Jana Kotašková Sekce nádorové genomiky a lymfoproliferativních onemocnění Centrum molekulární biologie a genetiky Interní hematologická a onkologická klinika Fakultní nemocnice Brno 29. 4. 2024 Maligní lymfocyty - jak je rozpoznat, charakterizovat a sledovat pomocí metod molekulární biologie Krvetvorba (převzato a upraveno; Krvetvorba (histologie) – WikiSkripta, 2021) 5th WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues (2022) Allagio et al. 2021 Vývoj B lymfocytu B lymfocyty v „germinálním centru“ lymfatické uzliny Přestavby genů pro imunoglobulin Repertoár IG genů – biologická ochrana – 2*1012 možností – IGH – těžký řetězec, gen na chr. 14 – IGL – lehký řetězec, geny na chr. 2 a 22 – kappa a lambda lehké řetězce – přestavby v kostní dřeni – somatické hypermutace v germinálním centru Materiál pro diagnostiku hematoonkologických onemocnění • Periferní krev • Kostní dřeň • Uzlina • Likvor • Výpotky • Nádorové tkáně Klonalita IG – základní diagnostické vyšetření 0 50000 100000 150000 200000 250000 150 200 250 300 350 400 450 500 224.B 12_10010510I0 Size (nt) DyeSignal 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 55000 60000 65000 70000 200 250 300 350 400 450 500 9 8 9 .C 1 2 _ 1 0 0 1 0 5 1 0 H Z Size (nt) DyeSignal Klonální vs. polyklonální nález Poměr kappa/lambda – fyziologicky kolem 2:1 Průtoková cytometrie Imunohistochemicky Identifikace přestavby IG – zhodnocení klonality lehkých i těžkých řetězců – sekvenace přestavby – možnost sledování klonu u pacientů po terapii pomocí citlivých metod (qPCR) – IGH: Stanovení % somatických hypermutací (SHM) u CLL Vznik aberací u lymfocytů Somatické hypermutace – Mutace v genech mimo IG Izotypový přesmyk – Vznik translokací Translokace se vznikem fúzního genu FISH – Speciální „break apart“ sondy Detekce transkriptu – analýza RNA – cíl pro sledování MRD Translokace vedoucí k aberantní genové expresi FISH Detekce translokace – DNA – Různé varianty PCR – NGS – Cíl pro sledování MRD Gruber and Wu. doi:10.1053/j.seminhematol.2014.05.004 Rekurentně mutované geny u lymfoproliferací MCL – mantle cell lymphoma FL – follicular lymphoma BL - Burkitt lymphoma DLBCL – diffuse large B cell lymphoma SMZL – splenic marginal zone lymphoma CLL – chronic lymphocytic leukemia WM – Waldenström macroglobulinemia MM – multiple myeloma Celý genom – WGS (whole genome sequencing) Exom – WES (whole exome sequencing) Jednotlivé geny nebo oblasti 3 200 000 000 bp 30 x pokrytí 20 000 genů 100 x pokrytí < 100 genů ≥ 1000 x pokrytí Nádorová genomika LYNX • NGS panel cílený na lymfoproliferace • „capture“ přístup • Genomická „backbone“ • Detekce SNV, CNA, translokací a IG/TR v jednom kroku Cinta Hierro, Ignacio Matos, Juan MartinLiberal, Maria Ochoa de Olza and Elena Garralda Clin Cancer Res June 1 2019 (25) (11) 3210-3219; DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-18- 3694 Agnostický přístup v léčbě nádorů Nový koncept v přístupu k terapii nádorů • Multiomics přístupy jsou klíčové • NGS je základní metoda Workflow NGS analýzy u mnohočetného myelomu AGTAATATGCCT ACCAATATAACT AG-ACCATATG-CT mutace, inzerce, delece 67 genů chromosomové abnormality Izolace DNA KD (0,1 - 92 % PC) Magnetická separace PC pomocí CD138+ (výsledná čistota 72 – 99 % PC) Biopsie translokace IG přestavby NGS panel LYNX TP53 c.833C>G p.Pro278Arg VAF 94 % Detail delece genu TP53 na chr. 17 Bialelická inaktivace TP53 Problém na druhé alele - pomocí sekvenování lze pouze odhadnout (VAF > 50 %) • delece druhé alely – FISH ověří • monosomie – FISH ověří • cnLOH (ztráta heterozygotnosti) – SNP analýza TP53 c.833C>G p.Pro278Arg VAF 94 % Detail delece genu TP53 na chr. 17 Walker B. A., et al. 2019 Bialelická inaktivace TP53 Pacientka s mnohočetným melomem • žena, ročník 68, dg v 2021, 53 let • 40 % klonálních plasmocytů v kostní dřeni • vyšetření ze separovaných plazmocytů (92 %) FISH ze separovaných CD138+ buněk – čistota 92 % IGH/ TP53/CEP17: nalezeno 97 % jader s delecí gen TP53 1p32/1q21: nalezena 4 % jader se třemi signály pro oblast 1q21 IGH/ 13q14: normální nález Analýza CNA (copy number alterations): chromosomy 1 – 22, X,Y zisk ztráta t(12;14) Detekce translokací pomocí NGS Disrupce jedné alely CCND2 (posun místa zlomu) a delece druhé alely CCND2 (?) Delece na Chr. 12 Volná DNA mimobuněčná nukleová kyselina – cfDNA (cell-free DNA) – přítomná ve všech tělních tekutinách – různé zdroje – odpadní vs. cíleně uvolňovaná – poprvé detekována v roce 1948 (Mandel, P., and Metais, P. (1948). Nuclear acids in human blood plasma. C R. Seances Soc. Biol. Fil. 142, 241–243) – poprvé ve spojitosti s nádory v roce 1977 (Leon SA, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 1977 Mar;37(3):646-50.) – nejčastěji detekovaná v krevní plazmě – krátký poločas života 15 min. - 2,5 h – u zdravých lidí v malém množství (1 -10ng/ml plazmy) – typická délka fragmentů – 166 bp – cfDNA z nádorů je kratší cfDNA a její vlastnosti Digitální PCR (dPCR) – rychlá metoda – citlivost 0,1 % – relativně levná – minimální nároky na materiál – omezené množství testovaných cílů Jak můžeme cfDNA v CMBG analyzovat? Digitální NGS – odezva 2-6 týdnů – citlivost 3 – 5 % – o řád dražší než dPCR – lze testovat od 30 ng – detekuje SNV/CNA i translokace v jednom – komplexní výsledek • jedno měření je rozděleno do tisíců nezávislých měření Digitální PCR Detekce minoritního cíle – absolutní kvantifikace • 20 reakcí • 10 pozitivních porcí • cíl v 1 z 10 – 10 % zastoupení Citlivost dPCR závisí na množství objemů a jejich obsazenosti 1 % QIAcuity • cdPCR (chip-based/chambre-based digital PCR) • destička se systémem kanálků • integrovaný termocycler • integrovaný detektor • multiplex – 5 barev • vyhodnocovací SW Distribuce vzorku a vznik oddělených reakčních objemů v desce cdPCR – chip-based digital PCR (QIAcuity/QIAGEN) diskriminační esej digitální: 0 nebo 1 Jak využíváme cdPCR • sledování tzv. hot spot variant, citlivost až 0,1 % • KIT D816V u systémové mastocytózy • MYD88 L265P u WM – vzorky s nízkou infiltrací • MYD88 L265P u primárních lymfomů CNS v likvoru (přítomna až u 80 % pts) detekce KIT D816V v KD pacienta se SM MYD88 L265P v likvoru mut wt neobsazené mut wt NGS • možnost detekce více cílů zvyšuje citlivost eseje • amplikonový přístup (amplifikace cílových oblastí pomocí primerů) nebo • „capture“ přístup – komplementární sondy ALE • princip NGS je sekvenace syntézou • chyby polymeráz tvoří 1 - 3 % pozadí SNV • každý sekvenátor generuje specifické chyby Amplifikace DNA fragmentů digitální NGS • značení fragmentů DNA před jejich amplifikací • UMI – unique molecular identifier • UMI identifikuje „ready“ vzniklé kopírováním stejného fragmentu Modelový případ – pacient s HGBL s progresí do CNS • NGS celkových WBC z KD při dg • NGS volné DNA z likvoru při progresi do CNS • NGS DNA z buněk sedimentu z likvoru Stanovení klonality IG/TR – abnormální kumulace lymfocytů nesoucích jednu konkrétní přestavbu Identifikace přestavby IG/TR – možnost sledování klonu u pacientů po terapii pomocí citlivých metod – IGH: Stanovení % somatických hypermutací (SHM) u CLL Detekce translokací a fúzních genů – lymfomy: MCL t(11;14), FL t(14;18), BL t(8;14) – fúzní geny u ALL – sledování zbytkové choroby Analýza rekurentně mutovaných genů – TP53 – negativní prognostický a prediktivní marker – MYD88 – primární CNS lymfomy, WM, MZL – BRAF - HCL Komplexní analýza pomocí NGS panelu – diagnóza, prognóza Komplexní přístup k vyšetřování Přehled a význam prováděných vyšetření u lymfoproliferací 0 50000 100000 150000 200000 250000 150 200 250 300 350 400 450 500 224.B 12_10010510I0 Size (nt) DyeSignal 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 55000 60000 65000 70000 200 250 300 350 400 450 500 989 .C 12 _1001 0510 H Z Size (nt) DyeSignal Klonální vs. polyklonální nález Sledování zbytkové choroby (MRD) v terapii SHM u CLL a OS Mutace vedoucí k rezistenci Mutace v genu TP53 Diagnostika integrující  propojování informací z hematologie, průtokové cytometrie, patologie, cytogenetiky a genetiky Diagnostika šitá na míru  výběr relevantních markerů a metod jejich detekce Identifikace privátních aberací jedinečných pro daného pacienta  přestavba IG/TR  sledování zbytkové choroby Zpracování biologického materiálu podle potřeb vyšetření  separace nádorových buněk  paralelní vyšetření různých materiálů Personalizovaná medicína u lymfoproliferací v praxi Shyr, D., Liu, Q. doi.org/10.1186/1480-9222-15-4 Snad už brzy….. Cílem detailní a personalizované diagnostiky  přesná klasifikace  stanovení prognózy  volba léčebné strategie  sledování odpovědi na léčbu  prevence relapsu Jana Kotašková Sekce nádorové genomiky a lymfoproliferativních onemocnění Centrum molekulární biologie a genetiky Interní hematologická a onkologická klinika Fakultní nemocnice Brno 29. 4. 2024 Děkuji za pozornost