Jolana Lipková Genetika v zubním lékařství – cvičení 1 Základní pojmy •Genetika •obor zabývající dědičností a variabilitou kvantitativních a kvalitativních znaků všech živých organismů • •Genomika •obor genetiky, který se snaží stanovit úplnou genetickou informaci organismu a interpretovat ji v termínech životních pochodů • •Gen •základní jednotka dědičnosti (genetické informace) •konkrétní úsek molekuly DNA, který nese informaci pro tvorbu bílkoviny nebo nukleové kyseliny (RNA) •skládá se z exonů a intronů – strukturní – funkční • • • • základní jednotka dedičnosti- tvoří jen 2% DNA (20-25 000), lokalizace genů je u všech lidí stejná, sekvence ale ne! •Chromozom •funkční celek dědičného záznamu genetické informace v buňce •jádro buňky , 22 párů autozomů + 1 pár gonozomů – •Lokus •umístění genu na určitém místě na konkrétním chromozomu • •Alela •konkrétní forma genu • •Heterozygot •dvě různé varianty (alely) daného genu nebo jeho části • •Homozygot •dvě stejné varianty (alely) daného genu nebo jeho části • •Genotyp •kompletní či genetická informace konkrétního jedince nebo označení alel přítomných v daném genu •kombinace alel v určitém lokusu na paternálním a maternálním chromozomu diploidního genomu • •Haplotyp •skupina genů (lokusů), které jsou ve vazbě a jsou tudíž preferenčně předávány rodiči potomkům pohromadě •lineární kombinace genů/alel na jenom z homologních chromozomů (výjimečně dochází k rekombinaci) • • • • Základní pojmy haployp-je haploidní genotyp-typicky HLA systém – mají 20 alel •Polymorfismus • existence několika (přinejmenším dvou) alel pro daný gen, z nichž nejméně častá má populační frekvenci alespoň ≥ 1% • •Mutace • procesy, při kterých dochází ke změnám v genotypu v důsledku působení různých faktorů prostředí • méně častá alela má populační frekvencí < 1% Základní pojmy •DNA was discovered in 1869 by Swiss researcher Friedrich Miescher, who was originally trying to study the composition of lymphoid cells (white blood cells). Instead, he isolated a new molecule he called nuclein (DNA with associated proteins) from a cell nucleus • • • • • • • • • •1950 - Rosalind Franklin and Maurice Wilkins – X-ray photoghraph of DNA •1953 - James Watson and Francis Crick - deduced how nucleotides are organized within DNA, create a model of DNA- double helix •1962 The Nobel Prize in Physiology or Medicine (Watson and Crick) fm-6 Obsah obrázku text, černá, bílá, velká činka Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku osoba Popis byl vytvořen automaticky 1950 tajy chargaff-monžtví a je stejne jako T •molekula DNA = kyselina deoxyribonukleová –Dvoušroubovice – 2 řetězce – v opačném směru –Polynukleotidový řetězec •Dusíkatá báze ( T, A, C, G) spojená • vodíkovými můstky •Zbytek kyseliny fosforečné •Cukerná složka – deoxyribóza • •molekula RNA = kyselina ribonukleová –jednovláknová –Polynukleotidový řetězec •Dusíkatá báze ( U, A, C, G) spojená vodíkovými můstky •Zbytek kyseliny fosforečné •Cukerná složka –ribóza –Typy – mRNA, tRNA, rRNA • DNA vs. RNA Nukleotidy = základní stavební kameny NA A) Nukleová báze §Puriny – adenin (A); guanin (G) §Pyrimidiny – cytosin (C); thymin (T - DNA);uracil (U – RNA) B) Nukelosid §Nukleová báze + pentóza (ribóza; deoxyribóza) §N-glykosidická vazba C) Nukleotid §Fosforylovaný nukleosid § Další funkce Skladování a přenos energie §Hydrolýza fosfoanhydridové vazby §Většina ATP je intracelulární Signalní molekuly §Intracelulární signalizace §Např. cAMP a cGMP (second messenger) • Koenzymy §Např. Koenzym A § § NUKLEOSID ´ NUKLEOTID ´ BÁZE ´ DNA Adenosin •stavba NK •energeticky bohaté sloučeniny ATP, ADP, AMP •kofaktory (koenzym A, NADPH, NADH) - •radikál v kofaktoru transferázy S-adenosylmethioninu (SAM) •cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) - buněčná signalizace •vit. B12 •léčivo –antiarytmikum • •funkce neuromodulátoru a homeostatického regulátoru (reg. stability vnitř. prostředí). •blokace uvolňování všech aktivujících neurotransmiterů -rozšíření krevních cév a pokles krevního tlaku, adenosin snižuje srdeční frekvenci (léčba taychykardií) •inhibice agregace krevních destiček •zvýšené hladiny adenosinu -snižení zánětu- aktivace /inhibice -neutrofilní granulocyty a fagocytózu •bdění a spánek –inhibice centra probuzení a bdění neurotransmiterem GABA - adenosin - produkt degradace ATP – větší spotřeba ATP buňkou –vyšší konc. – větší tlak na spánek - během spánku –rozklad adenosinu, tvorba ATP -tlak na spánek klesá. •zvýšená koncentrace v mozku -metabolický stres (anoxie , ischémie , prodloužené období bdělosti) – ochrana mozku potlačením jeho aktivity a zvýšením průtoku krve. •kofein se váže na stejné receptory 1.hromadění adenosinu (bez pocitu unavy) 2. aktivace kortizolu a adrenalinu adenosin jako součást energet boh slouč, kofaktorů, V jiných sloučeninách (NAD a NADH) se adenosin podílí na biologických oxidačně-redukčních reakcích, které přenášejí elektrony mezi sloučeninami, pohání endogenní biosyntetické reakce v buňce, kofein váže na adenosinové receptory a spouští reakci boj nebo útěk (z anglického "fight or flight"). Hypofýza, která má neustále pod kontrolou naší mozkovou aktivitu, vylučuje hormony kortizol a adrenalin. Stimuluje se sympatický nervový systém a jde o obranný mechanismus těla, který je s námi spojen evolučně. Takto je tělo připraveno na boj s predátorem. Káva tuto reakci vyvolá aniž by byl důvod. Jenže mozek nepozná rozdíl mezi tím, jestli jsme v akutním ohrožení a nebo si dáváme třetí šálek kávy. A podle toho také reaguje. Rozšíří se zorničky, zrychlí se tep, potí se nám dlaně, zvýší se hladina cukru v krvi Kofein může procházet epiteliální tkání, což znamená, že již po prvním doušku jej tělo vstřebává ústy, hrdlem, jícnem a žaludkem. Účinky kofeinu se měří jeho poločasem rozpadu, který se obvykle pohybuje v rozmezí 4-6 hodin.. Nukleotidy = základní stavební kameny NA A) Nukleová báze §Puriny – adenin (A); guanin (G) §Pyrimidiny – cytosin (C); thymin (T - DNA);uracil (U – RNA) B) Nukelosid §Nukleová báze + pentóza (ribóza; deoxyribóza) §N-glykosidická vazba C) Nukleotid §Fosforylovaný nukleosid § Další funkce Skladování a přenos energie §Hydrolýza fosfoanhydridové vazby §Většina ATP je intracelulární Signalní molekuly §Intracelulární signalizace §Např. cAMP a cGMP (second messenger) • Koenzymy §Např. Koenzym A § § NUKLEOSID ´ NUKLEOTID ´ BÁZE ´ DNA Adenosin •stavba NK •energeticky bohaté sloučeniny ATP, ADP, AMP •kofaktory (koenzym A, NADPH, NADH) - •radikál v kofaktoru transferázy S-adenosylmethioninu (SAM) •cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) - buněčná signalizace •vit. B12 •léčivo –antiarytmikum • •funkce neuromodulátoru a homeostatického regulátoru (reg. stability vnitř. prostředí). •blokace uvolňování všech aktivujících neurotransmiterů -rozšíření krevních cév a pokles krevního tlaku, adenosin snižuje srdeční frekvenci (léčba taychykardií) •inhibice agregace krevních destiček •zvýšené hladiny adenosinu -snižení zánětu- aktivace /inhibice -neutrofilní granulocyty a fagocytózu •bdění a spánek –inhibice centra probuzení a bdění neurotransmiterem GABA - adenosin - produkt degradace ATP – větší spotřeba ATP buňkou –vyšší konc. – větší tlak na spánek - během spánku –rozklad adenosinu, tvorba ATP -tlak na spánek klesá. •zvýšená koncentrace v mozku -metabolický stres (anoxie , ischémie , prodloužené období bdělosti) – ochrana mozku potlačením jeho aktivity a zvýšením průtoku krve. •kofein se váže na stejné receptory –hromadění adenosinu (bez pocitu unavy) kofein 2-3h po probuzení, večer cvičení pomaha odbourat kofeinKofein může procházet epiteliální tkání, což znamená, že již po prvním doušku jej tělo vstřebává ústy, hrdlem, jícnem a žaludkem, ruzna citlivost na kofein u ruznych lidí, poločas rozpadu 4-6h, variabilita v CYP1A2-rozpad kofeinu a citlivost na kofein, Studie provedená na Harvardské univerzitě se zaměřila na 120 000 lidí a našla 6 genetických variací v tom, jak lidé metabolizují kofein a stávají se na něm závislými. Dva geny byly zodpovědné za to, jak je kofein metabolizován, dva byly spojeny s tím, jak se poté cítíme a také byly objeveny dva geny, které v reakci na kofein regulují tuk a cukr v krevním řečišti.^1^efekt kofeinu 8-14h, kofein zkracuje čas REM spánku, což je období, kdy dochází ke snění. Nukleové kyseliny Organelles in a cell. INTRACELULÁRNÍ •DNA - jádro, mitochondrie, „exclusome“ •mRNA a ncRNA (miRNA, siRNA) Hostitelské NK/Infekční částice Organelles in a cell. Liquid biopsy EXTRACELULÁRNÍ •cirkulující cell-free DNA •ncRNA •extracelulární vezikuly – exozomy, mikrovezikuly, apoptická tělíska – nesou gDNA, mtDNA, RNA, proteiny, lipidy Nukleové kyseliny Hostitelské NK/Infekční částice/Mikrobiom CTC- cirkulatin tumor cells, Cf Dna - fragments of nucleic acids present in many fluids of the human body, releas from autophagy an lysis – in plasma, CSF, urine, saliva, pleural fluid- most of is from hematopoietic system in healthy individuals,, exosome- plasmid , NETosis is a process that induces the neutrophil’s death after its contact with exogenous agents, cytomegalovirus, MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ DOGMA • • Telomeráza TERT •= tvorba kopií molekul DNA zajišťující přenos genetické informace • z mateřské do dceřiné buňky • •S - fáze buněčného cyklu •semikonzervativní proces – 1 nové + 1 staré vlákno • •Složky potřebné pro replikaci •templát – mateřské vlákno •primer – krátký oligonukleotid s volným 3´OH koncem •enzymy •nukleotidy • • Replikace DNA •Replikace je zahájena ve specifických místech – počátcích replikace („origins“) • •Vznik replikační vidlice •helikáza – umožňuje oddálit obě molekuly dvojšroubovice •SSB proteiny – napomáhají udržet vlákna rozdělená • •DNA primáza – tvorba RNA primerů • • • • • • • • • •DNA polymeráza – katalyzuje prodlužování řetězce •sekvence nového vlákna -komplemetarita bází - adenin + thymin – (2 vodíkové můstky) a cytosin + guanin (3 vodíkové můstky) •syntéza od 5´ konce ke 3´ konci • Replikace DNA •Templátová vlákna antiparalelní – jeden řetězec opožděn •Vedoucí řetězec – jeden RNA primer na začátku, replikace probíhá bez přerušení •Opožďující se řetězec – ve směru 5´- 3´ se diskontinuitně tvoří krátké Okazakiho fragmenty – (každý z nového RNA primeru), které se následně spojí DNA ligáza •RNA primery jsou odstraněny 5´-3´exonukleázovou a nahrazeny 3´-5´polymerázovou aktivitou Replikace DNA •REPLIKAČNÍ STRES (prof. Jiří Bártek) •Nádorová transformace - mnohokroková záležitost: První změna – zpravidla aktivace onkogenu způsobená (toxických látek v prostředí, kouřením, ozářením či metabolickou změnou) – vyvolá chaos v procesu replikace genomové DNA, replikační stres, který buňka detekuje a reaguje na tento stav „nebezpečí nádorové přeměny“ apoptózou. •Selhání kontrolních mechanismů apoptózy -nekontrolovatelné dělení poškozené buňky – další replikační stres - chromozomální zlomy a mutace DNA. Replikační stres pak působí opačně, místo sebevraždy vyvolává další a další mutace. •Replikační stres se dá měřit (u přednádorových buněk) • Replikační aparát musí čelit exogenním a endogenním vlivům, které mohou ovlivnit jeho postup zástavou replikačních vidlic. Hromadění zastavených replikačních vidlic a jejich případný kolaps vedoucí k formaci zlomů na DNA, které představují zásadní hrozbu pro integritu genomu, se nazývá replikační stres. Hayflickův limit pro každou buňku (replikativní senescence) - během každého cyklu se 5 konec zkracuje (odstranění primery z okazakiho fragmentu) - ztráta 5-200 bp - průměrná doba - 40 -60 dělení The Hayflick limit is a symptom of certain processes that play a role in human aging. It isn’t the whole story and fixing it won’t allow people to live longer. Výskyt R-smyček u replikačního stresu- navážou se na DNA během transkripce- když se zastaví, třeba nárazem do molekuly s oxidativního stresu nebo pokud chybí nějaký protein potřebný pro transkripci •přepis informace ze sekvence DNA do sekvence RNA •jádro buňky •templát - vlákno DNA •transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce •DNA-dependentní RNA polymeráza •3 typy (strukturně podobné, přepisují různé typy genů) •RNA pol. I (geny kódující rRNA) •RNA pol. II (geny kódující hnRNA) •RNA pol. III (geny kódující tRNA) •vyžaduje přítomnost transkripčních faktorů (rozvolnění řetězců DNA, umístění RNA polymerázy na promotor a uvolnění z promotoru) •Promotor = startovací místo na DNA – TATA box, CAT box •Terminátor = koncové místo - AAAA • • Transkripce •Modifikace primárních transkriptů: •Připojení čepičky na 5´konec (podílí se na řízení translace mRNA) • • • • • • •Připojení polyadenylačního řetězce na 3´konec •Sestřih (splicing) RNA – vystřižení intronů za vzniku zralé mRNA Posttranskripční modifikace •Překlad genetické informace z mRNA do sekvence AMK v polypeptidu (pomocí genetického kódu) – •Fáze – iniciace, elongace, terminace •Enzym - Aminoacyl-tRNA syntetáza (20 druhů) ligáza - navázání AMK na tRNA; katalyzuje: 1. navázání AMK k ATP - aktivace a vznik aminoacyl-adenylát (přechodný produkt -tRNA, na 3' – adenosin) 2. připojen přes karboxylovou skupinu aminokyseliny k 2' nebo 3' hydroxylové skupině koncového adenosinu tRNA molekuly, čímž vzniká tzv. aminoacyl-tRNA - putuje na A-místo ribozomu - místo translace 3. proofreeding – hydrolýza AMK a tRNA Iniciační komplex se tvoří na 5´konci mRNA (čepička), zkoumá mRNA od 5´konce a hledá iniciační kodon AUG •Terminace translace: UAA, UAG, UGA • • • •1 gen - 1 protein geny kódující více proteinů: Alternativní sestřih Různé čtecí rámce Různá místa iniciace a terminace Přeskok v čtecím rámci Epigenetika • Translace Translation | Description, Process, & Location | Britannica •1 protein - potřebný pro více biolog. procesů •1 biologický proces - více proteinů vazba hydrofobnímia interakcemi na drsné ER, ligáz, který umožňuje navázání jedné z dvaceti proteinogenních aminokyselin na příslušnou molekulu transferové RNA (tRNA).^[1Enzym katalyzuje nejprve navázání aminokyseliny k adenosintrifosfátu (ATP), čímž se aktivuje a vzniká tzv. aminoacyl-adenylát. Tento přechodný produkt je tedy v tuto chvíli složen z řetězce tRNA, na jehož 3' konci je připojen adenosin. Aminoacyl–adenylát je následně aktivitou stejného enzymu připojen přes karboxylovou skupinu aminokyseliny k 2' nebo 3' hydroxylové skupině koncového adenosinu tRNA molekuly, čímž vzniká tzv. aminoacyl-tRNA.^[2] Ta putuje na A-místo ribozomu, tedy na místo translace (syntézy proteinů z aminokyselin). •1. translace na ribozomech v cytosolu •2. translace na ribozomech vázající se na RER mRNA pro polypeptid (protein/ prekurzor hormonu) sekretovaný z buňky ven/ součást membrány •The attachment is always temporary (depends on the cell’s need to secrete) •An individual ribosome might be membrane-bound when it is making one protein, but free in the cytosol when it makes another protein •Proteins bound for a variety of locations (ER, Golgi, lysosomes, plasma membrane, secretion...) are translated by ribosomes in the cytoplasm but need to get into the ER. •The signal required for their transport into the ER is a short signal sequence at the beginning of the protein. When this begins to emerge from the ribosome's exit tunnel -- before translation of the rest of the protein -- it binds to a signal recognition peptide (SRP) that guides the ribosome to bind the ER. Then the protein can be channeled directly into the ER as translation continues. When translation finishes, the ribosome dissociates from the ER again. • Posttranslační úpravy organelové cílení složení do aktivního stavu terciální a kvartérní struktura Translace • https://www.researchgate.net/publication/350032586_RNA_Localization_and_Local_Translation_in_Glia_i n_Neurological_and_Neurodegenerative_Diseases_Lessons_from_Neurons/figures?lo=1 - cells consume a large amount of their available energy for the process of translation and for protein folding, it is not surprising that most stresses cause an inhibition in global protein synthesiscell -stress (cancerogeneisis-hypoxia, acidosis and nutrient starvation) - cause the accumulation of unfolded proteins in the ER - a major organelle that is involved in protein synthesis, preservation of cellular homeostasis, and adaptation to unfavourable environmen; folding capacity of the ER is limited. - the accumulation of unfolded proteins in the ER causes stress triggering an unfolded protein response in order to promote cell survival or to induce apoptosis in case of chronic stress. - synthesis of “housekeeping” proteins is paused in stressed cells, whereas the translation of a pool of proteins necessary for the adaptive stress response is maintained, via alternative mechanisms of translational initiation - ER stress triggers activation of the unfolded protein response (UPR) - alters both transcriptional and translational programs to coordinate adaptive and/or apoptotic responses -UPR aims to restore cellular homeostasis and to promote cell survival by inhibiting protein synthesis, improving protein folding ability, increasing the degradation of unfolded proteins. However, when damages are irreversible after intense and prolonged activation, UPR induces cell death. •= uspořádaný sled procesů, při kterých buňka zdvojí svůj obsah a následně se rozdělí na dvě buňky dceřiné (každá z nich ponese stejné chromozomy) • •Cíl: reprodukce genetického materiálu pro příští generaci buněk • •Jednobuněčné organismy •sladěno s růstem – mateřská b. musí dorůst do určité velikosti, aby se rozdělila • •Mnohobuněčné organismy •sladění replikace DNA s vývojovým programem buňky •sladění replikace a dělení každé buňky s vývojem příslušné tkáně nebo orgánu •dospělost - buňky se dělí, když je potřeba (nahrazení odumírajících buněk, obnova poraněné tkáně) •ztráta kontroly nad buněčným cyklem -> rakovina • E:\PREDNASK\obr6.jpg Buněčný cyklus –Interfáze – G1, G2, S (90%) •příprava na buněčné dělení, vnější jaderná membrána je spojená s ER •nepříznivé podmínky •setrvání v G1/vstup do G0; buňky nerostou, mohou tak setrvat i několik měsíců/let fig11_03 Buněčný cyklus •G0-fáze •většina buněk mnohobuněčných organismů (jsou diferencované a specializované k výkonu určité funkce, nedělí se) •po přijetí prorůstového faktoru mohou vstoupit zpět do buněčného cyklu •G1-fáze •nejdelší a nejvariabilnější •buňka se zvětšuje a zdvojuje organely •na konci této fáze se nachází kontrolní bod: bod restrikce •buňka má dostatek živin a růstových faktorů, vykazuje vysokou metabolickou aktivitu -> přejde bod restrikce a pokračuje do další fáze •nedostatek živin, obdržení antiproliferačního signálu -> zpomalení postupu fází/opuštění cyklu (přechod do G0) – •G2-fáze •dvojnásobné množství DNA (než v G1) •syntéza proteinů potřebných na vstup do mitózy •S-fáze •replikace DNA •syntéza proteinů asociovaných s DNA M fáze (mitotická) •mitóza x meióza •jaderné dělení, kondenzace chromozomů – až 10 000× •karyokineze a cytokineze •klesá syntéza RNA a proteinů • • genes become “silent” during cell division, not being transcribed into proteins or regulatory molecules? how genes get properly re-activated after cell division? Although chromosomes are extremely compact during cell division gene expression was still on – albeit at a low level – during replication ¨What ultimately drives cell differentiation are sequences of enhancer molecules located away from the gene they act on. far-away modifiers “nap” during division, since it only lasts about 30 minutes – relatively quickly in biological terms – and come back online after a cell division cycle is complete. •kladeny vysoké nároky na přesnost •bezchybná replikace •správné řazení fází •mitóza před dokončením replikace -> ztráta genetické informace min. u jedné buňky •dvojnásobná replikace před mitózou -> zvýšený počet kopií genů na příslušné části chromozomu -> nerovnováha v genové expresi, nízká viabilita •přesná segregace chromozomů •koordinace s vývojovými programy – Buněčný cyklus •řídící elementy – cyklin dependentní kinázy •řídí aktivitu mnoha proteinů zapojených do replikace DNA a mitózy tím, že je ve specifických místech fosforylují (aktivace/inaktivace) •Cyklin + CDK -> komplex se připojí na protein -> fosforylace proteinu -> po fosforylaci se komplex rozpadne a dojde ke změně aktivity proteinu •DNA •RNA •PROTEIN Biologický materiál Metody molekulární biologie Reverzní transkripce – Wikipedie https://www.kangaservices.gr/images/kanga/arthra/bio-uliko.jpg Práce s biologickým materiálem PLNÁ KREV - PLAZMA, SÉRUM ,SLINY, BUŇKY, TKÁNĚ, TĚLNÍ TEKUTINY • • Izolace DNA, RNA, PROTEINY Detekce a Kvantifikace • DNA Detekce polymorfismu a mutace 1. PCR (amplifikace konkrétního fragmentu)- RFLP (naštěpení spec. restrikčními enzymy) – detekce na ELFO 2. Real-Time PCR 3. Sekvenace 4. Micro-arraya Sekvenace Klonování v plasmidech, Zásah do genové exprese, CRISPR Epigenenom metylace DNA histonové modifikace 1. RNA - mRNA Analýza genové exprese Nothern Blott Real-Time PCR Analýza transkriptomu MicroRNA Analýza exprese Interference PROTEIN Analýza proteinů Imunohistochemické metody 1. Western Blott 2. ELISA Analýza proteomu MS Analýza buněk Průtoková flow-cytometrie •Detekce přítomnosti nukleové kyseliny specifické sekvence •Identifikace živočišného druhu •Paternita •Identifikace jedince - forenzní účely •Profil DNA – SNPs •Analýza struktury (sekvence) nukleové kyseliny •Stanovení genotypu •Detekce klinicky významných mutací a polymorfismů •Dědičné choroby •Detekce v onkogenech a supresorových genech v nádorech •Prenatální, preimplantační diagnostika •Kvantifikace nukleové kyseliny se specifickou sekvencí •Hodnocení intenzity a změny exprese genů – tumory •Kvantifikace proteinů a typů jejich posttranslační modifikace DNA diagnostika •Biologický materiál je vše, co bylo či je součástí nebo produktem živého organismu –sušená bylinná čajová směs –ohryzek od jablka –dubové prkno –kočičí trus/srst –zkumavka s virem SARS-CoV-2 –tělní tekutiny – moč, krev, plazma, sérum, sliny, ejakulát, hlen –tkáně, buňky Biologický materiál •V nativním stavu z přirozeného materiálu – v dostatečném množství a požadované čistotě. •NK je potřeba zbavit všech všech látek,které se po lyzi buněk stávají součástí hrubého lyzátu a jejichž přítomnost by bránila účinnému specifickému působení enzymů používaných k dalším analýzám • •Izolace genomové DNA •Izolace RNA – důraz na ochranu před degradací • •Stanovení koncentrace a čistoty DNA/RNA • – Spektrofotometrie •Kontrola kvality a integrity - ELFO Izolace nukleových kyselin Extract Reagent (Genomic DNA Isolation Reagent) | GeneDireX, Inc. Addgene: Kit Free RNA Extraction •Amplifikace vybraného úseku DNA •Mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce - řetězová reakce • vychází z DNA replikace • •Kary Mullis, 1983 •DNA řetězce duplexu může být denaturována a znovu spojena • •DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů • - separace řetězců • - syntéza krátkých RNA primerů • - syntéza dvou nových DNA helixů •DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym • (1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA Polymerázy) • •AŽ S OBJEVEM A POUŽITÍM TERMOSTABILNÍ POLYMERÁZY •(TERMOFILNÍ BAKTERIE) ZÍSKALA PCR NA VÝZNAMU •FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINŮ JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT ! • • • PCR – Polymerase chain reaction •Cíl – získání požadované a specifické sekvence genomové DNA •Princip – mnohonásobná replikace •cca 30 cyklů •závislost na teplotě reakční směsi •množství namnožené DNA roste exponenciální řadou (2n) • •komponenty PCR: •- templátová DNA •- dNTP •- pufr (pH=8) •- Mg2+ ionty (aktivita a přesnost polymerázy) •- Primer - krátké specifické úseky DNA, •oligonukleotid 20–25 pb, ohraničení oblasti amplifikace DNA •- DNA polymeráza •termostabilní (odolává teplotám až 98 °C) •Taq (Thermus aquaticus), Tth (Thermus thermophilus) •- teplota •opakování cyklů: • - denaturace (separace dsDNA) • - navázání primerů • - elongace primerů • - syntéza nového vlákna DNA • pomocí změn teploty! Praktická část cvičení Life of a molecular biologist | Biology humor, Science jokes, Science memes Stanovení SNP +3953C/T (rs1143634) v genu pro interleukin IL-1beta u pacientů s chronickou peridontitidou • • CO? •cytokiny X onemocnění parodontu PROČ? Zánětlivé onemocněnění parodontu - komplexní onemocnění (endogenní a exogenní faktory) 1.Příčina zánětu-mikrobiální plak (anaerobní bakterie) – začátek imunitní odpovědi 2. Individuální predispozice 1. RIZIKOVÉ A PROTEKTIVNÍ ALELY IL-1beta – prozánětlivý cytokin – rizikové alely (Kornman, 1997) Práce z biologickým materiálem (PLNÁ KREV, PLAZMA, SÉRUM) • • • Izolace DNA • METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE JAK? 1.Amplifikace DNA úseku - PCR 2.Detekce polymorfního místa - Restrikční analýza 3. Vizualizace - Elektroforéza 1.PCR IL-1B +3953C/T (rs1143634) u subjektů s chronickou peridontitidou • •CCTTCTGATT TTATACCTAA ACAACATGTG CTCCACATTTCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT • • • JAK? 249bp Forward Reverse amplifikace vybraného úseku z celkové DNA 1.RFLP IL-1B +3953C/T (rs1143634) pomocí restrikční endonukleázy TaqI • • • • •CCTTCTGATT TTATACCTAA ACAACATGTG CTCCACATTTCAGAACCTAT CTTCTTCGAC ACATGGGATA ACGAGGCTTA TGTGCACGAT • • • JAK? 249bp Forward Reverse 114bp 135bp C detekce úseku s konkrétní variantou C/T 1.ELFO restrikčních fragmentů po štěpení TaqI (Agarózový gel) • •1. Neštěpená TT • •2. Štěpená CC • • •3. Heterozygot CT – 3 pruhy • JAK? 249bp 114bp 135bp C vizualizace DNA fragmentů po restrikční analýze 1.Praktické provedení PCR PCR Objem v mikrozkumavce: 25ųL Složení (1 vzorek): •templátová DNA (2ųL) •2 primery (1.25 ųL) •MgCl2 25mM (4 ųL) •dNTP mix (0.5 ųL) •Taq polymeráza 1U (1 ųL) •pufr (2.5 ųL) •PCR H2O (12.5 ųL) 1 kapka minerálního oleje 1.95°C…..5minut 2.95°C…..1 minuta 3.60°C…..1minuta 4.72°C…..1minuta 5.72°C…..7minut 6.10°C…..10minut 35x Práce s mikropipetou •Pipetu držím vždy vertikálně (špičkou dolů). • •Pipetu držím v dlani zavěšenou za ukazováček a ovládám ji palcem. • •Vyberu optimální rozsah objemu!!! Nikdy nepřekračuju rozsah pipety nahoru ani dolů!!! •Před pipetováním musíme na pipetu nasadit příslušnou špičku (dle objemového rozsahu pipety). • •Vždy používám novou sterilní špičku. • •Pokud opakovaně pipetuju tentýž roztok, ponechám na pipetě po celou dobu práce tutéž špičku. • •K odhazování špiček slouží tlačítko na boční straně pipety. • • • Práce s mikropipetou Postup: •Na pipetě nastavím požadovaný objem. Vodorovná čára na displeji značí desetinnou čárku. •Nasadím špičku na pipetu (důkladně utěsním) – ne rukama! • •Pipetu uchopím tak, abych si o ukazováček podepřel/a držák a palcem tak mohl/a pracovat s dvoupolohovým ovladačem. • •Nasátí: ovladač stlačím do polohy „1“ (špička je ve vzduchu), ponořím do roztoku a pomalu pustím. • •Vypuštění: pipetu ponořím do roztoku, kam chci pipetovanou látku přidat. Vypustím roztok stlačením ovladače do polohy „1“, dokončím stlačením do polohy „2“ a vyjmutím špičky z roztoku (stále v poloze „2“). • •Ovladač pustím, špičku vyhodím. Obsah obrázku držení, interiér, osoba, zeď Popis byl vytvořen automaticky