KultivaceKultivace hematopoetickýchhematopoetických buňekbuňek L.L. BourkováBourková, OKH FN Brno, OKH FN Brno HematopoetickéHematopoetické kmenové buňkykmenové buňky vv kostní dřeni i periferní krvi ve velmi nízké koncentracikostní dřeni i periferní krvi ve velmi nízké koncentraci pro svoji podobnost spro svoji podobnost s lymfocyty se nedají morfologickylymfocyty se nedají morfologicky rozpoznat.rozpoznat. morfologicky jsou rozpoznatelné až jejich další vývojovámorfologicky jsou rozpoznatelné až jejich další vývojová stádiastádia -- myeloblastmyeloblast,, proerytroblastproerytroblast,, megakaryoblastmegakaryoblast.......... kmenové buňky se stanovují např. imunologicky pomocíkmenové buňky se stanovují např. imunologicky pomocí povrchových antigenů a nebo funkčními testy, napovrchových antigenů a nebo funkčními testy, na základě proliferační aktivityzákladě proliferační aktivity ­­ sebeobnovasebeobnova:: schopnost buňky dát buněčným dělenímschopnost buňky dát buněčným dělením vznik dvěma dceřiným elementům, které jsouvznik dvěma dceřiným elementům, které jsou identické sidentické s buňkou mateřskoubuňkou mateřskou ­­ diferenciace:diferenciace: schopnost buňky vyvíjet se dále veschopnost buňky vyvíjet se dále ve funkčně i morfologicky odlišná vyzrálejší vývojováfunkčně i morfologicky odlišná vyzrálejší vývojová stádiastádia Základní pojmyZákladní pojmy TotipotentníTotipotentní kmenové buňkykmenové buňky: jsou schopné vytvořit jakýkoliv: jsou schopné vytvořit jakýkoliv typ buňky, který se v organismu vyskytuje. Každátyp buňky, který se v organismu vyskytuje. Každá totipotentnítotipotentní buňkabuňka obsahuje kompletníobsahuje kompletní gentickougentickou informaci pro celý organismus a máinformaci pro celý organismus a má jedinečnou schopnost diferenciace.jedinečnou schopnost diferenciace. PluripotentníPluripotentní kmenové buňky:kmenové buňky: jsou schopny diferenciacejsou schopny diferenciace (dělení) do mnoha různých typů. Speciálním případem(dělení) do mnoha různých typů. Speciálním případem pluripotencepluripotence jeje multipotencemultipotence, kde je, kde je pluripotentnípluripotentní schopnost kmenové buňkyschopnost kmenové buňky omezena na určitý typ tkáně (případně na určitý orgán).omezena na určitý typ tkáně (případně na určitý orgán). MultipotentníMultipotentní kmenové buňky:kmenové buňky: jsou schopny diferenciacejsou schopny diferenciace (dělení) do mnoha typů buněk, ale pouze v rámci daného typu tkán(dělení) do mnoha typů buněk, ale pouze v rámci daného typu tkáněě (resp. orgánu). Např.(resp. orgánu). Např. hematopoetickáhematopoetická kmenová buňka, která se dálekmenová buňka, která se dále vyvíjí přesvyvíjí přes progenitorovéprogenitorové aa prekurzorovéprekurzorové buňky k vyzrálým stádiím.buňky k vyzrálým stádiím. ­­ progenitorovéprogenitorové b.:b.: CFUCFU--GEMM (GEMM (colonycolony--formingforming unitunit--granulocytegranulocyte,, -- erythrocyteerythrocyte,, --monocytemonocyte,, andand ­­megakaryocytemegakaryocyte), CFU), CFU--GM (GM (colonycolony-- formingforming unitsunits--granulocytegranulocyte//macrophagemacrophage), BFU), BFU--EE ((burstburst--formingforming unitsunits erythrocyteerythrocyte)) ­­ prekurzorovéprekurzorové b.:b.: myeloblastmyeloblast,, proerytroblastproerytroblast,, megakaryoblastmegakaryoblast.......... Metoda tkáňových kultivacíMetoda tkáňových kultivací Princip metodiky:Princip metodiky: Kultivační metoda sleduje funkční schopnosti krvetvorných buněk,Kultivační metoda sleduje funkční schopnosti krvetvorných buněk, které odpovídají na růstové faktory vkteré odpovídají na růstové faktory v kultivační půdě tvorboukultivační půdě tvorbou kolonií.kolonií. Kultivační prostředí:Kultivační prostředí: Kultivační média představují sterilní vybalancované chemickéKultivační média představují sterilní vybalancované chemické prostředí, zprostředí, z něhož buňky čerpají složky pro svůj metabolismus.něhož buňky čerpají složky pro svůj metabolismus. Kultivační atmosféra má 100% vlhkost a 5% obsah CO2Kultivační atmosféra má 100% vlhkost a 5% obsah CO2 vv inkubátoru. Nosná média např.inkubátoru. Nosná média např. methylcelulózamethylcelulóza, agar..., agar... Schéma metodiky:Schéma metodiky: mononukleárnímononukleární buňky + médium + atmosféra (14 dnů)buňky + médium + atmosféra (14 dnů) koloniekolonie Hodnocení:Hodnocení: mikroskopemmikroskopem kolonie vznikají zkolonie vznikají z progenitorovýchprogenitorových buněkbuněk kolonie CFUkolonie CFU--GM obsahují minimálně 40 buněk, kolonie BFUGM obsahují minimálně 40 buněk, kolonie BFU--E ažE až 1000 buněk.1000 buněk. Využití:Využití: diagnostika (hematologické malignity), monitorování léčby, kdiagnostika (hematologické malignity), monitorování léčby, k terapii...terapii... Pracovní prostředíPracovní prostředí Tkáňové kultivaceTkáňové kultivace BFUBFU--E kolonieE kolonie CFUCFU--GM kolonieGM kolonie CFUCFU--GM kolonieGM kolonie