Základní metody molekulární biologie Jolana Lipková •Biologický materiál je vše, co bylo či je součástí nebo produktem živého organismu • –sušená bylinná čajová směs –ohryzek od jablka –dubové prkno –kočičí trus/srst –zkumavka s virem SARS-CoV-2 –tělní tekutiny – moč, krev, plazma, sérum, – sliny, ejakulát, hlen, MMM –tkáně, buňky –experimentální organismy Biologický materiál Slina jako diagnostické medium – biomarkery onemocnění ̶ autoimunitní onemocnění Sjögrenův syndrom – α-amyláza, karbonická anhydráza VI, laktoferin, β2-mikroglobulin ̶ neurodegenerativní onemocnění Alzheimerova choroba – celkový tau protein, fosforylovaný tau protein, amyloid-β a alfa-synuklein ̶ genetické onemocnění 2- cystická fibróza – Ca, PO4 , Na, K, Cl, ↓ objem slin, močovina, kyselina močová, prostaglandin E2 ̶ rakovina spinocelulární karcinom – IL-8, IL-6, IL-1β, IL-4, IL-1, VEGF, HER2, tissue polypeptide antigen (TPA) and EGFR, LDH, N-α-acetyltransferase 10 protein (Naa10p), carcinoembryonic antigen (CEA) protein, serum basic fibroblast growth factor (bFGF), transferin, cyklin D, Maspin, specifické mRNA r. prsu - HER2/neu (C-erbB-2), VEGF, EGF, specifické mRNA, autoprotilátky proti HER2 a MUC-1 r. slinivky – transkriptomické markery mRNA (KRAS, MBD3L2, ACRV1 a DPM1), specifické miRNA, laktoperoxidáza, Cyklofilin B, Cytokeratiny (14, 16 a 17) ̶ alergie potravinová alergie - IgE a IgG1 ̶ kardiovaskulární onemocnění CK-MB, myoglobin, troponin I, myeloperoxidáza, markery zánětu (CRP, TNF-α, MMP-9), markery adheze (rozpustný CD40 a ICAM-1) ̶ metabolismus diabetes melitus 2. typu – 1,5-anhydroglucitol, CRP, leptin, IL-6, TNF-α ̶ infekční onemocnění HIV – protilátky proti HIV viry – přítomnost protilátek IgM/IgA, virová RNA Kandidóza, amébiáza – přítomnost Candida sp., Entamoeba histolytica (protilátky) Hepatitida – přítomnost DNA viru HBV Peptidické vředy, gastritida, – přítomnost Helicobacter pylori (IgG protilátky, DNA H. pylori) ̶ hormonální nemoci Cushingův syndrom a Addisonova choroba – kortizol; pohlavní hormony – syndrom polycystyckých ovarií, menopauza/andropauza, anovulace, hypogonadismus, hyperestrogenismus Práce s biologickým materiálem • • Izolace DNA, RNA, PROTEINY Detekce a Kvantifikace • DNA genotypizace/detekce polymorfismu a mutace 1. PCR (amplifikace konkrétního fragmentu)- RFLP (naštěpení spec. restrikčními enzymy) – detekce na ELFO 2. Real-Time PCR (qPCR) 3.Sekvenace 4. micro-arrays analýza sekvence DNA klonování, zásah do genové exprese, CRISPR Epigenenom metylace DNA histonové modifikace 1. RNA - mRNA Analýza genové exprese Nothern Blott Real-Time PCR (qPCR) Analýza transkriptomu nekódující RNA (miRNA, siRNA) Analýza genové exprese Interference PROTEIN Analýza proteinů Imunohistochemické metody 1. Western Blott 2. ELISA Analýza proteomu MS Analýza buněk Průtoková flow-cytometrie Metody molekulární biologie Nukleové kyseliny Organelles in a cell. INTRACELULÁRNÍ •DNA - jádro, mitochondrie, „exclusome“ •mRNA a ncRNA (miRNA, siRNA) Hostitelské NK/Infekční částice Organelles in a cell. Liquid biopsy EXTRACELULÁRNÍ •cirkulující cell-free DNA •ncRNA •extracelulární vezikuly – exozomy, mikrovezikuly, apoptická tělíska – nesou gDNA, mtDNA, RNA, proteiny, lipidy Nukleové kyseliny Hostitelské NK/Infekční částice/Mikrobiom CTC- cirkulatin tumor cells, Cf Dna - fragments of nucleic acids present in many fluids of the human body, releas from autophagy an lysis – in plasma, CSF, urine, saliva, pleural fluid- most of is from hematopoietic system in healthy individuals,, exosome- plasmid , NETosis is a process that induces the neutrophil’s death after its contact with exogenous agents, cytomegalovirus, •1997- “commensal viruses”; extremely high prevalence •involve in immune dysfunction and immune activation, including congenital and iatrogenic immunodeficiency, chronic viral infections and aging •The replication of TTV, similar to all the viruses constituting the virome, is controlled by a functioning immune system. And quantifying the virus load in blood is thought to be a potential read-out of this functionality. •correlation between unfavorable outcome or disease progression, and increasing or higher TTV loads •high TTV loads are associated with an increased risk of infection, and low TTV loads are associated with an increased risk of rejection •pantropic (many tissues and fluids )- blood, fairly high viral loads in breastmilk, respiratory secretions, and saliva Torquetenovirus (TTV) is the most abundant component of human virome •endemic worldwide •insensitive to current antiviral drugs •marker of immunosupression •V nativním stavu z přirozeného materiálu – v dostatečném množství a požadované čistotě. •NK je potřeba zbavit všech všech látek,které se po lyzi buněk stávají součástí hrubého lyzátu a jejichž přítomnost by bránila účinnému specifickému působení enzymů používaných k dalším analýzám • •Izolace genomové DNA •Izolace RNA – DEGRADACE! • • • •Stanovení koncentrace a čistoty DNA/RNA • – Spektrofotometrie •Kontrola kvality a integrity - ELFO Izolace nukleových kyselin Extract Reagent (Genomic DNA Isolation Reagent) | GeneDireX, Inc. Addgene: Kit Free RNA Extraction •Separační metoda využívaná při izolaci a analýze NK (a proteinů = polyakrylamidová elfo) •Izolující molekuly o rozdílné hmotnosti, popř. odlišném elektrickém náboji, využívající jejich odlišnou pohyblivost v elektrickém poli •agarózová (produkt mořských řas – agar)/polyakrylamidová • Gely tvoří hustou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji • než menší molekuly –technika molekulového síta •Rychlost pohybu je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku •DNA má uniformní negativní náboj v elektrickém poli se pohybuje od katody k anodě • •EtBr – vmezeří se mezi báze, zviditelní DNA pod UV • (po vazbě na DNA pod UV emituje oranžové světlo) • •Velikost fragmentu DNA lze stanovit dle hmotnostních standardů • (= restrikční fragmenty plazmidových molekul nebo genomu bakteriofágů, • jejichž velikost byla stanovena sekvenováním) • •Části aparatury: elektroforetická vana, separační gel, pufr, zdroj stejnosměrného elektrického proudu • • • • • • • Gelová elektroforéza - agarózová https://ars.els-cdn.com/content/image/3-s2.0-B9780444636881000070-f07-01-9780444636881.jpg?_ (B) Ideální vzorek DNA (C) Částečně degradovaná DNA (D) Degradovaná DNA (E) DNA kontaminovaná RNA (degradovaná) (F) DNA kontaminovaná proteinem (A) Trans2K™ Plus DNA Marker (0,1 kb- 5 kb) (B) Ideální vzorek RNA (C) RNA kontaminovaná DNA a proteinem (D) Degradovaná RNA (E) RNA kontaminovaná gDNA *Ribosomální RNA migruje v agarózovém gelu rychleji než stejně velký fragment DNA, a proto při použití DNA žebříčku nelze určit skutečnou velikost 28/18/5S rRNA •Amplifikace vybraného úseku DNA • (exponenciální amplifikace DNA fragmentu) • •Mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce • - řetězová reakce vychází z DNA replikace • •Kary Mullis, 1983 •DNA řetězce duplexu může být • denaturována a znovu spojena • •DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů • • • • • • •DNA replikace in vitro vyžaduje pouze • jeden enzym (1957 Arthur Kornberg • dokázal existenci DNA Polymerázy) • • FUNKCE OSTATNÍCH PROTEINŮ JE in vitro NAHRAZENA ZMĚNOU TEPLOT ! • PCR – Polymerase chain reaction •komponenty PCR: •templátová DNA •dNTP •pufr (pH=8) •Mg2+ ionty (aktivita a přesnost polymerázy) •Primer - krátké specifické úseky DNA, •oligonukleotid 20–25 pb, ohraničení oblasti amplifikace DNA •DNA polymeráza •termostabilní (odolává teplotám až 98 °C) •Taq (Thermus aquaticus), Tth (Thermus thermophilus) •teplota • • • • • •opakování cyklů: • - denaturace (separace dsDNA) • - navázání primerů • - elongace primerů • - syntéza nového vlákna DNA • • pomocí změn teploty! • • • • •až s objevem a použitím TERMOSTABILNÍ POLYMERÁZY •(termofilní bakterie) získala PCR na významu PCR Protocol : r/funny [USEMAP] 1 copy Cycle 35 n36 = 68,719,476,736 copies in ~ 2 hrs 2 copies Cycle 2 4 copies Cycle 3 8 copies Xeroxing DNA •Restrikční endonukleáza • (Meselson and Yuan 1968, Smith • and Wilcox 1970) •sekvenčně specifické endonukleázy (původ z bakterií) •EcoRI (Escherichia coli), HindIII (Haemophilus influenzae) •tupé/lepivé konce •funkce: •rozpoznání specifické sekvence dsDNA a následná restrikce (hydrolýza fosfodiesterových vazeb) •rozpoznávací místo •4–8 bp dlouhé •charakter palindromu = stejné pořadí bází v obou směrech • Restrikční enzymy •Enzymatické štěpení DNA ve specifickém restrikčním místě •Restrikční endonukleázy •Produktem jsou fragmenty o různé délce •Vzniklé fragmenty jsou separovány pomocí gelové elektroforézy • •Využití: –mapování DNA, analýza modifikací DNA, příprava mutantů –na základě velikosti a počtu fragmentů lze sledovat rozdíly ve studovaných sekvencích, tzv. polymorfizmy (polymorfizmy vznikají přestavbou v řetězci, např. inzercí, delecí, substitucí bází) –příbuznost jedinců, určení paternity, identifikace osob – –Neštěpená TT –Štěpená CC –Heterozygot CT RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism •tvorba rekombinantních DNA •přečnívající kompatibilní konce usnadňují spojení různých fragmentů DNA •hormon Protropin® (Genentech, 1985) •interferon α Roferon A® (Hoffmann-La Roche, 1986) •první rekombinantní vakcína proti hepatitidě B Recombivax® exprimovaná v kvasince Saccharomyces cerevisiae (Merck, 1986) •první přípavek založený na monoklonální protilátce Orthoclone OKT 3 (Janssen-Ortho, 1986)(Cvak a Fusek, 2004). •2006 - registrováno 1452 biotechnologických firem v USA •tetravalentní vakcína proti lidskému papilomaviru (HPV) s názvem Gargasil, Silgard , 2006 • •tvorba GMO •bakterie mění DNA (Agrobakterie) rostliny, aby ta dělala, co ony potřebují •1986, schválena první první transgenní rostliny – tabáku nesoucího vložený gen pro rezistenci k herbicidu. Environmental Protection Agency,c USA •70 % dnes pěstované bavlny je geneticky modifikovaných Restrikční endonukleázy •PCR sledovaná v reálném čase •Kvantifikace DNA – množství DNA je zaznamenáváno v průběhu každého cyklu • (fluorescence) •Detekce množství DNA je umožněna přítomností fluorescenčního substrátu •Provádí se ve speciálním cycleru, který • umožňuje: –Cyklické střídání teplot –Detekci fluorescence –Monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR produkty elektroforeticky • •qPCR se obvykle provádí v 96 jamkových destičkách, úroveň fluorescence je zaznamenávaná v jednotlivých jamkách •Vysoce citlivá a vysoce specifická metoda •DNA (genotypizace), RNA (expresní analýza) • • • qPCR – Kvantitativní Real-time PCR Real-Time PCR: Principle, Process, Markers, Uses 1.Detection and Quantitation •Gene expression analysis – mRNA, microRNA •Human Immunodeficiency Virus (HIV) •Circulating DNA, RNA of viruses, bacteria, protozoa •Effect of antimicrobial peptides on host cells (host mRNA) •Noninvasive Prenatal Diagnosis by Analysis of Fetal DNA in Maternal Plasma 1. 2. Detection of mutation and SNP genotypization •Detection of Thalassemia, hemophilia, Sickle cell anemia & favism •Cystic fibrosis, Phenyl ketonuria….. •Use in forensic medicine (DNA match based on SNP, paternity test…) . … Figure 1. Examples of specific molecular beacon fluorescence increase during real-time PCR in samples containing single lymphoblasts homozygous normal for CF (green), heterozygous DF508 (blue), or homozygous DF508 (red). (A) Fluorescent signal from the molecular beacon detecting the normal allele. (B) Fluorescent signal from the molecular beacon detecting the DF508 allele. Dashed lines indicate the threshold of 200 units (~10 SD above baseline readings) used for determining CT values. Cystic fibrosis genotypization Real Time PCR (qPCR) - Diagnostika •Stanovení primární struktury DNA (pořadí nukleotidů) • •a) chemická metoda – dříve; degradace řetězců nukleových kyselin pomocí chemických činidel (dimethylsulfát, NaOH, hydrazin,..) – Maxam-Gilbertova metoda •b) enzymatická metoda – specifická inhibice enzymové syntézy DNA (ddNTP) – Sangerova metoda •c) moderní velkoformátové aplikace založené např. na pyrosekvenování (sekvenování nové generace) • •Produkt – řetězce ssDNA, jejichž vzájemná velikost se liší o jednu bázi (elfo rozdělení) • •Vstupní materiál – fragment DNA s přesně definovanými konci • Sekvenace DNA •Sekvence je odvozena z molekuly DNA, která se chemicky degraduje na fragmenty v místech, kde se vyskytuje báze určitého typu. Ty se následně separují pomocí elfo. •Chemická činidla – příklad: –piperidin narušuje glykosidovou vazbu A a G (A + G) –hydrazin za přítomnosti NaCl reaguje pouze s C –NaOH při 90 °C způsobuje silné štěpení u A a slabé štěpení u C (A > C) •Vyžaduje radioaktivní značení na jednom konci ssDNA. •Reakce je prováděna ve 4 zkumavkách – v každé zkumavce jsou štěpeny pouze určité typy bazí. •Vzniká směs různě dlouhých fragmentů končících v místě určité báze –> vyhodnocení pomocí elfo, stanovena sekvence daného úseku. Maxam-Gilbertovo sekvenování Schematic illustration of sequencing with the Maxam Gilbert method. | Download Scientific Diagram Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0 Sangerovo sekvenování •Enzymová metoda – Dye-terminator-sequencing •Plně automatizováno – v jedné reakci •Metoda koncových terminátorů - ddNTP = analog dNTP, ale postrádá hydroxylovou skupinu na 3´ pozici uhlíku •Založeno na principu replikace – ukončení syntézy DNA v okamžiku, kdy se ddNTP zařadí na místo dNTP •Reakční směs (4x) •DNA templát •primer •ddNTP – v nízké koncentraci •dNTP – v nadbytku (aby bylo možné získat fragmenty všech možných délek) •Taq DNA polymeráza - syntéze DNA od 5´ ke 3´ konci •pufr •Vyhodnocení – elektroforéza Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=wdS3j0TgbjM http://www.esciencecentral.org/ebooks/applications-of-molecular-genetics/images/AMGPM_DNA-Seq-g002. gif Sangerovo sekvenování • Kapilární sekvenace DNA s fluorescenčně značenými ddNTP NGS – Next Generation Sequencing •High-throughput sequencing (HTS) methods • "massively parallel" sequencing •Sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně •Templátová DNA je fragmentována na úseky několik set bp dlouhé •Konce fragmentů jsou enzymaticky zatupeny a napojeny k oligont určité sekvence (= adaptéry) •Jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR a v dalším kroku paralelně sekvenovány • •Využití: –celogenomové sekvenování (evoluční biol.) –sekvenování chromozomů, plazmidů, mt –studium genetické variability, mutační analýza –transkriptomová analýza –antropologie: srovnávání DNA k zjišťování migrací lidských ras (zejména podle mitochondriální DNA a Y-chromozomální DNA) What is Next Generation Sequencing NGS? - Enzo Life Sciences Next-Generation Sequencing Challenges Video pro názornost: https://www.youtube.com/watch?v=shoje_9IYWc "Personalized Medicine" • •Výzkumná skupina Martina Piskáčka: Transkripce v maligních buňkách a v imunitě •molekulární mechanismy genové aktivace, maligni transformace a nespec. imunity – gamma-delta T buněk • •Babákova myelomová skupina (Vedoucí skupiny, doc. RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D.) •problematika monoklonálních gamapatií, zejména mnohočetného myelomu, extramedulárního onemocnění mnohočetného myelomu a plazmocelulární leukémií •Standardní je odběr kostní dřeně. •BMS se dlouhodobě věnuje problematice tzv. tekutých biopsií (biopsie z tělních tekutin), které jsou šetrnější pro pacienty a v budoucnu by mohly zastoupit dosavadní invazivní metody vzhledem k tomu, že mohou zahrnout celou heterogenitu nádoru. BMS se zaměřuje především na analýzu nekódujících molekul RNA. • • •Výzkumná skupina Kateřiny Kaňkové: Molekulární patofyziologie diabetických komplikací •(A) studium procesů, kterými chronická porucha glukózového metabolismu (ale nejen toho) vede k rozvoji jeho pozdních komplikací, a to zejména diabetické nemoci ledvin (angl. diabetic kidney disease, DKD). DKD představuje velmi závažnou komplikaci cukrovky zvyšující kardiovaskulární riziko a významně zhoršující kvalitu života diabetiků. Věnujeme se problematice gluko- a lipotoxicity, reaktivních metabolitů, thiaminovému metabolismu a pentózovému cyklu, genetické determinace aktivity těchto procesů apod. •(B) problematika patofyziologie gestačního diabetu (GDM), konkrétně možnosti predikovat míru poruchy glukózové tolerance po porodu a otázka dopadu GDM na vývoj potomka GDM matky •(C) vlivu diabetického mikroprostředí na vznik a rozvoj nádorů (zejm. kolorektálního karcinomu). Výzkum - Ústav patologické fyziologie •Výzkumná skupina Moniky Pávkové Goldbergové: Kovy v medicíně •zaměřena na problematiku základního a aplikovaného výzkumu v oblasti kovů využívaných v implantologii a nanostruktur (nanočástic a nanostrukturovaných povrchů) a jejich vlivu na organismus, a to zejména na úrovni buněčné a tkáňové. • •Výzkumná skupina Kamila Ďuriše: Subarachnoidální krvácení •patofyziologie subarachnoidálního krvácení (experimentální i klinický charakter ve spolupráci s Neurochirurgickou klinikou FN Brno) •studium rozvoje časné zánětlivé odpovědi v mozku i v celém organizmu v důsledku subarachnoidálního krvácení •dynamika zánětlivé odpovědi po subarachnoidálním krvácení, závislost na tíži krvácení apod., •(regulace/deregulace zánětlivé odpovědi, evoluční koncept imunitní reakce apod.) •studium možností potlačení neadekvátní imunitní reakce - možnostmi imunomodulace pomocí stimulace nervus vagus. Efekt vágové stimulace na potlačení zánětu je studován jak u zánětu obecně (sepse), tak i specificky u zánětu po subarachnoidálním krvácení. Vedle přímé stimulace se skupina věnuje i studiu efektu stimulace nepřímé, která je neinvazivní, a z toho důvodu má velký klinický potenciál • • • • Výzkum - Ústav patologické fyziologie •Výzkumná skupina Michala Masaříka: Cancer Research Lab •primární výzkumu v oblasti biomarkerů karcinomu prostaty, prsu či spinocelulární karcinomy v oblasti hlavy a krku •analýza rezistence nádorových buněk vůči terapii •analýza buněčné smrti a genové exprese •nové biofyzikální techniky pro detekci biomakromolekul •testování nových protinádorových léčiv a jejich nosičů - migrastatika • •Divize „live-cell“ biomarkerů nádorových stavů •Divize buněčná mechanika •Divize analýzy buněčných smrtí •Divize biostatistiky, strojového učení a analýzy obrazu •Divize analýzy a testování nových léčiv a jejich nanonosičů Výzkum - Ústav patologické fyziologie