Cvičení č. 2 Výpočty Mgr. JULIE ŠTÍCHOVÁ Burst test výpočty (1a) Pro stanovení oxidačního vzplanutí je zapotřebí chemikálie dihydrorhodamin 123 Výrobce ho dodává v 10mg balení Látka se rozpouští v DMSO Jak připravíte zásobní roztok o koncentraci 1mg/ml? Burst test výpočty -výsledek Pro stanovení oxidačního vzplanutí je zapotřebí chemikálie dihydrorhodamin 123 Výrobce ho dodává v 10mg balení Látka se rozpouští v DMSO Jak připravíte zásobní roztok o koncentraci 1mg/ml? Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO Počet zamrazovacích zkumavek (1b) Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO Zásobní roztok je třeba rozplnit do po 45 ul a zamrazit na -80°C Kolik zamrazovacích zkumavek si musí laborant(ka) připravit a popsat? Počet zamrazovacích zkumavek -výsledek Zásobní roztok připravíme přidáním 10ml DMSO Zásobní roztok je třeba rozplnit do po 45 ul a zamrazit na -80°C Kolik zamrazovacích zkumavek si musí laborant(ka) připravit a popsat? Laborant(ka) si musí připravit 222 zamrazovacích zkumavek Koncentrace (1c) Pro vlastní stanovení se používá 45ul zamrazeného roztoku dihydrorhodaminu 123 (DHR123), ke kterému se přidá 455ul roztoku PBS. Z tohoto zásobního pracovního roztoku se dává do 1 zkumavky 30ul. Kolik DHR 123 je v jedné zkumavce? Koncentrace (1c) - výsledek Pro vlastní stanovení se používá 45ul zamrazeného roztoku dihydrorhodaminu 123 (DHR123), ke kterému se přidá 455ul roztoku PBS. Z tohoto zásobního pracovního roztoku se dává do 1 zkumavky 30ul. Kolik DHR 123 je v jedné zkumavce? V jedné zkumavce je 2,7ug DHR123. Čas (1d) Na jeden Burst test pro jednoho pacienta je zapotřebí 4 zkumavky 45ug DHR123 se naředí na 500ul Do každé zkumavky se přidává 30ul naředěného DHR Za rok se testem na Burst test vyšetří průměrně 160 pacientů. Na jak dlouho vydrží zásoba DHR123 v mrazáku – 222 zkumavek? Čas (1d) - výsledek 10mg = 10 000ug Koncentraci 1000ug/ml získáme přídavkem 10ml DMSO. 10ml = 10 000ul/45ul=222,22 1000ul…..1000ug DHR 123 45ul……….45ug DHR123 a ty dáme do 500ul ve 30ul pak je 30x45/500=2,7ugDHR v jedné zkumavce Jeden pacient 4x30ul=120ul Zásobní roztok 500ul/120=4,1 160 pacientů za rok: 160/4=40 – na rok budu potřebovat 40 zkumavek Mám zásobu 222 zkumavek /40zkumavek potřebuji na rok tj. zásobu mám na 5,7 roku Příprava buněčné suspenze pro proliferaci (2a) Pro test proliferace lymfocytů bylo zapotřebí izolovat PBMC z plné krve Při izolaci bylo získáno 10x10*6 PBMC, přičemž bylo živých 95% izolovaných buněk. Buněčná suspenze byla v 1ml média (= zásobní koncentrace, pro test počítáme pouze se živými buňkami) Počet jamek: buňky budou stimulovány 5 různými stimulancii, dále bude zapotřebí ještě nestimulovaná kontrola. Pro každou stimulaci se použijí tři jamky, tj bude se pracovat v tripletech + 2 jamky jako rezerva Na jednu jamku připadne 200 000 buněk a ty budou ve 200ul média (= pracovní koncentrace - 1 milion/ml). Cíl: Nařeďte si buňky kultivačním médiem ze zásobní koncentrace tak, abychom jich měli dostatek pro všechny jamky v patřičném objemu 200ul/jamka. Poznámka – médium je velice drahé a je třeba s ním šetřit! Příprava buněčné suspenze pro proliferaci (2a) - výsledek 100%.........10,0x10*6 95%.........=10,0x10*6 x 95/100 = 9,5x10*6 5 stim + 1 nestim, na každou 3 jamky =6x3=18 + 2 jamky navíc - budu potřebovat 20 jamek po 200 000bb., tj 20x200 000= 4 000 000bb = 4x10*6 . 9,5x10*6 ………..1000ul 4x10*6………….=4x1000/9,5 = 421ul Ideální je připravit si roztok o koncentraci 1mil/ml Tj k 421ul přidáme 3579 ul roztoku média, poté pipetujeme 200ul/jamka Příprava roztoku anti-CD28 (3a) Anti-CD28 protilátka se používá jako kostimulační protilátka při testech aktivace T-lymfocytů Pro stanovení aktivace T-lymfocytů budeme stimulovat vzorky od 10 pacientů a 10 kontrol a pro každou osobu budeme potřebovat 2 jamky po 200 000 buňkách ve 200ul média (= 1milion/ml) Jedna jamka již obsahuje 195ul média s buňkami a do konečného objemu 200ul potřebujeme doplnit 5ul naředěné anti-CD28 protilátky Zásobní roztok anti-CD28 má koncentraci 1mg/ml Jak budete postupovat při přípravě pracovního roztoku, když konečná koncentrace anti-CD28 v jamce po přidání k buňkám musí dosáhnout 2ug/ml? Příprava roztoku anti-CD28 (3a)- řešení 10 pac + 10 kontrol=20, každý 2 jamky, tj celkem 40jamek, v každé bude finální objem 200ul Koncentrace anti-CD28: 1mg/ml, tj. 1000ug/1000ul Požadovaná koncentrace je 2ug/ 1000ul, tj do 200ul v jamce potřebuji 0,4ug anti-CD28 Příprava zásobního roztoku: 40jamek*0,4 = 16ug zásobního roztoku anti-CD28 (zás.koncentrace 1mg/ml à 16ug = 16ul anti-CD28) Potřebuji celkem 40 jamek po 5ul anti-CD28 každá. Pracovní roztok si tedy připravím: 16ul zásobního roztoku anti-CD28 + 184ul média = 200ul (vystačí na pipetování 40 jamek po 5ul) Titrace vzorku pro nepřímou imunofluorescnci (5a) Základní ředění vzorku na vyšetření ANA NIF je 1:80 (nejednoznačné vyjádření… může znamenat 1+79 nebo 1+80). Pokud jsou ANA při tomto ředění pozitivní, ordinuje odečítající většinou titraci (ředění) vzorku. Popište, jakým způsobem byste postupovali, (jaké objemy séra a ředícího pufru byste použili), kdybyste měli naředit vzorek séra v řadě: 1:80, 1:160 a 1:320 1:320, 1:640 s 1:1280 Minimální objem séra který se bude pipetovat je 10ul (= 1 díl) Spotřeba vzorku každé koncentrace na analýzu je 50 ul (počítejte s tím, aby byl v každé zkumavce rezervní objem 50ul navíc). Titrace vzorku pro nepřímou imunofluorescnci (5a) - řešení Ředění 1:80: 10ul séra a 800ul ředícího pufru (PBS) Ředění 1:160 z ředění 1:80 vzít 100ul, přidat 100ul PBS Ředění 1:320 z ředění 1:160 vzít 100ul, přidat 100ul PBS Ředění 1:320 přímo ze séra: 5ul séra +1600ul PBS (nebo 10ul séra + 3200ul PBS – důležité je dodržet poměr) Následné ředění 1:640: z ředění 1:320 vzít 100ul, přidat 100ul PBS Následné ředění 1:1280: z ředění 1:640 vzít 100ul, přidat 100ul PBS Výpočet absolutního počtu lymfocytů Při vyšetření lymfocytárních subpopulací je kromě relativního počtu ještě zapotřebí určit absolutní počet lymfocytů a jejich subpopulací, tedy reálný počet buněk, který se nachází v 1l krve. Příklad: Počet leukocytů v krvi pacienta: 10x10*9leukocytů/l Z cytometrické analýzy vyplývá, že pacient má 20% lymfocytů, 10% monocytů. Kolik procent tvoří granulocyty? Jaký je absolutní počet všech lymfocytů? Lymfocyty pacienta tvoří 60% T-lymfocytů, 30% B-lymfocytů a 10% NK buněk. ? Jaký je absolutní počet všech T-lymfocytů? T-lymfocyty pacienta zahrnují 60% pomocných CD4+ T-lymfocytů a 40% cytotoxických CD8+ T-lymfocytů. Jaký je absolutní počet všech cytotoxických T-lymfocytů? Výpočet absolutního počtu lymfocytů - řešení 10x10*9leukocytů/l Z cytometrické analýzy vyplývá, že pacient má 20% lymfocytů, 10% monocytů. Kolik procent tvoří granulocyty? 100-(20+10)=70 Granulocyty tvoří 70% ze všech leukocytů. Jaký je absolutní počet všech lymfocytů? 100%...... 10x10*9/l 20%......2x10*9 /l Absolutní počet všech lymfocytů je 2x10*9 /l. Lymfocyty pacienta tvoří 60% T-lymfocytů, 30% B-lymfocytů a 10% NK buněk. ? Jaký je absolutní počet všech T-lymfocytů? 100%...... 2x10*9 /l 60%......1,2x10*9 /l Absolutní počet všech T-lymfocytů je 1,2x10*9 /l. T-lymfocyty pacienta zahrnují 60% pomocných CD4+ T-lymfocytů a 40% cytotoxických CD8+ T-lymfocytů. Jaký je absolutní počet všech cytotoxických T-lymfocytů? 100%......1,2x10*9 /l 40%......4,8x10*8 /l Absolutní počet všech lymfocytů je 4,8x10*8 /l. Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA (4a) Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky (=pro 2 použití v různých časech!) Popište přípravu celkem 7 kalibrátorů získaných dvojkovým ředěním, aby zásobní standard vyšel na dvakrát. Spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku, jamky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200ul + 50 μl rezervní objem) Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? Jak budete ředit dále? Jakou koncentraci bude mít každý ze 7 připravených kalibrátorů? Ředění kalibrátoru pro tvorbu kalibrační křivky v testu ELISA (4c) Set na stanovení IL-8 obsahuje 60ul základního standardu o koncentraci 20ng/ml. Kalibrátor je určen pro dvě desky Popište přípravu kalibrátorů dvojkovým ředěním (geometrická řada), spotřeba každého kalibrátoru do reakce bude 200 μl - pipetuje se 100ul kalibrátoru na jamku,j amky jsou v dubletech) počítejte tak, abyste měli v každé zkumavce minimálně 200 +50 μl rezervní objem) Jak provedete první ředění daného kalibrátoru abyste získali koncentraci 1000pg/ml? Ze základního roztoku budeme pipetovat 25ul a dám je do 475ul ředícího roztoku: Ve 25ul je 500pg (v 1000ul je 20 pg), tj pokud máme 500ug v 500ul, pak je koncentrace tohoto roztoku1000pg/1000ul, tj. 1000pg/ml.