Chemická analýza moče • semikvantitativní analýza • diagnostické proužky • malá pracoviště ručně, velké klinické laboratoře na automatech • proužky používané v ČR - Hepta(Okta)Phan (Pliva-Lachema Diagnostika), Combur (Roche Diagnostic), Aution Sticks (Arkray) • 10 zón (+ kompenzace) • odčítání po 60 – 90 s Principy jednotlivých stanovení: Specifická hustota (hmotnost): -pomocí koncentrace iontů v moči -koreluje dobře s refraktometrickým stanovením -v přítomnosti kationtů jsou protony uvolněny komplexotvorným činidlem -mění barevu bromthymolové modře od modré přes modrozelenou ke žluté -při pH =7 a více připočíst hodnotu 5 kg/m3 -bílkoviny v koncentraci 1 - 5 g/l nebo ketoacidóza hustotu zvyšují pH: -měřeno pomocí acidobazických indikátorů methylová červeň, fenolftalein a bromthymolová modř -kombinace indikátorů umožňuje změnu barvy testační zóny od oranžové přes zelenou na modrou v závislosti na pH moče. Nitrity: • vznik dusitanů redukcí dusičnanů vlivem patogenních mikrobů • na principu Griessovy reakce - dusitanový anion s aromatickým aminem v kyselém prostředí tvoří diazo-sloučeninu • ta kopuluje s vhodnou látkou na červené azobarvivo. • již slabé růžové zbarvení indikuje značnou bakteriurii • falešně negativní výsledky mohou být způsobeny léky (Antibiotika vysadit tři dny před testem) Bílkovina: • přítomnost proteinů - změna barvy acidobazického indikátoru • test je citlivý na albumin, podstatně nižší citlivost vykazuje vůči globulinům, mukoproteinům a Bence-Jonesově bílkovině. • falešná pozitivita - léky, dezinfekční prostředky obsahující kvartérní amoniové soli Glukosa: • na principu enzymové reakce glukosooxidáza/peroxidáza • glukosa je enzymaticky oxidována na glukonolakton • v přítomnosti peroxidázy peroxid vodíku oxiduje indikátor za vzniku zelené barvy • test je specifický pro stanovení D-glukózy, ostatní cukry nedávají pozitivní reakci. • při koncentraci glukózy 5,5 mmol/l a vyšší, neovlivňuje výsledky stanovení ani vyšší koncentrace kyseliny askorbové. • test je specifický pro glukosu, ostatní cukry nereagují Ketony: • test je založen na Legalově reakci • ketolátky reagují s nitroprusidem sodným v silně alkalickém prostředí do fialova • reakce je citlivější na kyselinu acetoctovou než na aceton Bilirubin: • test je založen na kopulaci bilirubinu s diazoniovou solí • vznik růžového zbarvení testační zóny Urobilinogen: • reaguje se stabilní diazoniovou solí v kyselém prostředí • vznik červeného azobarviva • vzorky moče chránit před přímým slunečním světlem • jinak nižší nebo falešně negativní výsledky Leukocyty: • na základě přítomnosti esteráz granulocytů • tyto enzymy štěpí ester indoxylu na indoxyl, který dává s diazoniovou solí barevný fialový produkt • test není ovlivněn přítomností bakterií, trichomonád a erytrocytů v • zeslabení reakce - bílkovina v koncentraci nad 5 g/l a glukóza nad 111 mmol/l léky (gentamycin) Erytrocyty: • erytrocyty jsou hemolyzovány na hemoglobin • ten spolu s myoglobinem katalyzuje oxidaci indikátoru (organický hydroperoxid) – v přítomnosti pseudoperoxidasy • ze žluté na zelenomodrou • lze detekovat mikrohematurii • kyselina askorbová neinterferují Další zóny – kompenzace, turbidita Historie: • fyzikální vlastnosti moče (barva, zápach) • klasické chemické reakce ve zkumavce – - stanovení bilirubinu s alkoholickým roztokem jódu- vznik zeleného prstence biliverdinu -reakce s Ehrlichovým činidlem – azokopulační reakce diazoniové soli – vznik červeného zbarvení s urobilinogenem a porfyriny Referenční interval: hustota 1.010 – 1.025g/ml • posouzení zřeďovací a koncentrační schopnosti ledvin • přesnější je vyšetření osmolality moče Referenční interval: pH 5,0 – 6,5 • vliv potrava (rostlinná alkalizuje, živočišná naopak acidifikuje) • vliv chronické poruchy acidobazické rovnováhy, léčiva. • alkalické pH patologické Příčiny: • bakteriální infekce ledvin a močových cest (pozor na arteficiální pomnožení bakterií při delším skladování moči v teplém prostředí!), • renální tubulární acidóza Referenční interval: nitrity negativní • průkaz svědčí pro uroinfekci (většina bakterií způsobujících močové infekce redukuje nitráty na nitrity). • vyšetření lze použít ke kontrole účinku léčby Referenční interval: bílkovina negativní • prerenální proteinurie vysoká konc. bílkoviny o malé molekule - projde glomerulem: hemoglobin, myoglobin, Bence-Jonesova bílkovina zdravé ledviny • renální proteinurii při onemocnění ledvin: glomerulární - selektivní – poškození mírné, ztráta negativního náboje glomerulární membrány vazbou kyseliny sealové (albumin a bílkoviny o molekulové hmotnosti do 100 tisíc) - neselektivní – poškození větší (prochází i bílkoviny o největší molekule) tubulární - nedostatečné vstřebávání proteinů, které prošly glomerulem (mikroproteiny - a1 a b2-mikroglobulin). při intoxikaci – sloučeniny Cd, Hg smíšená • subrenální proteinurie (bílkovina pochází z močových cest) – při zánětech doprovází ji leukocyturie. Referenční interval: glukóza normální • reabsorbována tubulárními buňkami ledvin • renální práh (9 – 10 mmol/l) - glykosurie Příčiny : • hyperglykémie (diabetes mellitus) • snížený renální práh pro glukózu • těhotenství (zvýšení glomerulární filtrace + snížení renálního prahu) Referenční interval: ketony negativní • vznik při získávání energie z mastných kyselin Příčiny: • hladovění (nedostatek sacharidů, rychle u dětí), • diabetes mellitus • při tkáňové hypoxii ( šok) - falešně negativní rovnováha mezi kyselinou acetooctovou a b- hydroxymáselnou je posunuta na stranu kyseliny b- hydroxymáselné – ta nereaguje Referenční interval: urobilinogen normální Příčiny: • funkční nedostatečnost jater – hepatální ikterus • překročení funkční kapacity jater – prehepatální ikterus (hemolytické anémie, krvácení do GIT, …) Referenční interval: bilirubin negativní • bilirubin v moči pozitivní při zvýšení přímého (konjugovaného) bilirubinu v plazmě • u obstrukčních a hepatálních ikterů Referenční interval: leukocyty negativní Příčiny : • bakteriální zánět močových cest nebo ledvin Referenční interval: krev - erytrocyty negativní • Hematurie - makroskopická mikroskopická (okem ji nevidíme). Příčiny : • Renální (glomerulonefritida, nádor ledvin) • Prerenální (hemoglobinurie a myoglobinurie – hemolýza, svalová traumata, popáleniny) • Subrenální (krvácení do močových cest – zánět, kámen, nádor; hemoragická diatéza) • Ponámahová – fyzická námaha, chlad Močový sediment, mikroskopické vyšetření Specifikace vzorku : první nebo častěji druhá ranní moče • v noci zakoncentrování - patologické hodnoty nejvýraznější močové proteiny a uráty méně rozpustné - hodnocení zejména válců a krystalů kyseliny močové zatíženo menší chybou • během dne příjmem potravy moč alkalizuje vliv diuretik • druhá ranní moč - elementy neleží dlouho v močovém měchýři, nedochází k jejich rozpadu Příprava pacienta : • běžný příjem tekutin • omytí genitálií vodou – ne desinfekcí • středního proud moče (mimo období menstruace) Příprava analytického vzorku – manuální provedení: • sediment z 4 ml nativní moči • odstředěním při 2000 rpm, 5 minut, pokojová teplota • speciální zkumavky k tomuto účelu • supernatant odlít - zbývá 0,4 ml zahuštěné moče Mikroskopické vyšetření: • 10x zakoncentrovaná moč • 400 násobném zvětšení. • preparát na mikroskopickém sklíčku - počet částic na zorné pole v komůrce Fast Read - počet částic na 1 µl nativní moče Erytrocyty, leukocyty, válce a epitelie - na 1 ul Bakterie, kvasinky, hlen a krystaly - přítomny, četné, záplava.. • do jedné hodiny Supravitální barvení dle Sternheimera: • Doc. Timo Kouri - standardizace barvící procedury • dvojsložkovou barvu - modř a červeň. • lepší rozeznatelnost epitelií a válců • potíže při větším počtu erytrocytů (růžová) a leukocytů (modrá) • rychlý rozvoj automatizace v močové analýze (flow cytometrie a automatizované mikroskopické vyšetření) • barvení se v ČR v masovém měřítku neprosadilo Hamburgerův sediment: • kvantitativní stanovení počtu erytrocytů, leukocytů a válců v moči sbírané 3 hodiny • výsledek je přepočten - diuréza - na rychlost vylučovaných elementů za časovou jednotku • umožňuje hodnotit a srovnávat exkreci uvedených elementů a upřesňuje v indikovaných případech základní vyšetření moče. • vyšetření ze sedimentu získaného odstředěním sbírané moče – při manuálním provedení • masivní hematurie, leukocyturie, krystalurie - z nativní sbírané moče • zpracovat do 1 hodiny • ztráta významu Hodnocení močového sedimentu: • Leukocyty (shluky) a erytrocyty – viz chemické hodnocení moče • Epitelie : Dlaždicové (skvamózní) – pochází z uretry a vagíny nepravidelný tvar, velké, dobře viditelné jádro minimální klinický význam – kontaminace častý nález Buňky přechodného epitelu – jedná se o buňky epit. výstelky urinálního traktu – močový měchýř, proximální část uretry u mužů z hlubších vrstev - hustší a kulatější kontakt s močí, absorbce vody - balóny s vodou menší než dlaždicové epitelie možnost dvou jáder menší počet může být normální velké množství - infekce, léky • Epitelie : Renální tubulární – významný nález, velmi zřídka • při renální tubulární nekróze nebo virové infekci • malé, asi dvakrát větší než neutrofily • polyedrické, mají často excentrické ohraničené jádro Oválná tuková tělíska : renální tubulární epitelie nebo makrofágy naplněné tukem • při velké permeabilitě glomerulu - snížený albumin, zvýšená syntéza proteinů a lipoproteinů Válce: • precipitací proteinu v tubulech ledvin • základ tvoří Tamm – Horsfallův glykoprotein, který • je sekretován z renálních tubulárních buňěk • tvorbu válců podporuje - kyselejší pH, přítomnost větší koncentrace plasmových bílkovin, dehydrataci organismu, náročná fyzické aktivitě • definovaná vnější linie, paralelní strany, zakulacené konce, tvar tubulu • úlomky válců • bez barvení pod mikroskopem špatně viditelné • fázová kontrastní mikroskopie • hyalinní, buněčné, granulované, tukové, voskové a směsné Hyalinní válce - barví se světle růžově nebo světle modře • nález, který není patologický • objevují se v koncentrované kyselé moči • ve velkém počtu - záněty • úzké v důsledku otoku tubulů Buněčné válce – erytrocytární, leukocytární (granulocytární), z renálních tubulárních epitelií, bakteriální • patologický nález Erytrocytární –při glomerulární nefritidě, nejkřehčí, nalezeny vyjímečně Leukocytární – nejčastěji z neutrofilů při zánětech a infekcích Z renálních tubulárních epitelií – • po otravě Hg nebo etylenglykolem, hepatitidě, kdy dochází k poškození tubulů Nelze-li určit částice - válec buněčný Přeměna válců: • po vytvoření nezůstávají ve stejném stavu • postupně se vyvíjí. • čím déle v ledvině (tlak), tím pozdější stádium válců • buňky v buněčných válcích postupně degenerují • zborcení, ztrátě buněčné membrány • tvorba granulí • granule podléhají další degeneraci, ztrátě struktury, válcová hmota zhoustne, zkřehne a zvoskovatí Granulované válce: • granule vznikají po rozbití buněčné membrány ve válci či tubulech • malý počet po intenzivní fyzické aktivitě (velký počet u otužilců) • větší počet je silně patologický. • obsahují agregované plasmatické proteiny, fibrinogen, globuliny • nelze určit původ buňek • několik granulí - válce hyalinní Voskové válce - nejzávažnější • při chronickém onemocnění ledvin - válce renálního selhání • homogenní struktura, mohou přecházet ve válec jiného typu – např. granulovaný • nejširší, nepravidelné zlomené konce • vypovídají o poškození tubulů, obsahují částečky ledvin Tukové válce – při silné renální dysfunkci, nefrotickém syndromu • v moči s pěnou, silně zvýšenou CB a Alb, u diabetiků, po intoxikaci Hg • obsahují oválná tuková tělíska • speciálním barvením lze rozlišit převahu Chol či TG Pseudoválce – např. vlákna hlenu, vlákna z plínek Krystaly a amorfní drť: • nepříliš významný nález • oxaláty, kyselina močová, fosfáty a tripelfosfáty • vyjímečně lékové, bilirubinové, cystinové a myoglobulinové Urinalysis and Body Fluids K.M. Ringsrud, J.J. Linné Ukázky z atlasu barvených preparátů dle Doc. Kouriho • Obrázek A – zorné pole v běžném mikroskopu • Obrázek B – zorné pole s fázově kontrastní optikou • Granulocytv (šipka a) s vícelaločnatými (segmentovanými) jádry Hyalinní válce a bakterie (šipka b) Rozdíl ve viditelnosti bakteríi Lymfocyt (šipka) - téměř celá buňka je vyplněna jádrem Erytrocyty Makrofág, Ery V jádře je často vidět nepravidelný chromatin. Močové akantocyty (šipka) - dysmorfní erytrocyty -puchýřky pučící z buněčného povrchu. Podíl 5% akantocytů či větší - renální původ krvácení. Buňka dlaždicového epitelu a dvě tubulární buňky (šipka) ukazují rozdíl ve velikosti. Rozdíl mezi buňkou tubulárního epitelu (šipka a) ( granul. cytoplazma uvnitř hyal. válce), buňkami přechodného epitelu (šipka b) (jemně granulované, jasné jádro) a velkou buňkou dlaždicového epitelu (světlá cytoplazma, degenerované jádro) Karcinom buněk přechodného epitelu s atypickými epitelovými buňkami Buňky tubulárního epitelu uvnitř hyalinního válce Válec Ery, granulocyty - erytrocyty, granulocyty (šipka) (segmentovaná jádra) Válec s erytrocyty - renální hematurie Rozdílnosti ve velikosti a tvaru mezi erytrocyty, dysmorfie Válec z renálních tubulárních buněk Několik červených krvinek (šipka) vně válce Bakteriální válce - bakterie infikovaly ledviny. Pozor na záměnu s granulovaným válcem. Jasné tyčky (šipka) na jednom konci válce. Granulovaný válec - degenerace buněk— granulární srážení nebuněčného organického materiálu v renálním tubulu. Tubulární buňka již nemá plazmat. membránu. Voskový válec s ulomeným koncem Kousek toaletního papíru Ostré hrany a zalomené konce Bakterie a buňky kvasinek (šipka) Tukový válec - kapénky tuku - ve fázovém kontrastu jako světlé skvrny - lipidurie (obvykle naznačující glomerulární chorobu)