co lymfocyty periferní krve naopak s použitím stimulačních agens proto, že tyto buňky mají in vitro nízký mitotický a proliferační potenciál. Příkladem jsou lymfocyty periferní krve chronické lymfocytární leukémie (CLL) nebo plasmocyty mnohočetného myelomu (MM). V roce 2000 Decker et al., využili u CLL nemocných kultivaci buněk v médiu obohaceném s CpG oligodinukleotidy DSP30 a interleukinem 2 (IL-2). Celkem 72 hodin trvající kultivace in vitro vedla k zisku metafázických buněk až v 95 % případů a zahájila nové období významu cytogenetického vyšetření u CLL. Další stimulační látkou pro periferní lymfocyty může být phytohemagglutinin (PHA), který se váže především na membránu T buněk a stimuluje buněčné dělení a metabolické aktivity. Chromosomová analýza představuje 5 základních kroků: 1) založení buněčné kultury, 2) ukončení kultury a sklízení metafázových chromosomů, 3) příprava chromosomových preparátů, 4) pruhování chromosomů a 5) sestavení karyotypu. Objev, že kolchicin (nebo kolcemid) působí jako látka, která zastavuje dělící se buňky v metafázi a společně s hypotonickým roztokem ovlivňuje počet i kvalitu metafází, se staly základem úspěšného cytogenetického vyšetření. Zpracování vzorku a následné barvení preparátů pro získání cytogenetického výsledku se provádí dle standardních protokolů a je shodné pro všechny typy kultur.Celý proces je složen z hypotonie roztokem 0,75M KCl a následnou fixací směsí metanolu a kyseliny octově v poměru 3:1 opakovaně. Získaná fixovaná směr buněk mléčného zabarvení a požadované hustoty je pak použita na přípravu preparátů kapáním na sklo. Nakapané preparáty jsou barveny různými pruhovacími metodami G-, Q- a R- pruhování, avšak nejčastěji používané je G-pruhování. Jde o tzv. euchromatinové pruhování, při kterém detekujeme pozitivně a negativně zbarvené pruhy lokalizované v euchromatinových oblastech. Vytvoření pruhů se docílí denaturací DNA trypsinem a následným barvením Giemsovým barvivem. Počet pruhů záleží na stupni kondenzace chromosomů a typu buněk, většinou se pohybuje mezi 300-500 pruhy počítáno na haploidní počet chromosomů. Pro vlastní karyotypování se používá digitalizace, automatické vyhledávání metafází, kdy metafáze na preparátu jsou pomocí softwarového programu a digitální kamery vyhledány, nasnímány a digitální obraz v počítači je pak cílem karyotypování cytogenetika. Sestavení karyotypu se řídí celosvětově platnou nomenklaturou ISCN - International Systems for Cytogenomic Nomenclature. Cytogenetické vyšetření by měli provádět dva nezávislí cytogenetici – analytici, se zkušeností s onkocytogenetikou. Chromosomová analýza poskytuje informaci o všech chromosomových změnách v jedné nádorové buňce na úrovni svého rozlišení. Cytogenetická analýza je u řady hematologických malignit povinná, jak je uvedeno v evropském doporučení (Tab.1). Tato evropská doporučení navrhují hodnocení 20 metafází a z nich nejméně u 10 pak sestavení karyotypu. Při hodnocení chromosomových změn je také definován pojem klon, jako nález dvou metafází se stejnou strukturní nebo nadpočetní chromosomovou změnou nebo nález tří a více metafází se ztrátou stejného chromosomu. Za klon je považován i nález pouze jedné metafáze s normálním karyotypem. Klonální změny jsou cílem výsledku cytogenetického vyšetření. Cytogenetické vyšetření se provádí nejen v době diagnosy hematologické malignity, ale také po léčbě, v době remise onemocnění nebo při dalším vývoji onemocnění. I v těchto případech je opět potřeba dodržovat evropská doporučení a hodnotit příslušný počet metafází ve vztahu k nálezu v době diagnosy. Obr.1: Karyotyp muže 46,XY (G-pruhování, Sekce Nádorové cytogenetiky CMBGT IHOK Brno) Metody molekulární cytogenetiky Molekulárně cytogenetické metody jsou založeny na principu hybridizace značených sond s DNA zkoumaného vzorku. Fluorescenční in situ hybridizace - FISH Principem metody FISH je cílená hybridizace jednořetězcové sondy značené fluorochrómem ke komplementárním úsekům DNA pacienta. Sondy mohou být lokus specifické (k detekci duplikací, delecí či translokací), centromerické (ke zjištění počtu chromosomů) nebo celochromosomové (pro určení chromosomových přestaveb). Často se používají i různé kombinace těchto sond. Jádra i chromosomy jsou pro vizualizaci ve fluorescenčním mikroskopu podbarvena fluorochrómem DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride). Celý hybridizační proces začíná tepelnou denaturací preparátu a fluorescenční sondy k vytvoření jednořetězcových úseků DNA. Následná normalizace teplot vede k vytvoření dvouřetězcových úseků DNA na základě komplementarity bazí, kdy dojde k hybridizaci sondy k cílené DNA. Po odmytí nenavázané sondy se pomocí fluorescenčního mikroskopu s příslušnou sadou filtrů hodnotí přítomnost a počet signálů v interfázních jádrech nebo na chromosomech.Právě hodnocení buněk v interfázi je obrovskou výhodou této metody oproti klasické cytogenetice, protože odpadá nutnost nalezení metafází. Standardně se hodnotí u každého pacienta 200 interfázních jader a citlivost metody je závislá na velikosti sondy pokrývající chromosomový úsek nebo gen. Interfázní FISH může být použita jako samostatná diagnostická metoda pro některé diagnózy je povinná nebo doporučená pro jiné hematologické malignity, jak ukazují tabulky (Tab.1, 2) Mnohobarevná fluorescenční in situ hybridizace (mFISH) a mnohobarevné pruhování (mBAND) Dalším pokrokem v metodě FISH bylo zavedení metody mnohobarevné fluorescenční in situ hybridizace (mFISH). Princip metody je shodný s klasickou metodou FISH, přičemž hybridizace je prováděna se směsí celochromosomových sond, které odpovídají každému chromosomu v karyotypu. Sondy pro každý chromosom jsou připraveny kombinací 5 různých fluorochromů a základem je výpočet kombinací barev 2^N-1, tedy kombinace 5ti barev pokrývá 22 autosomů a 2 gonosomy. Pro snadnější hodnocení a rozlišení kombinací barev jednotlivých chromosomů je karyotyp pomocí speciálním softwaru hodnocen přiřazením jednotlivým kombinacím pseudobarvy. mFISH analyzuje celý lidský genom v jednom vyšetření. Metodou mFISH dokážeme idetifikovat balancované i nebalancované translokace a především přesně určit komplexní přestavby chromosomů a komplexní karyotyp i přítomné marker chromosomy. Další variantou metody FISH je metoda mBAND, využívající sond opět značených kombinací fluorochromů. Jedná se o určitou formu modifikace metody mFISH, kdy se na jednotlivé části každého chromosomu hybridizují různě označené úseky daného chromosomu tvořící sondu pro daný chromosom. Po nasnímání a zobrazení v softwaru lze pak na základě nasnímaných intenzit fluorochromů podél chromosomu a mapy značení jednotlivých částí chromosomu, určit strukturní změny daného chromosomu. Mnohobarevné pruhování lze využít pro rozlišení intrachromosomových přestaveb, zejména pro lokalizaci místa zlomu. ArrayCGH-array komparativní genomová hybridizace K překonání některých limitací klasické cytogenetiky a metod FISH je možné použít čipové technologie, které určují změny v počtu kopií (CNA) a mohou určit získané ztráty heterozygozity (aCN-LOH). Metoda arrayCGH je molekulárně cytogenetická metoda, založená na kompetitivní hybridizaci normální a nádorové DNA k DNA cílům, kterými jsou fragmenty genomické DNA nebo oligonukleotidy umístěné na hybridizačním skle, které označujeme microarray nebo čip. Jednou za základních podmínek úspěšné hybridizace je získání velmi kvalitní normální a nádorové DNA. Následně jsou fragmenty genomické a normální DNA značeny rozdílnými fluorochromy, denaturovány a následně hybridizovány k fragmentům DNA na hybridizačním skle-čipu. Výsledek hybridizace jednořetězcových, rozdílně fluorescenčně označených fragmentů genomické a nádorové DNA je hodnocen na základě měření intenzity přihybridizované DNA k fragmentů na čipu. Poměr obou naměřených intenzit je porovnán a podle stanovených hranic naměřených intenzit pak určujeme oblasti se ztrátou genetického materiálu nebo naopak se ziskem genetického materiálu. SNPs array jsou další variantou celogenomových čipových metod, využívající jednonukleotidové polymorfismy v lidském genomu a čip pak obsahuje oligonukleotidy příslušných alel. Výsledek je shodný s metodou arrayCGH, dovoluje určení jak CNA, tak aCN-LOH a je citlivější pro určení hyperploidií. Cytogenetika vybraných hematologických malignit. Hematologické maligní onemocnění jsou definována spektrem genetických změn, některé z nich jsou specifické a nenáhodné a mají diagnostický a nebo prognostický význam. Výběr metod pro určení specifických, nenáhodných ale i náhodných aberací u vybraného hematologického onemocnění souvisí s potvrzeným klinickým významem a poznatky o patogenezi onemocnění. Cytogenetická vyšetření se provádějí jak v době diagnosy, tak v průběhu onemocnění. Důležité je si uvědomit, že zatím neexistuje metoda, která by odpověděla na všechny genetické otázky a odhalila všechny genetické změny a proto je vhodné kombinovat různé metody k získání optimálních výsledků. Příkladem je vyšetřování nemocných s chronickou myeloidní leukémií (CML) a určení první specifické chromosomové změny u nádorů člověka, Filadelfského chromosomu (Ph). Ten je výsledkem reciproké translokace mezi chromosomy 9 a 22, t(9;22)(q34;q11). Tato změna je přítomná u 90-95% nemocných v době diagnosy CML. Ostatní nemocní (5-10%) mají variantní translokaci nebo kryptickou přestavbu, která vede k fúzi genů BCR/ABL1. Potvrzením diagnosy CML je tedy přítomnost fúzního genu určeného metodou FISH nebo RT-PCR. Cytogenetické vyšetření je přesto podle evropského doporučení povinné, protože již v době diagnosy 10-15% nemocných má přídatné chromosomové změny v Ph pozitivním klonu a jejich určení je významné, protože může odhalit nemocné v pokročilé fázi onemocnění jako je akcelerovaná fáze CML, tedy může být známkou nepříznivé prognosy. V současném doporučení ELN (Evropská leukemická siť) je cytogenetické vyšetření v době diagnosy povinné a doporučený počet analyzovaných metafází je 20 právě z důvodů možného odhalení přídatných chromosomových změn. Metoda FISH je povinná v případech neúspěšného cytogenetického vyšetření nebo nedostatečného počtu metafází nebo v případě nálezu normálního karyotypu s podezřením na kryptickou přestavbu. Cytogenetika je rovněž povinná při monitorování odpovědi na léčbu v období po 3, 6 a 12 měsících léčby a to až do dosažení kompletní cytogenetické odpovědi, tedy nenalezení žádné metafáze s Ph chromosomem mezi 20 hodnocenými metafázemi. Další monitorování odpovědi je stanovováno molekulárně geneticky hladinou BCR/ABL1 transkriptu. U akutní myeloidní leukémie (AML) jsou diagnostické podskupiny AML definovány na základě nálezu specifických chromosomových změn nebo genových mutací. Cytogenetické vyšetření je v diagnose povinné a má prognostický význam. Stejně tak je povinné molekulárně genetické vyšetření rekurentních mutací. Metodou FISH je doporučeno vyšetření přestavby genu MECOM a KMT2A. Ostatní fúzní geny je možné stanovit metodou FISH, ale jsou stanovovány z důvodů využití pro sledování minimální residuální nemoci (MRN) metodami molekulární genetiky. Akutní lymfoblastická leukémie (ALL) je také charakterizována rekurentními aberacemi prognostického významu. K nejvýznamnějším patří nález Ph chromosomu, translokace t(9;22)(q34;q11) s fúzí genů BCR/ABL1, přestavby genu KMT2A a u dětských ALL nález hyperdiploidie a translokace t(12;21)(p13;q22). Doporučení pro analýzy fúzních genů u ALL jsou také součástí evropských doporučení. Nenáhodné chromosomové změny především prognostického významu můžeme pozorovat i u různých typů myeloproliferativních onemocnění a myelodysplastického syndromu a doporučení jejich vyšetření je uvedeno v tabulce č.2. Chronická lymfatická leukémie (CLL) je nejčastějším onemocněním vyššího věku v západním světě. Rekurentní chromosomové změny mají potvrzený prognostický význam a jsou určovány metodou FISH, jak doporučuje IWCLL guidelines (Mezinárodní workshop CLL). Prognosticky nepříznivou podskupinou jsou nemocní s nálezem delece chromosomu 11q, 17p a komplexního karyotypu. Pro určení komplexního karyotypu využíváme klasické cytogenetické vyšetření doplněné metodou mFISH. Stejná doporučení platí i pro užití metody FISH pro prognostickou stratifikaci nemocných s mnohočetným myelomem. S nepříznivým prognostickým významem je spojena translokace t(4;14),t(14;16) a delece TP53. Poslední velkou skupinou hematologických malignit, kde určení chromosomových změn má prognostický význam jsou nehodgkinské lymfomy (NHL). K nejčastějším rekurentním aberacím patří translokace t(11;14) u lymfomu z plášťových buněk (MCL), t(14;18) u folikulárního lymfomu (FL), t(8;14) u Burkitt lymfomu (BL) nebo translokace zahrnující gen ALK u difúzních velkobuněčných lymfomů (DLBCL). Všechna tato doporučení shrnuje tabulka č. 2. Cytogenetika a její metody zůstávají i v éře celogenomoveho a exomového sekvenování stále nedílnou součástí diagnostických a prognostických metod. Tabulka č.1: Přehled povinně prováděných metod u hematologických malignit (Upraveno podle Evropských doporučení; Rack et al, 2019) Typ onemocnění Metoda Literatura CML Karyotyp Baccarani et al, 2013,2015 FISH: BCR/ABL1 Hochhaus et al.2020 MDS Karyotyp Malcovati et al, 2013 FISH: -5/5q-,-7/7q-,MECOM,+8,20q-,delTP53 AML Karyotyp Dohner et al, 2017 FISH: PML/RARA,CBFB/MYH11,RUNX1/RUNX1T,KMT2A,MECOM ALL Karyotyp Hoelzer et al, 2016 FISH: fúzní geny (specifikováno v Tab.2) Harrison et al, 2010 CML-chronická myeloidní leukémie; MDS-myelodysplastický syndrom; AML-akutní myeloidní leukémie; ALL-akutní lymfoblastická leukémie Tabulka č.2: Přehled cytogenetických vyšetření u hematologických malignit (upraveno podle Rack et al, 2019) Typ onemocnění Metoda Literatura Cytogenetika FISH arrayCGH/SNP array CML Karyotyp BCR/ABL1 NE Hochhaus et al, 2020 Myeloidní/lymfoidní neoplázie s eosinofílií Karyotyp PDGFRA,PDGFRB,FGFR1,PCM1/JAK2 NE* Butt et al, 2017 MDS Karyotyp del(5q)/-5,del(7q)/-7, MECOM, +8, del(20q),del(17p)/TP53 ANO Schanz et al, 2012 ; Xu et al, 2013 AML Karyotyp KMT2A, MECOM, +8, fúzní geny: PML-RARA, CBFB-MYH11, RUNX1-RUNX1T NE* Dohner et al, 2017 Papaemmanuil, E. et al. 2016 B-ALL dospělí Karyotyp KMT2A, BCR/ABL1, TCF3, CRLF2 ANO Moorman, 2010 Schwab&Harrison 2018 B-ALL děti Karyotyp KMT2A, ETV6/RUNX1,BCR/ABL1,TCF3 CEP sondy-hyperdiploidie ANO Moorman, 2010 Tasian et al, 2017, Liu et al, 2016 T-ALL děti/dospělí Karyotyp TLX3,TLX1,KMT2A,TAL1, LMO1, ABL1 NE Mrózek et al, 2009 CLL Karyotyp delece 13q, ATM, TP53, trisomie 12 ANO Hallek et al, 2018 Schweighofer et al, 2013 MM t(4;14),t(14;16),delece TP53, zisk 1q/del(1p), t(11;14),t(14;20), CEP sondy-ploidie ANO Sonneveld et al, 2016 Avet-Loiseau H et al, 2009 Jiné B buněčné malignity (B-NHL, BL) Karyotyp IGH, CCND1, MYC, BCL2, ALK, BCL6, NMYC ANO Swerdlow et al, 2016; Armitage et al, 2017; Tirado et al, 2012 CML-chronická myeloidní leukémie; MDS- myelodysplastický syndrom; AML-akutní myeloidní leukémie; B-ALL-B-buněčná akutní lymfoblastická leukémie; T-ALL-T-buněčná akutní lymfoblastická leukémie; CLL-chronická lymfocytární leukémi; MM-mnohočetný myelom; B-NHL-nehodkinský lymfo; BL-Burkittův lymfom; NE*-vyšetření může být provedeno v případě nálezu komplexního karyotypu CEP-centromerické sondy Literatura: Avet-Loiseau H, et al. Prognostic significance of copy-number alterations in multiple myeloma. J Clin Oncol 27(27): 4585-4590, 2009 Armitage, J. O, et al. Non-Hodgkin lymphoma. Lancet 390, 298-310,doi:10.1016/S0140-6736(16)32407-2 (2017). Baccarani M, et al. A review of the European LeukemiaNet recommendations for the management of CML. Ann Hematol. 2015; Butt NM, et al. Guideline for the investigation and management of eosinophilia. Br J Haematol. 2017;176:553–72. Decker T, Schneller F, Kronschnabl M, et al. Immunostimulatory CpG-oligonucleotides induce functional high affinity IL-2 receptors on B-CLL cells: costimulation with IL-2 results in a highly immunogenic phenotype. Exp Hematol 2000;28:558-568 European Leukaemia Network http://www.leukemia-net.org/ content/home/index_eng.html Greenberg PL, Tuechler H, Schanz J, Sanz G, Garcia-Manero G, Solé F, et al. Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic syndromes. Blood. 2012;120:2454–65. Gong JZ, Cook JR, Greiner TC, Hedvat C, Hill CE, Lim MS, et al. Laboratory practice guidelines for detecting and reporting JAK2 and MPL mutations in myeloproliferative neoplasms: a report of the association for molecular pathology. J Mol Diagn 2013;15:733–44 Grimwade D, Hills RK, Moorman AV, Walker H, Chatters S, Goldstone AH, et al. Refinement of cytogenetic classification in AML: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities amongst 5635 younger adults treated in the UK MRC trials. Blood. 2010;116:354–65. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, Caligaris-Cappio F, Dighiero G, Dohner H, et al. iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL. Blood. 2018;131:2745–60. Heinrichs S, Li C, Look AT. SNP array analysis in hematologic malignancies: avoiding false discoveries. Blood 2010;27: 94(Suppl 2):S141–7. Hochhaus A, Baccarani M, Silver RT, et al. European LeukemiaNet 2020 recommendations for treating chronic myeloid leukemia. Leukemia 2020; https://doi.org/10.1038/s41375-020-0776-2. Chudoba I, Hickmann G, Friedrich T et al. mBAND: a high resolution multicolor banding technique for the detection of complex intrachromosomal aberrations. Cytogenet Genome Res.2004;104:390-3. Ijssel P, Ylstra B. Oligonucleotide array comparative genomic hybridization. Methods Mol Biol 2007;396:207-21. Liu BY,Wang WN, Zhang JY, et al. Genomic Profiling of Adult and Pediatric B-cell AcuteLymphoblastic Leukemia EBioMedicine 8 (2016) 173–183. Lucito, R., et al. Representational oligonucleotide microarray analysis: A high-resolution method to detect genome copy number variation. Genome Research 13, 2291–2305 (2003) Malcovati L, Hellström-Lindberg E, Bowen D, Adès L, Cermak J, del Cañizo C, et al. Diagnosis and treatment of primary myelodysplastic syndromes in adults: recommendations from the European LeukemiaNet. Blood. 2013;122:2943–64. McGowan-Jordan J, Simons A, Schmid M (eds) (2016) An international system for human cytogenomic nomenclature. S. Karger, Basel. Moorman AV. The clinical relevance of chromosomal and genomic abnormalities in B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia. Blood Rev. 2012;26:123–35. Moorman AV. New and emerging prognostic and predictive genetic biomarkers in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Haematol 2016; 101(4):407-16. Mrozek K et al. Cytogenetics and Molecular Genetics of Acute Lymphoblastic Leukemia. Hematol Oncol Clin North Am. 2009; 23(5): 991-1008. Papaemmanuil, E. et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N. Engl. J. Med. 374, 2209–2221 (2016). Parker A, Bain B, Devereux S, Gatter K, Jack A, Matutes E, et al. Best practice in lymphoma diagnosis and reporting. 2008. www.rcpath.org Rack AK, van den Berg E, Haferlach C, et al. European recommendations and quality assurance for cytogenomic analysis of haematological neoplasms. Leukemia 2019; 33:1851–1867. Schanz J, Tüchler H, Solé F, Mallo M, Luño E, Cervera J, et al. New comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia after MDS derived from an international database merge. J Clin Oncol. 2012;30:820–9. Schwab C, Harrison C. Advances in B-cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia Genomics. Hemasphere 2018; 2:p e53. Schweighofer CD, Coombes KR, Majewski T, Barron LL, LernerS, Sargent RL, et al. Genomic variation by whole-genome SNP mapping arrays predicts time-to-event outcome in patients withchronic lymphocytic leukemia: a comparison of CLL and Hap-Map genotypes. J Mol Diagn. 2013;15:196–209. Speicher MR, Gwyn Ballard S, Ward DC. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nature Genetics 1996;12:368–375. Sonneveld P, Avet-Loiseau H, Lonial S, Usami S, Siegel D, Anderson KC, et al. Treatment of multiple myeloma with high risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 2016;127:2955–62. Swerdlow, S. H. et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood 2016; 127:2375-2390 Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. 4th ed. Lyon: IARC; 2017. Tasian SK, Loh ML, Hunger SP. Philadelphia chromosome–like acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2017;130:2064–72. Tirado CA, Cen W, Garcia R, et al. Genomic profiling using array comparative genomic hybridization define distinct subtypes of diffuse large b-cell lymphoma: a review of the literature. J Hematol Oncol 2012;5:54-66. Xu, X., Johnson, E.B., Leverton, L., Arthur, A., Watson, Q., Chang, F.L., Raca, G. & Laffin, J.J. (2013) The advantage of using SNP array in clinical testing for hematological malignancies–a comparative study of three genetic testing meth- ods. Cancer Genetics, 206, 317–326.