Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 6: Testování citlivosti na antibiotika Než začneme n Z praktických důvodů se antibiotik týkají dvě přednášky. Zatímco tato přednáška se týká více testování citlivosti, přednáška na konci letního semestru se bude týkat spíše antibiotické politiky, práce antibiotických středisek a podobně n Naučit se názvy aspoň hlavních antibiotik a jejich charakteristiku bude spíše na vaše samostudium, na tom totiž není co vysvětlovat a zvládnete to i sami. Postavení v systému metod n CÍL 1: ODHALIT PATOGENA n Přímé metody (mikrob – část – produkt): n Mikroskopie – průkaz ve vzorku i id. n Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace n Biochemická identifikace – jen identifikace! n Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. n Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku n Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku n Nepřímé metody (protilátky) n CÍL 2: ZJISTIT CITLIVOST PATOGENA NA ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY U kterých mikrobů se provádí? n U virů se zatím neprovádí, i když u některých se léčí antivirotiky. Testování citlivosti na antivirotika je zatím v experimentální fázi. n U bakterií se provádí nejběžněji, i když jen u těch, které lze kultivovat (potřebujeme KMEN) n Z hub se provádí jen u kvasinek, u vláknitých hub testovat citlivost na antimykotika nelze n U parazitů se citlivost na antiparazitární látky netestuje Možnosti „boje“ s mikroby n Imunizace – využívá přirozených mechanismů makroorganismu n Dekontaminační metody – hrubé fyzikální a chemické vlivy, působení vně organismu n Antimikrobiální látky – jemné, cílené působení uvnitř organismu s cílem maximálního zásahu mikroba a minimálního vlivu na makroorganismus Ještě dekontaminace, nebo už antimikrobiální látka? n Hranice mezi dekontaminačními metodami a antimikrobiálními látkami je neostrá. n Zpravidla se za dekontaminaci ještě považuje působení na neporušenou kůži. n Aplikace do rány už znamená užití antimikrobiální látky (antiseptika) n Důsledky i legislativní: dekontaminační prostředky schvaluje hlavní hygienik, antimikrobiální látky stejně jako ostatní léky SÚKL Druhy antimikrobiálních látek n Látky působící celkově: n Antiparazitární látky proti parazitům n Antimykotika proti kvasinkám a vláknitým houbám n Antivirotika proti virům n Antituberkulotika proti mykobakteriím n Antibiotika proti bakteriím (přírodního původu) n Antibakteriální chemoterapeutika také proti bakteriím, ale syntetická V poslední době se stírají rozdíly mezi posledními dvěma n Látky působící lokálně: antiseptika Působení určitých vlivů na mikroby I n Při působení vlivu jako je pH má osa působení horní i dolní extrém Působení vlivů na mikroby II n Při dekontaminaci trváme na usmrcení mikrobů (mikrobicidní efekt) n Při užití antimikrobiálních látek můžeme počítat se spoluprací pacientovy imunity, proto obvykle stačí i mikrobistatický (inhibiční) účinek n Toto však neplatí u akutních stavů či imunokompromitovaných pacientů, kde se snažíme o mikrobicidní působení vždy MIC, MBC, MBEC MIC – minimální inhibiční koncentrace je pojem, který se u antibiotik používá pro označení meze růstu (množení) mikroba MBC – minimální baktericidní koncentrace se používá pro mez přežití bakterie. U virů by se použil pojem „minimální virucidní“ a podobně. MBIC, MBEC – minimální biofilm inhibující/eradikující koncentrace, nové pojmy reflektující růst bakterií ve formě biofilmu Primárně baktericidní a primárně bakteriostatická atb Primárně baktericidní jsou atb, kde MIC a MBC jsou si téměř rovny Primárně bakteriostatická jsou atb, u kterých se využívá hodnoty nad MIC, ale nikoli nad MBC Více k používání baktericidních a bakteriostatických antibiotik si povíme v.přednášce v letním semestru Primárně baktericidní a primárně bakteriostatická atb Mechanismy působení antibiotik n Na buněčnou stěnu (baktericidní) n Betalaktamová antibiotika n Glykopeptidová antibiotika (částečně) n Na cyt. membránu – polypeptidy (baktericidní) n Na nukleovou kyselinu – chinolony (baktericid.) n Na proteosyntézu: aminoglykosidy (baktericidní); makrolidy, tetracykliny, linkosamidy, amfenikoly (bakteriostatické) n Na metabolismus – sulfonamidy, bakteriostatické Betalaktamová antibiotika n Působení na buněčnou stěnu n Jsou baktericidní, působí však jen na rostoucí bakterie, které si budují stěnu n Jsou téměř netoxické (lidské buňky stěnu nemají), ale mohou alergizovat n Patří sem: n Peniciliny n Cefalosporiny n Monobaktamy n Karbapenemy Penicilinová antibiotika n Klasický „Flemingův penicilin“ je stále dobrý např. na angíny. Existuje injekční (G-penicilin) a tabletová (V-penicilin) forma n Oxacilin – na stafylokoky n Ampicilin a amoxicilin – na některé enterobakterie, enterokoky a další mikroby n Další rozšíření spektra: piperacilin, tikarcilin apod. n Peniciliny potencované inhibitory betalaktamáz (viz dále): amoxicilin + kyselina klavulanová, ampicilin + sulbaktam Inhibitory betalaktamáz n Jak působí inhibitory betalakta- máz? Ukázky penicilinů Cefalosporiny n Příbuzné penicilinům, přesto nebývají zkřížené alergické reakce, i když je nutná opatrnost. n I. generace: na G+ bakterie, např. cefalexin n II. generace: více na enterobakterie, např. cefuroxim (ZINNAT, ZINACEF) n III. generace: i na některé rezistentní G- bakterie (ceftriaxon, cefotaxim) n IV. generace: cefepim (MAXIPIME), rezervní na velmi rezistentní mikroby Ukázky cefalosporinů „Nové betalaktamy“ n Monobaktamy – nejvýznamnějším zástupcem je aztreonam (AZACTAM). Neúčinkují na G+. n Karbapenemy – imipenem (TIENAM) a meropenem (MERONEM) – na pseudomonády a producenty betalaktmáz Glykopeptidová antibiotika n Působí také na syntézu buněčné stěny, nejsou však příbuzná s betalaktamy. Jsou jen na G+. n Používají se jako rezervní, např. u methicilin rezistentních stafylokoků (MRSA) n Patří sem vankomycin (EDICIN) a méně toxický, ale dražší teikoplanin (TARGOCID) Polypeptidová antibiotika n Působí na cytoplasmatickou membránu n Jsou vysoce toxická: ototoxická, nefrotoxická n Polymyxin B se používá jen lokálně (např. součást ušních kapek Otosporin) n Polymyxin E – kolistin se ve výjimečných případech užívá celkově n Působí i na nerostoucí bakterie n Rezistentní jsou všechny grampozitivní bakterie a všechny protey, providencie, morganelly a serratie Chinolonová chemoterapeutika I n Působí na nukleové kyseliny (inhibice gyrázy) n Od 2. generace jsou baktericidní n Nepodávat do 15 let (růstové chrupavky) n I. generace (kyselina oxolinová) a II. generace (norfloxacin – NOLICIN) jen pro močové infekce n Hodně používaná III. generace – ofloxacin (TARIVID), ciprofloxacin (CIPLOX), pefloxacin (ABAKTAL) – i pro systémové infekce Aminoglykosidy n Působí baktericidně v úvodu proteosyntézy n Jsou ototoxické a nefrotoxické n Synergie s betalaktamy – snížení toxicity n Streptomycin už jen antituberkulotikum. Užívá se gentamicin, netilmicin, amikacin n Neomycin s bacitracinem = framykoin (neomycin je příliš toxický, proto jen lokálně) Už ve starých dílech „Nemocnice na kraji města“ se léčí „gentlemanovýma kouličkama“… vlastně gentamicinovými kuličkami J Ukázky aminoglykosidů Makrolidy, linkosamidy, tetracykliny, amfenikoly n Působí na proteosynézu, avšak nikoli na její počáteční fázi. Všechny jsou bakteriostatické n Makrolidy a linkosamidy jsou vhodné jen pro grampozitivní bakterie (až na výjimky, jako jsou hemofily a některé G- anaeroby) n Tetracykliny a amfenikoly mají široké spektrum n Tetracykliny a amfenikoly patří k starším antibiotikům, dnes se pro toxicitu užívají spíše méně. Naopak makrolidy se dnes až nadužívají. Makrolidy (a azalidy) n I. generace: erythromycin, v praxi se užívá málo. n II. generace: roxithromycin (RULID); josamycin (WILPRAFEN) a spiramycin se příliš nepoužívají n III. generace: klarithromycin (KLACID), azithromycin (SUMAMED). Azithromycin je vlastně azalid, od ostatních se liší lepším intracelulárním průnikem a dlouhodobým účinkem Linkosamidy n Používá se linkomycin (LINCOCIN) a klindamycin (DALACIN C) n Rezervní antibiotika určená zejména pro použití v orotpedii a chirurgii Ukázky makrolidů a linkosamidů Tetracyklinová antibiotika n Poměrně široké spektrum, ale mohou být sekundární rezistence n Nesmějí se podávat do deseti let (vývoj zubů) n Používají se dnes méně než dříve, ale občas jsou stále nenahraditelné Tetracykliny a amfenikoly – ukázky Analoga kyseliny listové n Nejběžnější je sulfametoxazol v kombinaci s.pyrimidinovým chemoterapeutikem trimetoprimem – ko-trimoxazol – BISEPTOL… n Bakteriostatická, špatný průnik do tkání Nitroimidazoly n Působí na syntézu nukleových kyselin u anaerobních bakterií. Kromě nich ale působí také na prvoky (T. vaginalis, E. histolytica) n Používá se metronidazol (KLION, ENTIZOL, EFLORAN) a ornidazol (AVRAZOR, TIBERAL) Ukázky co-tromoxazolu a nitroimidazolů Rezistence mikrobů na antimikrobiální látky n Primární rezistence: všechny kmeny daného druhu jsou rezistentní. Příklad: betalaktamová atb nepůsobí na mykoplasmata, která vůbec nemají stěnu. n Sekudndární rezistence: vznikají necitlivé mutanty, a ty při selekčním tlaku antibiotika začnou převažovat. (Escherichie mohou být citlivé na ampicilin, ale v poslední době výrazně přibývá rezistentních kmenů n Primární rezistence jednotlivých druhů jsou známy. Sekundární je nutno zjistit in vitro testováním! Mechanismy rezistence n Mikrob zabrání vniknutí antibiotika do buňky n Mikrob aktivně vypuzuje atb z buňky n Mikrob nabídne antibiotiku falešný receptor n Mikrob enzymaticky štěpí antibiotikum (například betalaktamázy štěpí betalaktamová antibiotika) Více v letní přednášce Epidemiologicky významné rezistence - 1 n MRSA – methicilin rezistentní stafylokoky. Nevpouštějí do svých buněk oxacilin ani jiné betalaktamy. Mnohé MRSA jsou rezistetní také na další atb (makrolidy, linkosamidy). Citlivé zůstávají glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin). n VISA, VRSA - stafylokoky částečně nebo úplně rezistentní i na glykopeptidy n VRE – vankomycin rezistentní enterokoky. Snadno se šíří - enterokoky má spousta lidí ve stolici Epidemiologicky významné rezistence - 2 n Producenti ESBL (Extended Spectrum Beta Lactamase). G- bakterie (klebsiely, ale i E. coli aj.) mohou tvořit širokospektré betalaktamázy, kde ani účinek inhibitorů není dostatečný. Účinné bývají jen karbapenemy a někdy některá ne-betalaktamová atb. n MLS rezistence je sdružená rezistence na makrolidy a linkosamidy (a steptograminy), u streptokoků a stafylokoků. U S. aureus zatím naštěstí vzácné. Metody zjišťování citlivosti in vitro n Zjišťování citlivosti in vitro = v laboratoři n Nezaručí stoprocentní účinnost léčby n Přesto vhodné u většiny nálezů kultivovatelných patogenních bakterií Difúzní diskový test n Na MH (nebo jiný) agar se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie n Pak se nanášejí tzv. antibiotické disky – papírky napuštěné antibiotikem n Atb difunduje (prostupuje) z disku agarem dál n Koncentrace atb klesá se vzdáleností od disku n Pokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý) n Je-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý. Difúzní diskový test učeně - 1 Difúzní diskový test učeně - 2 Difúzní diskový test učeně - 3 Pamatujte si: n V praxi sice porovnáváme zóny (měříme zónu v milimetrech a porovnáváme s hodnotou referenční zóny), ale nepřímo vlastně porovnáváme koncentrace: MIC versus léčebná koncentrace (zvaná také breakpoint) Difusní diskový test po lopatě Difúzní diskový test v praxi: zóny se změří a porovnají s referenčními Někdy jsou příliš velké zóny E-testy n Podobné difúznímu diskovému testu n Místo disku se však použije proužek n V proužku stoupající koncentrace atb od jednoho konce ke druhému (speciální technologie, proto taky je to drahé jak prase). n Zóna není kruhová, ale vejčitá. n Test je kvantitativní n Na papírku je stupnice `a `a jednoduché odečítání E-testy – vyhodnocení Hodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek Někde používají speciální čtvercové misky Mikrodiluční test n Antibiotikum je v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá n Nejnižší koncentrace, která inhibuje růst, představuje hodnotu MIC n V přiložené šabloně je zpravidla označen breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen cilivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní n Jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích (přesněji: dvanácté jen v sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu) Mikrodiluční test – ukázka Interpretace stanovení MIC n Ideální je nastolit stav aktivní spolupráce klinického oddělení a mikrobiologie n Pokud se stanovení MIC používá jen kvalitativně (jako „lepší diskový test“), je to škoda n Klinik by měl chtít vědět, jaký je poměr mezi MIC a breakpointem pro jednotlivá antibiotika, a při výběru ATB volit i podle tohoto poměru. n Na druhé straně, konečný výběr antibiotika je na klinikovi – mikrobiolog nezná další souvislosti (alergie, stav jater a ledvin pacienta apod.) Interpretace testu I Interpretace testu II Kdy nestačí „citlivost“ n U močových infekcí je důležitý breakpoint odvozený od koncentrací dosažitelných v moči, nikoli v séru. (U většiny močových infekcí se ovšem MIC nezjišťuje) n U abscesů, infekcí kostí a zejména u meningitid: breakpointy jsou vyjádřením koncentrace atb především v séru, jenže v různých místech těla mohou být mnohem nižší n Je také nutno počítat s tím, že mikroby mohou existovat ve formě biofilmu – nutno určovat hodnoty např. minimální biofilm eradikující konc. Určování MBIC a MBEC Zjišťování faktorů rezistence n Někdy je lépe speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např. betalaktamáz. n Může se jednat o diagnostické proužky (chemický průkaz daného enzymu) nebo testy na jiném principu. n Používá se zejména tam, kde testy citlivosti nedávají spolehlivé výsledky (z různých důvodů, např. nepůsobí testovaná látka přímo, ale jeho metabolit, a podobně) Testování kmenů na produkci běžných betalaktamáz Testování na produkci širokospektrých betalaktamáz Nashledanou Příště budeme pokračovat povídáním o molekulárních metodách a o pokusu na zvířeti