Základy klinické cytogenetiky – chromozomy Hanáková M. DEFINICE A HISTORIE • klinická cytogenetika se zabývá analýzou chromozomů (jejich počtem a morfologií), jejich segregací v meióze a mitóze a vztahem mezi nálezy chromozomových aberací a fenotypovými projevy. • vznik moderní lidské cytogenetiky se datuje od roku 1956, kdy Tjio a Levan vyvinuli efektivní metodiky chromozomální analýzy a stanovili, že normální počet lidských chromozomů je 46. JADERNÝ MATERIÁL • chromatin – komplex DNA s chromozomovými proteiny a RNA (pojem používaný pro interfázi) • chromozom – chromatin spiralizovaný v mitóze • chromatida = 1 kontinuální molekula dvoušroubovicové DNA ve vazbě s chromozomovými proteiny (spiralizovaná v mitóze) Jestliže chceme vysledovat osud chromatid chromozomu v interfázi, hovoříme o "chromatidách" i v despiralizované podobě. Chromozom se skládá z 1 nebo 2 chromatid (v různých fázích spiralizace) v závislosti na fázi buněčného cyklu CHROMATIN • euchromatin - dekondenzovaná forma chromatinu - transkripčně aktivní chromatin (přepis genů do RNA) • heterochromatin - kondenzovaná forma chromatinu - transkripčně inaktivní chromatin (ale replikace probíhá) konstitutivní heterochromatin - zůstává v kondenzovaném stavu a nepřepisuje se do RNA v průběhu celého buněčného cyklu ve všech buňkách a ve všech vývojových stádiích organizmu - transkripčně trvale inaktivní - centromery, - chromocentra = oblasti konstitutivního heterochromatinu v interfázi fakultativní heterochromatin - může přecházet ze stavu heterochromatinu do stavu euchromatinu - 1 z chromozomů X v buňkách samic savců je tvořen euchromatinem, 2. heterochromatinem. Na počátku vývoje jedince byly oba euchromatinové, v rané fázi embryogeneze došlo k inaktivaci jednoho chromozomu. CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU buněčný cyklus somatických buněk (interfáze + mitóza) - G1, S, G2 fáze = INTERFÁZE nejdelší fáze buněčného cyklu chromatin je málo kondenzovaný nebo dekondenzovaný (pouze konstitutivní heterochromatin zůstává trvale kondenzován) - M fáze = MITÓZA buněčné dělení – kondenzace chromatinu vznik chromozomů CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromozomů během buněčného cyklu se chromatin nachází v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký stupeň spiralizace, během mitózy postupná kondenzace, maximální v metafázi mitózy) CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU- interfáze buňka v interfázi (v jádře málo kondenzovaný a dekondenzovaný chromatin) CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU- metafáze mitózy metafázní chromozomy ve světelném mikroskopu (chromozomový rozptyl, pracovně mitóza) zvětšení 1250x CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU interfáze G1 fáze každý chromozom je tvořen 1 chromatidou S fáze = syntetická fáze každý chromozom se zdvojí (zreplikuje), tzn. je tvořen dvěma chromatidami G2 fáze každý chromozom je tvořen dvěma chromatidami CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU mitóza M fáze = MITÓZA postupná kondenzace chromatinu až do maxima v metafázi, vznik chromozomů (chromozomy tvořeny dvěma chromatidami) oddělení sesterských chromatid v centromeře v anafázi (chromozomů je dvojnásobný počet a jsou tvořeny jednou chromatidou) – podélné dělení centromery segregace dceřinných chromatid (samostatných chromozomů), pohybují se k protilehlým pólům buňky mitóza je dokončena cytokinezí - rozdělením cytoplazmy původně mateřské buňky za vzniku dvou dceřinných buněk, jejichž jádra obsahují stejnou genetickou výbavu jako buňka mateřská (dělení buňky) CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU fáze mitózy - profáze – počátek kondenzace chromozomů, tvorba dělícího vřeténka - prometafáze – pokračuje kondenzace, začátek pohybu chromozomů do ekvatoriální roviny - metafáze – chromozomy maximálně kondenzované, seřazeny v ekvatoriální rovině buňky - anafáze – oddělení chromozomů v centromeře, sesterské chromatidy putují k protilehlým pólům buňky - telofáze – počátek dekondenzace chromozomů, tvorba jaderného obalu kolem dceřinných jader - cytokineze – rozdělení cytoplazmy původně mateřské buňky CHROMOZOM tyčinková organela CHROMOZOM • centromera = heterochromatinová oblast (konstitutivní heterochromatin), místo rozdělení krátkých a dlouhých ramének, místo spojení sesterských chromatid, místo tvorby kinetochorů v meióze a mitóze, (primární konstrikce) • telomera = specifická DNA sekvence na koncích každého chromozomu (každé chromatidy), která zajišťuje integritu chromozomu během buněčného dělení (repetitivní hexamer (TTAGGG)n) CHROMOZOMY V PRAXI dvouchromatidový metafázní chromozom v preparátu vhodném pro naše účely jsou sesterské chromatidy těsně u sebe, chromozom se jeví jako 1 tyčinka CHROMOZOMY V PRAXI karyotyp • soubor chromozomů jedince nebo buňky s označením jejich počtu, druhu pohlavních chromozomů a případných aberací (zápis karyotypu např. 46,XX) • běžné označení pro soubor metafázních chromozomů buňky uspořádaných podle standardní klasifikace • lidský karyotyp se skládá ze 46 chromozomů, z toho 22 párů autozomů (nepohlavních chromozomů) a 2 gonozomů (pohlavních chromozomů) • chromozomový pár je tvořen homologními chromozomy, z nichž jeden je zděděn od otce a druhý od matky, nepárové chromozomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) ZÁPIS KARYOTYPU 46,XX - normální ženský karyotyp 46,XY - normální mužský karyotyp CHROMOZOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY CHROMOZOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX CHROMOZOMY V PRAXI třídění chromozomů podle umístění centromery • metacentrické chromozomy centromera téměř nebo úplně uprostřed, tedy krátká a dlouhá raménka jsou (téměř) stejně dlouhá • submetacentrické chromozomy centromera mimo střed chromozomu, p a q raménka jsou jasně délkově odlišena CHROMOZOMY V PRAXI třídění chromozomů podle umístění centromery • akrocentrické chromozomy centromera je umístěna velmi blízko jednomu konci; od krátkých ramének jsou odškrceny satelity (malé výrazné části konstitutivního heterochromatinu; místo odškrcení = sekundární konstrikce (tenké stopky); (sekundární konstrikce obsahuje kopie genů kódujících rRNA = organizátor jadérka) CHROMOZOMY V PRAXI třídění chromozomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY CHROMOZOMY V PRAXI odběr materiálu Odběr materiálu pro účely cytogenetického vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) • do heparinu a transportního média – kostní dřeň (obv. 1-2 ml) • do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) • bez přídavku média a dalších látek – plodová voda (obv. 20 ml) CHROMOZOMY V PRAXI odběr materiálu Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních chromozomů : • periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty • fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé T-lymfocyty • plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní fibroblasty • choriové klky – z chorionu nebo placenty - buňky choriových klků nebo placenty • kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní fibroblasty • kostní dřeň – z prsní kosti, kyčlí – prekurzory krevních buněk • solidní tumory – z nádoru – maligní buňky CHROMOZOMY V PRAXI odběr materiálu CHROMOZOMY V PRAXI kultivace materiálu • délka kultivace - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) - 48 hodin (stanovení ZCA) kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci chromozomů nebo k zániku buněk s aberací - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) - choriové klky – přes noc (stanovení karyotypu) - kostní dřeň – přímé zpracování buněk ihned po odběru - 24 hodin (48 hodin spec. případy) (stanovení karyotypu maligních klonů v KD) - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) - solidní tumory – minimálně 3 týdny (stanovení karyotypu maligních klonů v tumoru) CHROMOZOMY V PRAXI kultivace materiálu • kultivace buněk v suspenzi (periferní krev, fetální krev, choriové klky, kostní dřeň) • kultivace buněk přichycených na dně kultivační nádobky (plodová voda, solidní tumory, kůže) - po kultivaci pomocí roztoku trypsinu odloupneme ode dna, dále zpracováváme jako suspenzi buněk CHROMOZOMY V PRAXI kultivace materiálu CHROMOZOMY V PRAXI kultivace T-lymfocytů z periferní krve • kultivace periferní krve v médiu s phytohemaglutininem (PHA) = výtažek z fazolu obecného (Phaseolus vulgaris) - T-lymfocyty = zralé diferencované buňky s malou spontánní mitotickou aktivitou - vlivem PHA se dediferencují (přeměna na nezralé buňky lymfoblasty, které se dělí (tzn. vstupují do mitózy!) (např. k nezralým buňkám – blastům z kostní dřeně onkologických pacientů není třeba PHA přidávat, dělí se samovolně) - význam kultivace – pomnožení T-lymfocytů CHROMOZOMY V PRAXI zpracování suspenze T-lymfocytů • aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) - zastavení dělení buněk v metafázi mitózy - kolchicin je mitotický jed, který specificky inhibuje dělící vřeténko a tím zastavuje dělení buněk v metafázi mitózy, kdy jsou chromozomy vhodné k analýze • hypotonizace - KCl - lýza erytrocytů CHROMOZOMY V PRAXI zpracování suspenze buněk • fixace – získání suspenze buněk - kyselina octová + metanol - náhlé a trvalé zastavení veškerých životních pochodů buňky, odvodnění rozpuštění cytoplazmy, projasnění jader • vykapání suspenze buněk na podložní sklíčko (krycí sklíčka nepoužíváme) • orientační vykapání a barvení – zjištění hustoty suspenze CHROMOZOMY V PRAXI barvení / pruhování chromozomů • barvení (analýza ZCA) – Giemsovým barvivem (bez pruhování chromozomů, obarvuje chromozomy po celé délce, viz kapitola „Získané chromozomové aberace”) • pruhování chromozomů (analýza karyotypu, karyotypu maligních klonů) • speciální barvení – „C”, „NOR” - dovyšetření nálezů na chromozomech CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů • pruhovací metody umožňují individuální diferenciaci jednotlivých chromozomů (byly zavedeny v letech 1968 -71) • do té doby bylo možné pouze obarvit chromozomy barvivem – orcein, karbolfuchsin, Feulgenovo barvivo a seřadit je do skupin podle velikosti a poměru krátkých a dlouhých ramének CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů G – pruhování chromozomu č. 1 – vzor a reálné chromozomy CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů G - pruhování • nejčastěji rutinně užívaná metoda • chromozomy jsou vystaveny účinkům trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromozomové proteiny • chromozomy obarvíme Giemsovým barvivem (směs barviv) • výsledek – každý chromozom se specificky obarví (střídavé tmavé a světlé proužky různé tloušťky, tmavé proužky jsou bohaté na adenin a thymin, světlé na cytozin a guanin) • získané pruhy jsou specifické pro každý chromozomový pár • lze snadno rozpoznat strukturní a numerické abnormality • 1 pruh na chromozomu obsahuje 50 i více genů CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů G – pruhování normální mužský karyotyp 46,XY CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů Q - pruhování • barvení akridinovými deriváty (fluoreskující látky – fluorochromy), akridin se specificky váže na oblasti bohaté na adenin (A) a tymin (T) • Q - pruhy (světlé a tmavé), přibližně odpovídají G - pruhům • nevýhody – je třeba speciální fluorescenční mikroskop a při delší expozici UV světlem fluorescence slábne CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů R – pruhování • vystavení chromozomů působení specifických vlivů před obarvením (zahřátí) • R = reverse (opačný), tzn. R – pruhy jsou opačné ke G - a Q – pruhům (kde jsou G – a Q – pruhy světlé, tam jsou R – pruhy tmavé a opačně) CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů C - barvení vizualizace konstitutivního heterochromatinu (konstitutivní heterochromatin v oblasti centromer a na dlouhých raméncích některých chromozomů – 1q, 9q, 16q, Yq) - metoda založena na denaturaci DNA působením různých agens (HCl, Ba(OH)2) a následné reasociaci v teplém pufru CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů NOR - barvení • navázání zrn stříbra na aktivní oblast organizátoru jadérka (sekundární konstrikce akrocentrických chromozomů) • stříbro se vyloučí z AgNO3 za vyšší teploty a v kyselém prostředí • zjišťujeme, jestli jsou satelity schopny aktivity (jestli na nich není navázán euchromatin, který by aktivitě bránil a mohl by být nebalancovaným materiálem v karyotypu) • každý akrocentr nemusí být aktivní ve všech buňkách CHROMOZOMY V PRAXI varianty chromozomů heteromorfizmy (G – pruhování) varianty heterochromatinu a satelitů CHROMOZOMY V PRAXI hodnocení Chromozomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení 1250x za použití imersních objektivů. Ke třídění chromozomů a sestavení karyotypu lze využít počítačového programu. MEIÓZA • typ buněčného dělení, při kterém z diploidních zárodečných buněk (primárních oocytů a primárních spermatocytů) vznikají haploidní gamety (z 1 diploidní zárodečné buňky vzniknou 4 haploidní gamety) • základní schema průběhu meiózy – proces zahrnuje 2 meiotická dělení, prvnímu předchází fáze replikace DNA, druhému nikoli MEIÓZA Meióza I • počet chromozomů je redukován z diploidního na haploidní • v průběhu meiózy I se odehrává rekombinace genetického materiálu – meiotický crossing-over (v profázi), v průběhu kterého dochází k výměně homologních segmentů DNA mezi nesesterskými chromatidami v párech homologních chromozomů (mezi chromatidami maternálního a paternálního původu) • význam crossing-overu – výsledné gamety nejsou ani v jednom případě identické • v meióze I se každý chromozom skládá ze 2 chromatid (chromozomový pár ze 4 chromatid), rozcházejí se homologní chromozomy, nikoli sesterské chromatidy • po meióze I následuje dělení buňky na 2 haploidní dceřinné buňky, které vstupují do velmi krátké meiotické interfáze, v níž chybí S-fáze (syntetická fáze) – nereplikuje se DNA Meióza II • podobnost s mitózou – podélné dělení centromery, rozchod sesterských chromatid • odlišnost od mitózy – počet chromozomů vstupujících do meiózy II je haploidní • konečný výsledek – 4 haploidní buňky, každá obsahuje 23 chromozomů, které jsou tvořeny jednou chromatidou • v důsledku crossing-overu, který proběhl v 1. meiotickém dělení, nejsou chromozomy výsledných gamet identické PORUCHY V MEIÓZE • meiotická nondisjunkce – nejčastější mutační mechanismus našeho druhu, proces, při kterém se oba chromozomy v páru v anafázi meiotického dělení přemístí ke stejnému pólu místo aby segregovaly k opačným pólům - porucha oddělení páru chromozomů během jednoho ze dvou meiotických dělení (většinou v průběhu meiózy I) • důsledkem nondisjunkce je aneuploidie – abnormální počet chromozomů v karyotypu, který je způsoben absencí chromozomu nebo přítomností nadbytečného chromozomu • důsledky nondisjunkce během 1. a 2. meiotického dělení jsou odlišné - meióza I – gameta obsahuje pár chromozomů, z nichž 1 je maternálního a 2. paternálního původu - meióza II - gameta s nadbytečným chromozomem obsahuje obě kopie buď pouze paternálního nebo pouze maternálního původu ( platí pro centromery, protože v meióze I dochází k rekombinaci mezi paternálními a maternálními chromatidami, paternální a maternální úseky jsou na homologních chromozomech povyměňované ) PORUCHY V MEIÓZE CHROMOZOMOVÉ ABNORMALITY (ABERACE) • vrozené chromozomové aberace (VCA) (vyšetření karyotypu) – početní - vyšetřujeme 10 nebo 30 mitóz, případně dovyšetřujeme FISH do 200 mitóz - strukturní – vyšetřujeme 10 mitóz, potvrzujeme FISH - prenatální a postnatální stanovení karyotypu (vyšetření karyotypu plodu, vyšetření dětí s vrozenými vývojovými vadami, párů s poruchou fertility .…), • získané chromozomové aberace (ZCA) (stanovení % aberantních buněk) - vyšetření u pacientů, kteří pracují v rizikovém prostředí (kontakt se škodlivými látkami, zářením) …., vyšetřujeme 100 mitóz VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromozomů • abnormality počtu chromozomů - polyploidie – počet chromozomů je více než dvojnásobkem haploidního počtu (n = 23) (triploidie 3n = 69, tetraploidie 4n = 92) většinou pouze u plodů (samovolné aborty) - aneuploidie – nejčastější a klinicky velmi významný typ chromozomových poruch VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromozomů aneuploidie • trizomie – nejčastější porucha (místo 2 chromozomů v páru přítomny 3) trizomie autozomů (trizomie celého chromozomu je jen vzácně slučitelná se životem) - Downův syndrom 47,XX/XY, +21 - Edwardsův syndrom 47,XX/XY, +18 - Patauův syndrom 47,XX/XY, +13 trizomie gonozomů (fenotypové důsledky jsou méně závažné než u trizomie autozomů) - Klinefelterův syndrom 47,XXY (muž) - další syndromy VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autozomů Downův syndrom Downův syndrom 47, XX, +21 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autozomů Edwardsův syndrom Edwardsův syndrom 47,XY,+18 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autozomů Patauův syndrom Patauův syndrom 47,XY,+13 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonozomů Klinefelterův syndrom Klinefelterův syndrom 47,XXY VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromozomů aneuploidie • monozomie – méně častá porucha (místo 2 chromozomů v páru přítomen 1) - monozomie gonozomu X (Turnerův syndrom) 45,X (žena) častý výskyt - monozomie autozomů – výjimečně se vyskytující porucha, slučitelná se životem jen u některých chromozomů a to v mozaice (v těle jedince mohou být přítomny 2 nebo více buněčné linie s různou chromozomovou sestavou, např. linie normální s linií s monozomií chromozomu č.18) 45,XX,-18[10]/46,XX[190] VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonozomů Turnerův syndrom Turnerův syndrom 45,X VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • strukturní abnormality chromozomů • méně časté než aneuploidie • dochází k přestavbám a následně ke změnám morfologie chromozomů • předpokladem je vznik zlomů na chromozomech VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace • translokace – nejčastější ze strukturních aberací, předpokladem je vznik dvou zlomů, každý na jednom chromozomu balancované translokace – výměny chromozomových segmentů mezi dvěma, zpravidla nehomologními, chromozomy robertsonovské translokace – 2 akrocentrické chromozomy fúzují v oblasti centromery a ztrácejí svá krátká raménka (ztráta nemá vliv na fenotyp), vznik zlomů v oblasti centromery VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace balancovaná translokace t(1;15) výměna koncových úseků chromozomů VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby balancovaná translokace t(1;15) 46,XX,t(1;15)(q12;q22) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace robertsonovská translokace der(13;14) (derivovaný chromozom) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby robertsonovská translokace 45,XX,der(13;14)(q10;q10) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokační forma Downova syndromu 45,XX,der(21;21)(q10;q10) 46,XY,der(21;21)(q10;q10),+21 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokační forma Downova syndromu 45,XX,der(14;21)(q10;q10) 46,XY,der(14;21)(q10;q10),+21 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace dítě s nebalancovaným karyotypem 46,XY,der(21)t(16;21)mat translokace u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet a s tím spjatých potratů nebo narození potomků s nebalancovaným karyotypem (parciální monozomie jednoho a parciální trizomie druhého chromozomu) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace 46,XX,t(16;21)(q22;q22.1) 46,XY,der(21)t(16;21)(q22;q22.1) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace • balancované přestavby - v sadě chromozomů je zachováno normální množství chromozomového materiálu - většinou nemají fenotypové vyjádření, v buňkách je přítomen veškerý chromozomový materiál, i když v odlišném uspořádání - mohou mít fenotypové vyjádření v případě, že jsou v důsledku přestavby vyřazeny některé geny z funkce, v místě zlomu vznikla malá delece, která není detekovatelná ad. (zdánlivě balancovaná chromozomová přestavba) • nebalancované přestavby – část chromozomového materiálu v karyotypu chybí (parciální monozomie) a část přebývá (parciální trizomie) - většinou dochází k fenotypovým abnormalitám VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby - translokace vznik nebalancovaných gamet v meióze VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze • inverze – na jednom chromozomu vzniknou 2 zlomy, segment mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení do chromozomu paracentrická inverze – oba zlomy jsou na stejném raménku, úsek nezahrnuje centromeru pericentrická inverze – na každém raménku je jeden zlom, invertovaný úsek zahrnuje centromeru VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze pericentrická inverze inv(8) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze 46,XX,inv(8)(p23.1?;q23?) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze paracentrická inverze inv(1) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze 46,XX,inv(1)(q21;q32) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze jako varianty normy pericentrická inverze inv(9)(p11;q13) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze inverze u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet a narození abnormálních potomků VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece • delece – vznik zlomů a ztráta úseku chromozomu, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální monozomie) terminální delece –vznik jednoho zlomu, ztráta koncového úseku chromozomu intersticiální delece –vznik dvou zlomů, ztráta segmentu uloženého mezi centromerou a terminální částí VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece terminální delece del (5pter) syndrom Cri du chat (syndrom kočičího křiku) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece 46,XX,del(5p)(p14.1-pter) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece míra klinických příznaků závisí na rozsahu deletovaného segmentu a na počtu a funkci genů, které jsou v něm obsaženy VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece 46,XY,del(18p)(p11.1-pter) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce • inzerce – nereciproký typ translokace - segment z jednoho chromozomu je odstraněn a vložen do jiného chromozomu buď ve své původní orientaci nebo opačné - k jejich vzniku jsou potřeba 3 body zlomu, 2 na jednom chromozomu a 1 na druhém - jsou poměrně vzácné (1:80000) - hrozí vznik nebalancovaných gamet a narození abnormálních potomků VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce inzerce úseku chromozomu č. 14 do chromozomu č. 6 příklad zdánlivě balancované přestavby VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce 46,XY,ins(6;14)(p24;q13q22) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace • duplikace – nadbytečný chromozomový segment, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální trizomie) - bývají méně nebezpečné než delece duplikace segmentu dup(6) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace 46,XX,dup(6)(q22-q23) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromozomů marker chromozomy – malé chromozomy (s centromerou), často v mozaice, obtížně identifikovatelné (mohou být vrozené nebo kultivačního původu) kruhové chromozomy (ring chromozomy) – na obou koncích chromozomu vzniknou zlomy, dojde ke ztrátě koncových úseků, zbytek chromozomu se spojí VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby ring chromozom 46,XX,r(18) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby marker chromozom 47,XX,+mar VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromozomů VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby izochromozom 46,X,idic(Xq) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromozomů • dicentrické chromozomy - na dvou chromozomech dojde ke zlomu - vznikne dicentrický chromozom fúzí úseků s centromerou a acentrický fragment spojením úseků bez centromery VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby dicentr 46,XY,dic(13;14)(q11;q11) Klinické indikace k postnatálnímu stanovení karyotypu (VCA) • podezření na syndrom podmíněný chromozomovou aberací (CHA) (+21,+18,+13, 4p-, 5p-,+8,+9, mikrodeleční syndromy) • novorozenci s mnohočetnými vadami postihujícími více systémů • neprospívající kojenci + somatické odchylky, dysmorfie obličeje, změny svalového tonu • psychomotorická retardace +(-) somatické odchylky • děti s anomáliemi vnitřního i zevního genitálu • poruchy pohlavního vývoje • sterilní a dysfertilní páry (opakované samovolné aborty (SA), dva a více !!!) • dárci gamet !!! • partneři před IVF !!! • děti určené k adopci ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) • vyšetření vlivu mutagenních faktorů prostředí na člověka • změny nejsou vrozené (nejsou součástí karyotypu), jsou získané (vyskytují se v některých buňkách v důsledku vlivu vnějších faktorů, v různých buňkách se mohou vyskytovat různé změny) • zvýšené % aberantních buněk v organismu přispívá k rychlejšímu stárnutí organismu, vzniku degenerativních onemocnění, je možné maligní zvrhnutí; aberace mohou být přítomny nejen v somatických, ale i v pohlavních buňkách, zvyšuje se riziko narození postiženého dítěte. • hodnotí se 100 buněk, za patologii je považován nález opakovaně 5% nebo více než 5% aberantních buněk, vyšetřujeme 100 mitóz ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) charakteristika poškození poškození chromozomů závisí na: • typu působících faktorů • fázi buněčného cyklu, ve které se nachází buňka v době působení mutagenu • dávce mutagenu ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku působení - fyzikálních faktorů (ionizující záření) - chemických látek (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, alkylační činidla ad. látky používané v průmyslu) - biologických faktorů (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, zarděnky ad.) ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození typ poškození závisí na fázi buněčného cyklu v době působení mutagenu: • chromatidové aberace - aberace na jedné chromatidě postiženého chromozomu (poškození už replikované DNA, chromozom se skládá ze 2 chromatid) • chromozomové aberace - aberace na obou chromatidách postiženého chromozomu (poškození DNA před replikací, chromozom se skládá z 1 chromatidy, která se replikuje i s defektem) ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace • jednochromatidové gapy (mezery) (G´)- příčně slabě se barvící část chromatidy, také úplné přerušení chromatidy nepřesahující její šířku ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace • jednochromatidové zlomy (Z´), oddělení samostatného fragmentu (F) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece (fragmenty mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromozomem nebo nemusí) ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace • výměny (V)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromozomů ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace - výměny ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromozomové aberace • dvouchromatidové zlomy (Z´´), oddělení párových fragmentů (DF)- úplné přerušení obou chromatid, pravděpodobně koncová delece (fragment obvykle leží paralelně, mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromozomem nebo nemusí) ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromozomové aberace • izochromatidové gapy (mezery) (G´´)- příčně slabě se barvící část chromozomu, také úplné přerušení chromozomu nepřesahující šířku chromatidy ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromozomové aberace • acentrické ringy, kruhové chromozomy- uzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromozomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromozomy zahrnují centromeru ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromozomové aberace • chromozomy zahrnující více než 1 centromeru- dicentrické, tricentrické chromozomy… ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA)- příprava preparátů Příprava preparátů na ZCA se liší od přípravy preparátů na stanovení karyotypu (viz kultivace materiálu, zpracování, barvení): • materiál – periferní krev • kultivace buněk v suspenzi 48 hodin s přidáním PHA • kolchicin, hypotonizace, fixace, vykapání suspenze na sklíčka • BARVENÍ GIEMSOVÝM BARVIVEM BEZ PRUHOVÁNÍ CHROMOZOMŮ Klinické indikace k vyšetření ZCA • práce v riziku (kontakt se škodlivými látkami, zářením), vstupní prohlídky na pracovištích se zvýšeným rizikem • podezření na syndromy se zvýšenou lomivostí chromozomů • před chemoterapií, po chemoterapii, po jiné dlouhodobé léčbě • v případě, že při vyšetření chromozomů na VCA byl zjištěn markantní nález chromozomových zlomů • kontrolní vyšetření u podchycených případů Doporučená literatura • Klinická genetika, Thompson 2001 • Základy klinickej genetiky, Sršeň, Sršňová 1995 • Základy lékařské genetiky, Pritchard, Korf 2003 Děkuji za pozornost