Principy vyšetření hemostazy, preanalýza FN BRNO Dělení testů dle principu * Koagulační ■>• Fotometrické * Imunochemické ■* Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) -* Sledování času rozpuštění koagula -* Sledování rozpustnosti koagula -* Jiné Dělení testů dle principu ^Koagulační ^ sledování času srážení íj manuálně (kývání, rotace) • aktivovaná doba srážení ^ sledování času vytvoření fibrinoveho vlákna • manuálně (háčkování) j koagulometr (poloautomat, automat) • mechanické • kuličkové (sledování změn pohybu kuličky) • háčkové • optické • nefelometrie (sledování rozptylu světla) • turbidimetrie (sledování průchodnosti světla) Dělení testů dle principu -> Fotometrické ^ sledování změn zbarvení v důsledku štěpení specifického chromogenního substrátu - detekce absorbance (A) j end point" (A) u kinetické (AA/min) ^É limitace -hemolytické a ikterické vzorky ^Turbidimetrické (jiné než koagulační, imunochemické) ^ sledování změn zakalení j detekce změn transmise (propustnosti T) j detekce změn absorbance ^ limitace- chylózní vzorky Chromogeny Chromogenní substrát ^ uměle připravený velkoobjemová aminokyselinové koncovka raménko zakončené Argininem bezbarvý paranitroanilid Chromogeny * Princip ^ enzymy štěpí substrát - vzniká žluté zbarvení ^ měříme při 405 nm Kinetické m e rem A 405 nm A A/min 1 min v vv ,. . . cas mereni (min) Dělení testů dle principu ^Imunochemické ^ sledování reakce antigénu s protilátkou aglutinace • LIA j ELISA jEID Aglutinační metody * sledování aglutinace viditelných částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu * odečítání makroskopicky ^ pozitivní( +, ++, +++)/negativní ^ semikvantitativní metody (udaná mez detekce) ■*• metody ^ latexaglutinační (např. FDP, D-Di) ^ hemaglutinační (např. FM) Antigen Příklad vyšetření D-Dimerů Mez detekce = 0,5 mg/l neředěný vzorek vzorek ředěný 1:6 výsledek aglutinace < 0,5 mg/l aglutinace + > 0,5 mg/l a < 3,0 mg/l aglutinace + + > 3,0 mg/l Liquid immunoassay - LIA metody * Sledování aglutinace m i kro latexových částic s navázanou protilátkou proti vyšetřovanému antigénu * Odečítání optickým systémem koagulometru ^ Změna zakalení (AA/min) * Kvantitativní metody (např. D-Di, vWF:Ag...) * Limitace ^ Chylozita vzorku ^1 HookŮV jev (vysycení protilátky antigenem) LIA testy Provedení (STA© Liatest© D-Dimer) 50 jal vzorku 100 ni pufru ' inkubace 240 s > 150 ml latexového měříme činidla změnu ^^■^^^^ absorbance mezi 12S-140S LIA testy Kalibrace ^ Sigmoidní ^ Křivka 3. řádu ^ Minimálně 5 bodů ^ Platí pro celou šarži ELISA metody ^Stanovení antigenu(Ag)pomocí protilátky (Ab) značené enzymem (AbE) - kvantitativní ^ inkubace vzorku v mikrotitračních jamkách s navázanou Ab proti vyš. Ag - vazba Ag na Ab ^ odsátí vzorku + promytí ^ inkubace AbE v jamkách - vazba na Ag ^ odsátí AbE a promytí ^ detekce enzymatické aktivity komplexu Ab-Ag -AbE po přídavku chromogenního substrátu (A) € přímá úměra: enzym, aktivita x množství Ag -<♦ Elektroimunodifúze - EID metody * vyšetřovaný antigen reaguje s protilátkou přítomnou v agarózovém gelu při elektroforéze za vzniku precipitačního píku Adélka píku je přímo úměrná koncentraci antigénu * kvantitativní metoda Princip EID kalibrace vzorky pacientů Vyšetření plazmatických proteinů * Vyšetření funkční aktivity ^ koagulační metody ^ fotometrické metody * Vyšetření antigénu ^ imunochemické metody ^ umožňují odlišení defektů j kvalitativních j kvantitativních Dělení testů ^Testy globální ^ postihují celý systém (i více) ^Testy skupinové (screening) ^ postihují určitou část koagulačního systému ^ umožňují odlišení poruch vnitřní a vnější cesty a přeměny fibrinogenu ^Testy speciální ^ vyšetřují jednotlivé složky systémů Správnost laboratorních výsledků -> Faktory ^ objektivní ^ subjektivní -> Faktory ^ preanalytické ^ analytické ^ postanalytické Preanalytické faktory * Příprava pacienta ■* Odběr vzorku * Transport vzorku * Zpracování vzorku * Skladování vzorku Příprava pacienta ^ Odběr na lačno nebo po lehké snídani bez tuků ■*• Dostatečný příjem tekutin * Uvedení času odběru * Uvedení léčby * Uvedení komplikace při odběru Odběr vzorku * Minimální zatažení paže *Do plastikových nebo silikonovaných skleněných zkumavek ^ První 2-3 ml nelze použít ■^Antikoagulační roztok pro nesrážlivou krev-citrát sodný v ředění 1:10 * Šetrné promíchání krve s citrátem (5-1 Ox) Nedostatečné promíchání krve s citrátem * Nebezpečí aktivace a srážení vzorku * Koncentrování citrátu u hladiny ^ automaty pipetují těsně pod hladinou naředěnou plazmu s nadbytkem citrátu ^ špatné výsledky ^ ověření po stažení plazmy a promíchání Antikoagulancia * Citrát sodný a 0,109 mol/l (3,2 %) doporučeno ^1 1,129 mol/l (3,8%) ■»CTAD zkumavky ^ brání aktivaci trombocytu ^ doporučeno pro testy PAI-1, heparin, PF4... Správný odběr vzorku Vyřadit vzorky * Sražené *S chybným objemem krve (rozdíl 10%) ^Hemolytické, ikterické a chylózní ^ hemolytický a ikterický vzorek j ovlivňuje výrazně fotometrická stanovení ^ chylózní vzorek j ovlivňuje výrazně koagulační stanovení na optických koagulometrech a imunochemická stanovení vyhodnocovaná opticky Správný odběr vzorku Množství krve ■»Méně ^ prodloužení koagulačních časů • APTT citlivé od 90 % objemu j PT citlivé od 80 % objemu ■»Více ^ zkrácení koagulačních časů?? Správný odběr vzorku -> Hematokrit ■>< 30 % nebo >60 % upravit objem citrátu 100 - hematokrit ml citrátu = ------------------x ml plné krve 595 - hematokrit Transport vzorku ■»Čas * Teplota * Mechanické vlivy (potrubní pošta) Zpracování vzorku * Odstranění krevních buněk centrifugací * Stažení plazmy * Většina testů do 1 -2 hod po odběru ■»Výjimka EGT, EF (15 - 30 min), heparin, PAI-1, LA, vyšetření fcí trombocytů Vyšetřovaný materiál * Plazma ^ plazma bohatá na trombocyty j centrifugace 10 minut 150 - 250 g, sedimentace ^ plazma chudá na trombocyty j centrifugace 15 minut 2500 g ^ bezdestičková plazma j dvojnásobná centrifugace + filtrace *Plná krev -> Sérum Centrifugace * Výpočet otáček pro danou centrifugu *g = 1,118 x 10"5xrxN2 r = poloměr otáčení v cm, N = otáčky/min Příklad: r = 15 cm, 2500g 3860 otáček/min Skladování vzorků ■»Laboratorní teplota 18 - 25 500 ul * Zkumavka se zátkou * Správná velikost zkumavky * Zkumavka naplněná do 3/4 ■»Rychlé zamrazení (-70 CC, -196 *C) ■»Sskladování zamrazených vzorků ^ krátkodobé -20