Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 7: A. Pokus na zvířeti B. Genetické metody v mikrobiologii Pro zopakování n Cílem mikrobiologických metod je zpravidla detekce patogena, popř. určení jeho citlivosti na antimikrobiální látky. n Patogena určujeme n Přímými metodami n detekce celého mikroba (jako morfologické či fyziologické jednotky) n detekce jeho části (antigenu, DNA) n detekce jeho produktu (například toxinu) n Nepřímými metodami: detekce protilátek Přehled metod – opakování n Přímé metody (práce se vzorkem či kmenem) n Mikroskopie (nativní preparát, barvení…) n Kultivace (na tekutých i pevných půdách) n Biochemické a podobné identifikační metody n Průkaz antigenu (pomocí protilátky) n Pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity) n Průkaz nukleové kyseliny n Nepřímé metody n Průkaz protilátek (pomocí antigenu) A. Pokus na zvířeti n Pokus na zvířeti je jednou z nejstarších metod v.mikrobiologii. Byl neocenitelnou pomůckách v dobách, kdy ještě nebylo k dispozici tolik umělých kultivačních médií, o dalších metodách ani nemluvě. Dodnes se používá tam, kde ještě nenašel náhradu Historický význam pokusu na zvířeti n V dobách Kocha a Pasteura se zjišťovalo, který mikrob vlastně souvisí s kterou nemocí. V této době sehrála pokusná zvířata velice důležitou a nenahraditenou roli n Proto také pokus na zvířeti („pokusném hostiteli“) má své významné místo v rámci tak zvaných Kochových postulátů. Kochovy postuláty n Určitý mikrob je etiologickým agens, pokud n je prokázán ve všech případech choroby a jeho rozložení v těle odpovídá pozorovaným poškozením; n je z hostitele vypěstován a v čisté kultuře udržován po několik generací; n takto vypěstovaným mikrobem lze napodobit onemocnění na jiném hostiteli; n je opět izolován z pokusně infikovaného hostitele. Zvíře jako měřítko virulence n Porovnáváme-li virulenci různých druhů mikroba nebo různých kmenů stejného druhu, potřebujeme tuto virulenci nějak vyčíslit. n K tomuto účelu lze použít například LD[50]. Je to ukazatel virulence kmene: schopnosti usmrtit n LD[50] = 50% letální dávka. Je to množství mikroba, které usmrtí přesně 1/2 pokusných zvířat Použití zvířete n Zvíře tedy můžeme použít n jako kultivační médium, zejména tam, kde nelze použít kultivační médium neobsahující živé buňky (viry, rickettsie, chlamydie) n jako průkaz patogenního působení určitého kmene mikroba n jako průkaz toxicity mikrobiálního toxinu Etický pohled na pokus na zvířeti n Názory na pokusy na zvířatech se různí. Mnoho lidí by je chtělo úplně zakázat, většinou však nedovedou říci, jak je nahradit n Na druhou stranu je řada případů, kdy pokusy jsou prováděny zbytečně, to však není ani tak případ zdravotnictví, jako především kosmetického průmyslu n Legislativa pokusy na zvířatech povoluje, vyžaduje však splnění přísných pravidel Etické podmínky pokusu na zvířeti n Každý chov pokusných zvířat podléhá schválení etické komise. Pro každý typ pokusu (ať už v rámci diagnostiky, nebo výzkumu) musí být schválen projekt pokusu. n V každém případě zvířata musí být chována za vhodných podmínek (teplota, vlhkost, kvalita vody, potravy, prostorové podmínky apod.) n Velmi přísné jsou požadavky na provedení pokusu a samozřejmě i způsob usmrcení Vědecké podmínky pokusu na zvířeti n Má-li být pokus na zvířeti eticky alespoň do jisté míry ospravedlnitelný, nesmí být zbytečný, musí mít tedy nějakou vypovídací hodnotu o daném případu. n Snažíme se tedy vždy nalézt u zvířete typické příznaky dané choroby. Pokud to lze, prokazujeme také, že zvíře neonemocní, pokud ho ochráníme specifickým způsobem, například podáním určité protilátky. n Každý pokus na zvířeti musí být pečlivě doložen a zdokumentován. Myš Králík Morče Krysa Jiná zvířata n V určitých případech je nutno použít zvláštní zvířata, protože jiná nelze použít. Tak například pro diagnostiku lepry se v určitých případech používá pásovec (na obrázku) n Mnohá zvířata se také používají jako zdroj séra pro sérologické reakce. Zde lze použít např. koňské či kravské sérum. B. Průkaz nukleové kyseliny n Stejně jako pokus na zvířeti je to metoda komplikovaná a nákladná. Obě metody tedy používáme většinou tam, kde běžně používané metody (mikroskopie, kultivace…) selhávají. n Na rozdíl od pokusu na zvířeti však jde o metodu progresivní a velice se rozvíjející n Průkaz NA je možný i z mrtvých buněk. To je výhodné u choulostivých mikrobů. Podařilo se např. i prokázat NA původce tuberkulózy na kosterních pozůstatcích z XI. století. Rozdělení metod průkazu NA n Metody bez amplifikace (genetické sondy). Jsou méně citlivé, to je někdy i výhoda n Polymerázová řetězová reakce (PCR) velmi citlivá, stačí i jedna molekula DNA. Lze ovšem uměle citlivost snížit. n Ligázová řetězová reakce (LCR) je velmi podobná (ale zavedla ji jiná firma) n Průkaz virové RNA je možný pomocí upravené PCR Důležité upozornění n Nehodláme studenty učit principiální otázky týkající se molekulárních metod. K tomu jsou určeny jiné předměty n Naším cílem je seznámit studenty s.předhledem využitelnosti těchto metod v.lékařské mikrobiologii. n Existuje volitelný předmět VSMB081, který vede as. Růžička, kde lze získat hlubší poznatky o této problematice. (Zatím je jen pro mediky, to však lze jistě změnit) Použití metod průkazu DNA (RNA) v.klinické mikrobiologii n Tyto metody používáme zpravidla tam, kde mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není vůbec možný n Nehodí se příliš pro běžné patogeny přítomné všude. Pro svou velkou citlivost by ruče vyčenichaly kdejakou molekulu přilétlou z vnějšího prostředí n Metody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí, ani samospasitelné, jak si myslí pro změnu jiní Základní schéma reakce PCR n V první fázi je nutno získat izolovanou DNA. Proces je poměrně složitý. n V druhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje úsek DNA odpovídající příslušnému primeru n Ve třetí fázi probíhá detekce produktu amplifikace n Gelovou elektroforézou nebo n Metodou ELISA (≠ serologická ELISA!!!) Postup izolace DNA pro PCR Proč je důležitá interní kontrola n Velmi běžným jevem je, že dochází k.tzv. inhibici reakce. Inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic) n Proto by měla být pro detekci vždy použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je dokladem, že nedošlo k inhibici reakce n Ovšem pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (prohraje v.kompletici o nukleotidy). Možné výsledky PCR Následující možnosti platí bez ohledu na způsob detekce (gelovou elektroforézou nebo ELISou) n Pozitivní výsledek vzorku svědčí o pozitivitě vzorku. Přitom výsledek IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být. n Negativní výsledek vzorku při pozitivním výsledku IC = negativní výsledek reakce n Vzorek i IC negativní = inhibice reakce Detekce výsledků PCR pomocí gelové elektroforézy n Gelová elektroforéza je jednou z.možností detekce produktu PCR n Produkty putují gelem od katody směrem k anodě a jsou zviditelněny pomocí UV-transluminátoru n Každý vzorek obsahuje také interní kontrolu (IC) n Kromě vzorků je použit také žebříček (ladder) jako měřítko Ukázka gelu (ladder, pozitivní kontrola, tři vzorky, negativní kontrola) Druhá možnost – ELISA n V tomto případě se produkt reakce detekuje pomocí reakce ELISA. Vysvětlení principu této reakce je mimo rámec této přednášky. n Důležité je, že i v tomto případě hraje zásadní roli interní kontrola. Pokud je negativní reakce vzorku i kontroly, jde o inhibici reakce! Odběr a zasílání vzorku na PCR n Pokud komunikujeme se zařízením, které hodlá provést odběr vzorku na PCR, je nutno mít na paměti: n lze použít téměř jakýkoli vzorek, o kterém předpokládáme, že obsahuje mikroorganismy, po nichž pátráme n není nutno zajistit životaschopnost mikrobů (např. transportní půdou) n naopak je třeba omezit riziko inhibice reakce `a nejlepší je suchý tampón nebo holý kusový vzorek bez nějakých úprav Nashledanou Příště budeme pokračovat povídáním o základech mikrobiologické imunologie