Cvičení č. 1 Úvod Biologický materiál Protilátky RNDr. Jana Nechvátalová, Ph.D. Mgr. Julie Štíchová ÚKIA Ústav Klinické Imunologie a Alergologie Alergologická ambulance Alergická onemocnění Imunologická ambulance Autoimunity, imunodeficience Laboratoř Buněčná část Serologická část Rozdělení imunologických laboratorních metod Buněčná laboratoř Soustředí se na leukocyty ➢Absolutní a relativní počty ➢Funkční vlastnosti Serologická laboratoř Stanovení proteinů v séru ➢Autoprotilátky ➢Imunoglobuliny ➢Proteiny akutní fáze ➢Komplement ➢Specifické IgE a další … Laboratorní vyšetření • Fáze preanalytická • Mimolaboratorní – příprava pacienta, odběr, žádanka, transport • Laboratorní – příjem materiálu, centrifugace, vytvoření alikvotů se štítky • Fáze analytická • Vlastní laboratorní vyšetření, kalibrace metody + kontroly, dokonalý technický stav přístrojů • Fáze postanalytická • Laboratorní – skladování vzorku, zisk výsledků → vydání nálezu • Mimolaboratorní – účelné využití výsledků k diagnostice/léčbě Biologický materiál • Žilní krev – uzavřené odběrové systémy • Méně často BAL (bronchoalveolární laváž) • Každý biologický materiál doprovází žádanka • Svoz: • V rámci nemocnice – ruční donáška • Externí materiál – svoz autem (2krát za den) Biologický materiál Plazma • Z nesrážlivé krve • EDTA – vyvazuje Ca2+ • Heparin – anti IIa/Xa aktivita Sérum • Ze srážlivé krve • Zkumavky s gelem – akcelerace koagulace • Sérum neobsahuje koagulační faktory a fibrinogen Biologický materiál EDTA HEPARIN SERUM-GEL Vyšetření lymfocytárních subpopulací Funkční testy leukocytů Buněčná laboratoř Serologická laboratoř Vyšetření z PLNÉ KRVE nebo separovaných bb. Příjmová laboratoř - sanitáři • Příprava séra – centrifugace (2000 otáček/min, 10 min) • Příprava alikvotů pro metody → štítky • Kontrola, zda je objem séra dostatečný pro všechny požadované metody • Speciální metody – zamrazení sér Struktura protilátky (IgG) • 2 těžké (H) + 2 lehké řetězce (L) • Spojení – kovalentní disulfidickými můstky • Pantová oblast - flexibilita • L řetězec – 1 variabilní + 1 konstantní oblast • H řetězec – 1 variabilní + 3-4 konstantní oblasti • 2 Fab fragmenty – variabilní oblasti – vazba antigenu • 1 Fc fragment – efektorová funkce Protilátky Chemické složení: glykoproteiny Význam pro obratlovce: • Humorální složka adaptivní imunity • Ochrana před extracelulárními patogeny • Neutralizace virů a toxinů • Odstraňování poškozených struktur Význam pro medicínu: • Reakce protilátky s antigenem je základem mnohých laboratorních testů • Biologická léčba Glykosylace Štěpení protilátek enzymy Třídy protilátek • 5 tříd – podle typu konstantní části těžkého řetězce • IgG - monomer • 4 podtřídy IgG1-IgG4 • IgA - monomer, dimer • 2 podřídy IgA1, IgA2 IgE - monomer IgD - monomer IgM - monomer, pentamer – při imunizaci se tvoří jako první https://www.frontiersin.org/journals/immunology/articles/10.3389/fimmu.2021.753294/full Imunoglobuliny aktivují imunitní systém: Neutralizace bakteriálních toxinů Protilátky různých tříd mají specifické funkce efektorové funkce určuje Fc fragment • IgG2 opsonizuje především polysacharidové antigeny (bakterie s polysacharid. pouzdry) • ADCC - buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách (ADCC) Protilátky různých tříd mají různý biologický poločas • Protilátky jsou v těle postupně metabolizovány • Ztráty jsou doplňovány tvorbou nových protilátek • Nejdéle v těle setrvává IgG – 21 dní • IgM a IgA - 6 dní • IgD – 3 dny • Nejrychleji se metabolizuje IgE - 2 dny Principy reakce antigen-protilátka • Antigen (Ag) • látka, kterou IS rozpoznává a reaguje na ni • po chemické stránce se jedná o proteiny, polypeptidy, polysacharidy nebo nukleoproteiny • imunogen (uplný antigen) - schopný vyvolat tvorbu protilátek • hapten (nekompletní antigen) - nízkomolekulární látka, která nemůže sama navodit tvorbu protilátek, ale specificky reaguje s produkty imunitní odpovědi, se označuje jako • všechny imunogeny jsou antigeny, ne všechny antigeny jsou imunogeny • konkrétní místo na jeho povrchu, kam se váže protilátka – EPITOP • Protilátka (Ab) • specifický produkt terminálních vývojových stádií B lymfocytů • místo, které reaguje s epitopem antigenu – PARATOP Vazba mezi Ag a Ab je reverzibilní • Slabé nevazebné interakce • Vazba se vyznačuje určitou rychlostí vzniku a rozpadu • Jejich poměr: Rovnovážná konstanta Kas - rozhoduje o efektivnosti/pevnosti vazby • Čím je Kas vyšší, tím je afinita protilátky k antigenu vyšší Afinita vs avidita protilátek • Afinita • síla interakce mezi 1 epitopem Ag a 1 paratopem Ab • Avidita • je dána vícenásobnou interakcí mezi multivalentním antigenem a protilátkou • IgG – 2 vazebná místa • Sekreční IgA – 4 vazebná místa • Pentamer IgM – až 10 míst Protilátky mohou být • Monoklonální • Produkty jediného klonu B lymfocytů • namířeny proti 1 epitopu jediného antigenu • Velmi vysoká specifita • Polyklonální • Namířeny proti více epitopům jednoho či více antigenů • Pokud byl při imunizaci použit 1 antigen – monospecifické antisérum • Pokud bylo při imunizaci použito antigenů více – polyspecifické antisérum Výroba polyklonálních protilátek Výroba polyklonálních protilátek 1. Výběr vhodného antigenu • Nutná vysoká čistota – přečištění chromatografie, ELFO 1. Zvýšení afinity antigenu k buňkám imunitního systému • Problém – solubilní antigeny špatně aktivují imunitní systém • ADJUVANCIA – zvyšují imunogennost a udržují antigen déle v těle • soli Al2O3 • Freudovo adjuvans – adsorpce antigenu na kapičky minerálního oleje (s/bez přídavku usmrcených mykobakterií) Výroba polyklonálních protilátek 3. Výběr vhodného zvířete • Fylogeneticky co nejvzdálenější druh vzhledem k povaze antigenu (některý živočišný druh není schopen odpovídat na určitý antigen) 4. Způsob aplikace – nejčastěji intradermálně, subkutánně • Antigen je vychytán ve spádových lymfatických uzlinách – maximální odpověď Výroba polyklonálních protilátek jedna dávka – primární odpověď (nízký titr protilátek) opakovaná dávka - rozmezí až několika měsíců (vysoký titr protilátek) Výroba polyklonálních protilátek 5. Sběr krve • Opakované odběry nižšího množství krve • Kompletní vykrvení zvířete - usmrcení 6. Zisk séra s obsahem protilátek (antisérum) 7. Přečištění protilátek a jejich kvantifikace • Nespecifické metody – izolace protilátek určité třídy • Precipitace síranem amonným, elektroforéza, ionexová nebo gelová chromatografie • Specifické metody – izolace protilátek vůči konkrétnímu antigenu • Afinitní chromatografie, imunoadsorpce Polyklonální protilátky - využití Nefelometrie • Reakce Ag-Ab → precipitace • Třídy a podtřídy Ig, C3, C4, CRP Léčba • Antiséra proti hadím jedům ELISA • Záchytné protilátky • Záchyt různých variant antigenu • Vyšší senzitivita než monoklonální Ab • Nižší specifita Výroba monoklonálních protilátek Výroba monoklonálních protilátek 1. Aplikace antigenu intravenózně 2. Antigeny jsou krví zaneseny do sleziny – zde je imunitní odpověď na antigen maximální 3. Ve slezině diferencují antigen specifické B lymfocyty do plazmatických buněk, které produkují protilátky - tento způsob podání antigenu umožňuje téměř okamžitý přístup antigenu k B lymfocytům, DC a makrofágům ve slezině Problém Izolované B-lymfocyty dlouho nepřežijí Jak tedy získat dostatek protilátek? Výroba monoklonálních protilátek 5. Izolace plazmatických buněk ze sleziny 4. Po několika týdnech je z imunizované myši vyjmuta slezina Výroba monoklonálních protilátek • 1975 – Kohler a Milstein – fúze s myšími myelomovými buňkami • Produkuje Ag specifické protilátky • Velmi krátká životnost • Neprodukuje protilátky • Je nesmrtelná Slezinná plazmatická buňka Myelomová buňka 6.Fůze buněk polyethylenglykolem (PEG) Výroba monoklonálních protilátek Nezfúzované B lymfocyty a myelomové buňky Zfúzované B lymfocyty Zfúzované myelomové buňky HYBRIDOM HAT médium 7. Buněčná směs je kultivována v selekčním HAT médiu (Hypoxantin, Aminopterin, Thymin) Selekce – enzymatický blok Pro syntézu DNA a buněčné dělení je důležitá a klíčová syntéza nukleotidů. V každém typu buňky existují dvě cesty pro syntézu nukleotidů: cesta de novo a cesta záchrany inhibice reakcí, jež jsou součástí syntézy nukleotidů HGPRT = Hypoxantin Guanin FosfoRibosyl Transferáza hypoxantin a thymidin využijí buňky, aby se vyhnuly blokované cestě; musí mít ovšem vhodné enzymy („záchranná cesta“) „De novo“ recyklují se existující komponenty nukleotidy syntetizovány z jednoduchých prekurzorů Selekce – enzymatický blok Výroba monoklonálních protilátek 8. Hybridomy jsou rozděleny do jednotlivých jamek 9. Dále se udržují pouze ty buňky, které produkují Ab proti požadovanému epitopu 10. Přečištění, kvantifikace, validace Využití monoklonálních protilátek • Konjugace monoklonálních protilátek s fluorochromy • Základní reagencie pro imunofenotypizaci IMUNOFENOTYPIZACE „stanovení fenotypu buněk na základě imunologické detekce jejich povrchových znaků (markerů) pomocí průtokové cytometrie“ • CD nomenklatura → CD znaky na buňkách • Některé jsou pro určité typy buněk vysoce specifické • Detekce pomocí fluorescenčně značených protilátek Využití monoklonálních protilátek Příklady využití konjugátů protilátka-fluorochrom jako diagnostik v laboratoři: • Rozlišení T a B lymfocytárních subpopulací • Rozlišení klidových a aktivovaných forem leukocytů • Rozlišení časné/pozdní aktivace buněk • Rozlišení vývojových stádií buněk • Proliferace • Apoptóza • Imunofenotypizace malignit Využití monoklonálních protilátek Monoklonální protilátky neznačené jako stimulancia buněk: Příklad: • Anti CD3/CD28 – váže se na CD3 ko-receptor T lymfocytů a aktivuje je → • Produkce cytokinů – INF-γ, IL-2 • Proliferace Využití monoklonálních protilátek • Monoklonální protilátky jako léčiva: BIOLOGICKÁ LÉČBA • Různé druhy protilátek: • Myší (omab) • Chimérické (ximab) • Humanizované (zumab) • Lidské (umab) Využití monoklonálních protilátek • Imunosuprese • Anti CD20 (Rituximab): B lymfocytární malignity • Blokáda prozánětlivých cytokinů • Anti TNF-α (Infliximab): léčba Crohnovy choroby, revmatoidní artritidy • Blokáda adhezivních molekul • Anti CD11a (Efalizumab): léčba lupénky • Protialergická léčba • Anti-IgE (Omalizumab): léčba těžkých forem astmatu Využití monoklonálních protilátek • Nová generace monoklonálních protilátek určených k biologické léčbě: konjugace s cytostatiky/radionuklidy • Zesílení cytotoxického účinku na maligní buňky Shrnutí Polyklonální protilátky Monoklonální protilátky Snadnější výroba Náročná výroba Relativně levné Drahé Vyšší senzitivita Nižší senzitivita Nižší specifita Vysoká specifita Vyšší pravděpodobnost zkřížené reaktivity Nízká pravděpodobnost zkřížené reaktivity Protokol • Hlavička: • Jméno • Datum • Úloha č. … • Název úlohy • Protokol: • Princip • Pomůcky • Postup • Výsledky • Závěr • Zpracování na PC nebo ručně • Tisk → odevzdání při dalším cvičení