Základy klinických laboratorních oborů, které se uplatňují v diagnostice humánních chorob - jejich společná báze: ISO15189 prof. MUDr. Dalibor Valík, Ph.D., Katedra laboratorních metod LF MU Farmakologický ústav LF MU …o které obory jde? •klinická chemie/biochemie/toxikologie •hematologie, hemostáza/hemokoagulační poruchy a transfusní medicína •imunologie a imunopatologie •lékařská mikrobiologie •patologie, molekulární patologie a molekulární diagnostika • •…tradičně se uvádí, že cca 60-70% diagnostických rozhodnutí se odvíjí od laboratorních výsledků při cca 5% nákladem na laboratoře (Forsman, Clin.Chem. 1996) •molekulární diagnostika, 1986, 1987 •…zásadní byl objev PCR, popsán v r. 1971, ale realizoval jej až Kary Mullis 1983 (dostal Nobelovu cenu) • •v současnosti jsou zejména patrné tendence k agregaci laboratoří, automatizaci, vč preanalytických procesů, postanalytické fáze • •co mají laboratoře ale společné: požadavky na obecnou bezpečnost a kvalitu, řídí se normou ISO15189 základní pojmy pro metriku/metrologii laboratorních vyšetření • •jednotky, resp. rozměr veličiny, která je výsledkem laboratorního testu • •referenční meze, koncept normální Gaussovy distribuce, parametrické a neparametrické rozložení jednotky a veličiny •rozlišujme: kvalitativní, semikvantitativní a kvantitativní vyšetření • •kvalitativní = binární výsledek: pozitivní, negativní, teplo/zima, v medicíně také ale…bolí/nebolí • •semikvantitativní = výsledek na hrubé škále, kupř. čtyřelementové: 0_+_++_+++, apod., • •kvantitativní výsledek: vždy vztažen k veličině, resp. kvantitě kalibrantu užitého k ustanovení vztahu signál/koncentrace (tj. kalibraci) • • …malý historický exkurs: výborně zpracováno v: BLAHOVÁ, Kristýna. Vývoj měr a vah v českých zemích: bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita, Fakulta pedagogická, Katedra fyziky, chemie a odborného vzdělávání, 2020. Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Lukáš Pawera. •Blahová K: “…císař Ferdinand III. vydal reskript ke sjednocení jednotek v Brně a Olomouci, zavedl předchůdce katastru” • •…..metrické jednotky: Francie v období po Velké francouzské revoluci •…..imperiální jednotky Britského impéria a USA • •,…i dnes kombinace (např. krevní tlak, kde se kPa neujaly ani v Evropě), britská/standardní míle, námořní míle, “uzly” pro vyjádření rychlosti v námořnictví, v lab. kupř: “psi” jako jednotka tlaku - HPLC o jaké jednotky jde – SI , a ty ostatní… • •u nás v ČR: vyhláška 264/2000 o základních měřicích jednotkách, atd… • •…snaha u SI jednotek versus jednotky “ostatní”, angloamerické,… •…jednotky odvozené od “definitivní” metody, třeba gravimetrie (kg), jednotky záření, •metody jsou: definitivní, referenční, terénní (field) • •jednotky “relativní”, konvenční, konsensuální (kupř. proteinové standardy WHO) • biologická variabilita - zdroje •věková škála, 0 – 100 • •pohlaví jedince, •pracujeme s binárním pohlavím mimo skutečnost diagnostikovaných chromozomálních odchylek (XX, XY, varianty) • •genetický fundament jedince • •interakce genetika<>vývoj<>prostředí/environment • •chronobiologie (biologické rytmy i) časové, ii kontextuální, např. fysiologický mestruační cyklus) • zvláštnosti a specifika věkových období člověka • •škála života člověka je cca 1- 100 let • •růstovým a vývojovým obdobím je zejména dětský věk (pediatrická medicína), dospělý věk, následné presenium/senium, tj stáří • •příklady: bilirubin neonatální vs dospělý, naproti tomu monoklonální gamapatie pohlaví jedince, •…pracujeme s binárním pohlavím mimo skutečnost diagnostikovaných chromozomálních odchylek (XX, XY, varianty) • •diverzifikace a diference začínají být patrny v době puberty • •kromě zjevných změn většinou endokrinologických se tyto změny také promítnou do některých laboratorních vyšetření (svalová hmota - kreatinin, menstruační cyklus – RBC,železo genetický základ jedince •studiem se zabývá lékařská genetika s řadou subspecializací •je popsána celá řada genetických poruch a abnormalit (McKusick catalogue: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2686440/) • •u některých je možnost tzv. screeningu, tj. procesu, kdy vzorek pacienta/novorozence je předmětem laboratorního vyšetření za účelem zjištění přítomnosti jedné ze screenovaných chorob • •u nás v ČR zejména ÚDMP VFN Praha (https://udmp.lf1.cuni.cz/file/6111/metabolicka-prirucka-2020.pdf) •FN Brno – screening CF a endokrinopatie, dnes i program pro SMA,SCID a CF • interakce genetika<>vývoj<>prostředí/environment •řada stavů spojených s tzv. náchylností na/k nějakému stavu….snížené tolerance některých potravin, léčiv • •vědním obory jsou •farmako/genetika/genomika •ekotoxikologie, ekogenetika • • chronobiologie (biologické rytmy: i) časové, ii kontextuální, např. fysiologický mestruační cyklus) •základní dělení je: cirkadiánní, infradiánní, ultradiánní ve vztahu ke dni • • • • • • •existují delší cykly ve vztahu k fázi měsíce, roku, resp. ročnímu období, rytmus cirkannuální(https://www.google.com/search?source=univ&tbm=isch&q=chronobiologie) • • • • • • • …a zpět k jednotkám a referenčním intervalům •pojem “normalita” je vztažen ke statistické distribuci (Gaussovo normální rozložení) •od něj je odvozen tradiční koncept “normálních” hodnot (+- 1,96 SD,) • •v praxi spíše neparametrická rozložení, vyjadřuje se percentily (centil, decil, kvartil, medián je střední hodnota 50. percentilu, modus je hodnotou nejčetnější Charakteristiky variability •Směrodatná odchylka (popř. rozptyl) •Ukazuje jak se každá jednotlivá hodnota liší od průměru •Variační koeficient •Relativní míra variability vztažená k průměru •Rozpětí •Vzdálenost mezi největší a nejmenší hodnotou •Mezikvartilové rozpětí •Rozpětí 50 % prostředních hodnot Když jsem v roce 1859 prohlásil, že evoluce postupuje nahromaděním nepatrných rozdílů mezi jedinci, uvedl jsem do biologického myšlení představu nepřetržité variability. Charles Darwin Zlatý řez Možnost úmyslně klamat lidi, tím že si někdo vybere charakteristiku, která nejlépe poslouží jeho zájmům. Medián není ovlivněn extrémními hodnotami. Jediný způsob jak pracovat s průměrnou hodnotou je uvažovat variabilitu kolem průměru-dobereme se reálnějším výsledkům Přesnost, preciznost, pravdivost uPravdivost = Těsnost shody mezi průměrem opakovaných naměřených hodnot a referenční hodnotou uPreciznost = Těsnost shody mezi opakovanými naměřenými hodnotami na stejném objektu uPřesnost = pravdivost + preciznost https://lh4.googleusercontent.com/rdEUScDE0xnHHSgQcTYV9Xx_t3joQmwwIL7SCb1wFpSOE7vLiWW76snXCQnI_l2Ft acSakfpW60bRqi3t8IJFayEqYFeoQ2z5hMQES-fU9c70W5HQ1atwQe_O79q8p7B Referenční hodnota Referenční hodnota Normální rozdělení •Modeluje náhodné děje vyskytující se v přírodě či společnosti •Přesně řídí jen málo veličin, ale jeho význam spočívá v tom, že za určitých podmínek dobře aproximuje řadu jiných pravděpodobnostních rozdělení •Symetrické rozdělení, které je charakterizováno střední hodnotou (průměrem) a směrodatnou odchylkou Norma může označovat něco obvyklého nebo typického, avšak normou označujeme i velmi mocná etická omezení. V souvislosti s normálním rozdělením jsou často zmiňovány náhodné chyby, např. chyby měření, způsobené velkým počtem neznámých a vzájemně nezávislých příčin. Proto bývá normální rozdělení také označováno jako zákon chyb. Podle tohoto zákona se také řídí rozdělení některých fyzikálních a technických veličin.^[1] Normální rozdělení •Je základem velkého množství statistických testů •Referenční rozmezí •„Zákon chyb“ Norma může označovat něco obvyklého nebo typického, avšak normou označujeme i velmi mocná etická omezení. V souvislosti s normálním rozdělením jsou často zmiňovány náhodné chyby, např. chyby měření, způsobené velkým počtem neznámých a vzájemně nezávislých příčin. Proto bývá normální rozdělení také označováno jako zákon chyb. Podle tohoto zákona se také řídí rozdělení některých fyzikálních a technických veličin.^[1] Měření – odhad skutečné hodnoty Vychýlení měření C:\Users\xselinge\OneDrive pro firmy\upravovano\Laboratorní diagnostika v onkologii 2016\obr\bias.png Proč uvádět výsledek měření včetně nejistoty? Referenční hodnota Cut-off Oblast negativity Oblast pozitivity Proč uvádět výsledek měření včetně nejistoty? Referenční hodnota Cut-off Oblast negativity Oblast pozitivity Referenční rozmezí Referenční populace •=množina všech jedinců splňujících určité předpoklady, týkající se jejich zdravotního stavu, případně další definované požadavky (věk, pohlaví, rasa) •Zdraví jedinci či jedinci, kteří nemají chorobu ovlivňující příslušný laboratorní ukazatel •Volba požadavků na referenční jedince, je poměrně problematická záležitost a může zásadně ovlivnit výsledné hodnoty referenčních mezí a jejich interpretaci •Jedinci s chorobou nejsou uvažování! Metody určení referenčního rozmezí •Přímý × nepřímý způsob •Parametrický přístup × neparametrický přístup Průměr Směrodatná odchylka Výběrové populace Normální rozdělení 1. 2. 3. nejmenší 118. 119. 120. největší 2,5 % 2,5 % 2,5 % 2,5 % 5 % zdravých jedinců bude mít hodnotu parametru mimo referenční rozmezí To že hodnota vyšla mimo referenční rozmezí ještě nemusí znamenat onemocnění jedince, ale pouze že tento výsledek je u referenční populace méně pravděpodobný, což je také jeden z argumentů pro používání RR. Než se ale shrnu výhody a nevýhody použití RR, řekněme si ještě něco k biologické variabilitě. Nepřímá metoda – na základě dat z rutinního provozu laboratoře. Biologická variabilita •Intraindividuální variabilita •Rozptyl hodnot jednoho jedince •Interindividuální variabilita •Rozptyl hodnot mezi jedinci Čím nižší je II, tím méně vhodné je použití referenčního rozmezí a lepší je sledovat hodnotu v čase. II=0,6 II=1,4 Rozložení II u 92 běžných laboratorních parametrů II je zjednodušeně při zanedbatelné analytické variabilitě daný podílem… obezřetní Co je třeba uvážit při použití Referenčního rozmezí •Odhad referenčních mezí je konstruován bodově, ale pro každou mez je možné konstruovat interval spolehlivosti •Každé měření má svou nejistotu DRM HRM Musíme pečlivě (citlivě) zacházet s hodnotami ležícími v blízkosti referenčních mezích bez ohledu na to, zda uvnitř nebo vně. může existovat nenulová pravděpodobnost, že výsledek měření může být reálně na opačné straně skutečné referenční meze. Co je třeba uvážit při použití Referenčního rozmezí •5 % zdravých jedinců má hodnoty mimo referenční meze •Nerespektují individualitu •S rostoucím počtem testů stoupá pravděpodobnost patologického nálezu • Počet testů Pravděpodobnost výsledku mimo RR pro zdravou populaci 1 5 % 2 (1-0,952)×100= 10 % 5 (1-0,955)×100= 23 % 10 (1-0,9510)×100=40 % 20 (1-0,9520)×100=64 % Platí pro nezávislé testy, pro korelované je tato pravděpodobnost nižší Musíme pečlivě (citlivě) zacházet s hodnotami ležícími v blízkosti referenčních mezích Co je třeba uvážit při použití Referenčního rozmezí •Požadavky na referenční populaci (rasa, pohlaví,…) •Výsledek mimo referenční meze(abnormalita) může upozornit na patologický stav •je třeba kombinace s jinými statistickými nástroji Existuje více námitek proti než pro. Často jsou však jediným vodítkem, jak interpretovat výsledek. Rozhodovací mez •=Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti • DRM HRM Zdraví Nemocní Pozitivní Negativní Cut-off Vysoké hodnoty jsou patologické Rozhodovací mez •=Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti • DRM HRM Zdraví Nemocní Pozitivní Negativní Cut-off SN SP FP FN Rozhodovací mez •=Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti • DRM HRM Zdraví Nemocní Pozitivní Negativní Cut-off SN SP FP FN Rozhodovací mez •=Hodnota výsledku laboratorního testu, podle které se rozliší jedinci s přítomností choroby od jedinců bez její přítomnosti • DRM HRM Zdraví Nemocní Pozitivní Negativní Cut-off SN SP FP FN ROC křivka http://www.medcalc.org/manual/_help/images/roc_intro3.png Podíl falešně pozitivních (100-specificita) Shrnutí •Referenční rozmezí •Pouze zdravá populace •Překročení signalizuje abnormalitu •Mají svou nejistotu •Zdravý jedinec bude mít výsledek mimo referenční meze s pravděpodobností 5 % • •Cut-off •Populace s chorobou i bez •Překročení je spojeno s lékařskou akcí •Bodový pojem •Zdravý jedinec přesáhne cut-off s pravděpodobností (100-specificita) % Na základě těchto charakteristik můžeme mezi sebou porovnávat účinnost biochemických metod z hlediska schopnosti metody rozlišit zdravé a nemocné profil absolventa, alias - co bychom rádi, aby z vás bylo? •stručný, indikativní profil absolventa: • •vzdělaný, komunikativní, zvídavý se zájmem o práci v klinické laboratoři v relevantních odbornostech s vědomím zásadní důležitosti laboratoře v diagnostickém procesu • •kompatibilní se způsobem práce v klinické laboratoři (bezpečnostní standardy apod., normy jako ISO15089) adherence ke správné laboratorní praxi, s profesionálním respektem ke zkušenějším kolegům, respektování etických aspektů chování • •součástí je ochota se vzdělávat v průběhu své profesionální kariéry (semináře, seznamování se s novinkami, kvalifikační rozvoj dle možností) ,…děkuji za pozornost • •statistická část: • •RNDr. Bc. Iveta Selingerová, Ph.D., MOÚ, FÚ LF MU • • •