Anémie Bourková L., OKH FN Brno Vyšetření retikulocytů Barvení RNA v erytrocytech: * mikroskopicky ­supravitální barvení (bez fixace preparátu) * analyzátorem ­analýza prošlého světla ­analýza fluorescence Mikroskopické vyšetření retikulocytů * V retikulocytech se barví supravitálně brillantcresylovou modří zbytky RNA. * Pozitivita se hodnotí v 1000 erytrocytech ­ normální hodnoty: 0,5 ­ 2,5 % Retikulocyty Vyšetření retikulocytů na analyzátoru * analýza prošlého světla měření RNA v retikulocytech obarvených brillantcresilovou modří (měření absorbance) * fluorescenční analýza měření RNA v retikulocytech obarvených fluorescenčními barvami (měření fluorescence) * Normální hodnoty: 0,5 ­ 2,5 % 25 ­ 75 x 109/L Cytochemické vyšetření zásobního Fe - I * Provádí se v KD. Zásobní Fe3+ je využíváno pro tvorbu hemoglobinu. Je-li tvorba hemoglobinu narušena, zůstává zásobní železo v RBC nebo NRBC ve větších granulích nebo v jejich větším počtu. * Princip: komplexem ferrokyanidu draselného a kyseliny chlorovodíkové se barví zásobní nehemové Fe3+, intra- nebo extracelulárně za vzniku barevných skvrn Berlínské modři Cytochemické vyšetření zásobního Fe - II * Hodnocení: zelenomodrá granula v erytrocytech (siderocyty), v NRBC (sideroblasty), v makrofázích (siderofágy), zrnka v NRBC okolo 2/3 jádra (prstenčité sideroblasty) * normální hodnoty: 20 ­ 40 % pozitivních NRBC * Klinický význam: ­­ anémieanémie např. sideropenické (nízké hodnoty) např. refrakterní anémie s prstenčitými sideroblasty (vysoké hodnoty a prstenčité sideroblasty >15%), hemolytické anémie Barvení Fe 3+ Barvení Fe 3+ Porucha syntézy hemu Sideropenická anémie (nedostatek železa) * KO: pokles HGB, MCV, vyšší RDW * nátěr PK: hypochromní mikrocyty, anulocyty, poikilocyty, bazofilní tečkování * nátěr KD: vyšší erytropoéza, NRBC opožděné vyzrávání cytoplazmy, vyšetřování zásobního Fe (hodnoty snížené nebo nulové) Sideropenická anémie Porucha syntézy globinu Thalasemie * KO: nižší nebo normál. RBC, nižší nebo normál. HGB, výrazně snížené MCV, vyšší RDW, lehce vyšší WBC, lehce vyšší PLT * nátěr PK: mikrocytóza, hypochromie, terčovité ery, polychromázie, bazofilní tečkování, H.J.tělíska, bazofilní tečkování, NRBC, mladší formy WBC * nátěr KD: hyperplazie erytropoézy, vyšetření zásobního Fe (hodnoty zvýšené) Thalasemie Porucha syntézy DNA Megaloblastové anémie * KO: MCV >100fl, HGB až pod 50g/L, vyšší RDW, snížení WBC, NE, PLT * nátěr PK: makroovalocytóza, poikilocytóza, Cabotovy prstence, bazofilní tečkování, H.J. tělíska, NRBC, NE hypersegmentace, větší buňky, větší laločnatost jader i u monocytů, velké až gigantické PLT * nátěr KD: buněčně bohatá, erytropoéza zmnožená, posun k mladším formám, (megaloblastová přestavba ve všech vývojových řadách), velké tyče, metamyelocyty, hypersegmentace MGK, vyšetření zásobního Fe (hodnoty zvýšené) Megaloblastová anémie Megaloblastová anémie Aplastické anémie * periferní krev: pancytopenie nebo alespoň anemie a trombocytopenie, mírná makrocytóza a anizocytóza * kostní dřeň: obvykle hypoplastická až aplastická, bývá zmnožení plazm.b. a makrofágů, megaloidní rysy, snížené množství magakaryocytů (MGK) Dysplastické anémie Dysplázie erytropoézy - porucha vyzrávání, morfologické abnormality * Vrozené (kongenitální dyserytropoetické anémie - KDA) ­ perifrní krev: často makrocytóza, anizocytóza, poikilocytóza ­ kostní dřeň: často megaloidní rysy, vícejaderné NRBC, karyorexe, interplazmatické můstky, mitózy, bývají zvýšené zásoby Fe * Získané (řadí se mezi MDS) Anemie ze zvýšené ztráty erytrocytů Sledovat: vyšetření na HA, hloubku anémie v KO,Sledovat: vyšetření na HA, hloubku anémie v KO, změnyzměny eryery (barevné, tvarové,(barevné, tvarové, inkluzeinkluze), změny), změny množstvímnožství erytrocytárníerytrocytární populace v KDpopulace v KD Korpuskulární * porucha membrány (hereditární sférocytóza, eliptocytóza, stomatocytóza, akantocytóza) * porucha metabolismu * hemoglobinopatie Extrakorpuskulární * imunitní * neimunitní Vyšetření na hemolytické anémie (HA) např.:např.: ˇˇ volný hemoglobin v plazměvolný hemoglobin v plazmě ­­ základní metodika pro vyšetřování hemolýzy v plazmězákladní metodika pro vyšetřování hemolýzy v plazmě haptoglobinhaptoglobin feritinferitin elektroforéza hemoglobinuelektroforéza hemoglobinu Speciální vyšetření: * osmotická rezistence * hemosiderin v moči * hemoglobin F * Heinzova tělíska * autohemolýza * pink test Princip základní metodikyPrincip základní metodiky ˇˇ Volný hemoglobin v plazměVolný hemoglobin v plazmě Volný hemoglobinVolný hemoglobin HbHb(Fe2+) v plazmě je(Fe2+) v plazmě je stanoven fotometricky po jeho oxidacistanoven fotometricky po jeho oxidaci nana hemiglobinhemiglobin (Fe3+) a ten se potom(Fe3+) a ten se potom pomocí kyanidu (CNpomocí kyanidu (CN--) draselného) draselného přemění na barevný komplexpřemění na barevný komplex hemiglobinkyaniduhemiglobinkyanidu, stanovitelný, stanovitelný fotometricky.fotometricky. Osmotická rezistence * Princip Stanovení odolnosti erytrocytů vůči různě koncentrovaným hypotonickým roztokům NaCl v koncentracích od 0,70 % do 0,22 % (odstupňované po 0,02 %). Jestliže jsou erytrocyty v isotonickém roztoku 0,9% NaCl, dochází na membráně buňky k rovnovážnému stavu a kapalina se nedostává ani z buňky ani do buňky. Jestliže jsou erytrocyty umístěny v prostředí hypotonického roztoku (0,70 - 0,22 % NaCl) tak buďto prasknou a dojde k hemolýze nebo se vytvoří na membráně rovnováha. Osmotická rezistence normál patologie příprava Hemosiderin v moči * Princip Fe3+ v hemosiderinu reaguje s kyselým roztokem ferrokyanidu draselného na ferrokyanid železitý, který vytváří krystalky Berlínské modři. * Hodnocení přítomnost modrých krystalů v moči ­ normální nález: negativní ­ pozitivní nález: + až +++ Hemosiderin v moči Hemoglobin F * Princip Nafixované, zaschlé nátěry se ponoří do pufru pH 3.3. Hemoglobin A (adult hemoglobin) je v buňce rozpuštěn a vyplaven, hemoglobin F (fetální hemoglobin) je ke kyselému prostředí rezistentní a v erytrocytu zůstává. Zbylý hemoglobin F se potom barví a odečítá mikroskopicky. * Hodnocení procentuelní hodnocení sytě zbarvených erytrocytů ­ novorozenci: 50 - 90 % HbF ­ věk < 2 roky: 0 - 4 % HbF ­ věk > 2 roky: 0 - 2 % HbF Hemoglobin F Heinzova tělíska * Princip Heinzova tělíska znázorňují vysrážený hemoglobin v případě, že glykolytické enzymy erytrocytů nejsou schopny zabránit oxidaci hemoglobinové molekuly. Precipitáty se jeví jako jedno nebo více oválných tělísek v erytrocytech. Objevují se těsně u buněčné membrány, ke které přiléhají, barví se supravitálně brillantcresylovou modří. * Hodnocení normalní erytrocyty jsou negativní Heinzova tělíska Vyšetření HA Fotometrická vyšetření na principu stanovení volného hemoglobinu v plazmě. * Autohemolýza Hodnocení spontánní hemolýzy v prostředí fyziologického roztoku, glukózy a ATP po dobu 48 hodin. * Pink test Hodnocení hemolýzy červených krvinek v kyselém prostředí glycerolu.