Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 12: Neutralizační reakce, reakce se značenými složkami Co nás dnes čeká n Budeme pokračovat v diagnostice, založené na interakci antigenu (v.případě mikrobiálních antigenů jde o povrchovou část těla mikroba) s.protilátkou (imunoglobulinem, který je tvořen makroorganismem. n Přitom můžeme prokazovat zvířecí protilátkou antigen (přímý průkaz) nebo antigenem protilátku v séru (nepřímý průkaz) Průkaz antigenu a antigenní analýza (pro připomenutí) n V rámci průkazu antigenu (tedy přímého průkazu) lze ještě dále rozlišit dva podtypy: n Přímý průkaz antigenu ve vzorku, například ve vzorku mozkomíšního moku n Antigenní analýza (identifikace) kmene, izolovaného ze vzorku (například kmene meningokoka) n U nepřímého průkazu naopak vždy pracujeme se vzorkem, a to se vzorkem séra, kde hledáme protilátky A ještě trochu opakování: Interpretace n Průkaz antigenu (včetně antigenní analýzy) je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v.těle pacienta n Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: n Množství protilátek (titr) a hlavně jeho změna n Třída protilátek: IgM/IgG n Avidita protilátek – síla vazby na antigen Jak tyto informace zjistit n Čerstvá infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně i IgA n Pacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) Vzestupy a poklesy titru Proč nestačí samotný titr Někdy se stane, že málo reaktivní pacient má i v.akutní fázi titr dosti nízký Párová a nepárová séra n Párová séra = první vzorek je uchováván v.ledničce, dokud nepřijde i druhý. Pak jsou oba hodnoceny naráz. Čtyřnásobný vzestup se v tom případě má za signifikantní pro akutní infekci. Bohužel párová séra nejsou běžná. n Séra nejsou párová (druhý vzorek je vyšetřen zvlášť): zvětšuje se riziko náhodné, chyby, proto zpravidla vyžadujeme osminásobný vzestup titru. Tyto údaje jsou však pouze orientační a liší se případ od případu. Pořád musíte mít na paměti: n Veškeré „srandičky“ typu titry, třídy protilátek, zjišťování avidity, slouží k.odlišení akutní infekce, chronické infekce a stavu po dávno prodělané infekci. Týkají se ovšem pouze nepřímého průkazu! n Přímý průkaz totiž přímo prokazuje v těle pacienta část patogenova organismu. Není tedy nutné žádné další upřesnění Typy serologických reakcí a jejich způsoby využití Neutralizace n Klasické, ale stále používané reakce n Napodobují přirozenou funkci protilátek (protilátky blokují cytopatický či „erytrocytopatický“ efekt viru či toxinu) n Hodí se jen u některých infekcí (virové infekce, infekce toxickými bakteriemi) n Princip je jednodušší než u KFR Neutralizační reakce: obecný princip n Protilátky fungují několika způsoby. Jeden z nich je přímá neutralizace. n Tento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů Nicméně někdy protilátky neutralizují i určitou charakteristiku celé bakterie, např. pohyblivost Treponema pallidum u tzv. Nelsonova testu (TPIT). Neutralizace schématicky n Protilátka (Ig) brání efektu toxinu/viru na buňku / krvinku n Příklad: ASLO (Toxin = streptolyzin O, Ig = antistreptolyzin O, krvinka) Příklady neutralizačních reakcí Příklad 1: ASLO n Protilátka (ANTISTREPTOLYZIN O) blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzinu O) na krvinku. n ASLO není nepřímý průkaz, přestože hledáme protilátky. Nepátráme tu po patogenovi, určujeme samotné protilátky, jež mohou být nebezpečné n U ASLO neužíváme geometrickou řadu. Hodnoty ředění jsou speciální. n Titr nad cca 250 znamená možnost autoimunitní odpovědi Proč se dělá ASLO n Pomocí testu ASLO zjistíte, zda je přítomna normální protilátková odpověď, nebo přemrštěná automimunita s rizikem vývoje glomerulonefritidy nebo revmatické horečky n Test ASLO se provádí zpravidla po prodělané streptokokové infekci. Průkazem protilátky se nesnažíme prokázat infekci (o té víme), ale zjistit, zda dochází k vývoji autoimunity. Nejde tedy vlastně o nepřímý průkaz, přestože prokazujeme protilátky. ASLO: princip Hodnocení ASLO n Panel se odečítá naležato. První řádek prvního panelu je pozitivní kontrola, dále má každý pacient jeden řádek n Nejvyšší ředění se zábranou hemolýzy (pozitivní reakce, projeví se sedimentací erytrocytů) je titr n Titry cca 225 – 270 jsou hraniční, vyšší jsou pozitivní, nižší jsou negativní. Úplná absence protilátek znamená, že se pacient se streptokokovou infekcí nesetkal Příklad 2: HIT n Hemaglutinačně Inhibiční Test n Pozor, tohle NENÍ aglutinace, je to druh neutralizace! n Protilátka neutralizuje virové shlukování krvinek (in vitro vlastnost většiny virů) n Pozitivní reakce = zábrana virového shluknutí à erytrocyty klesají na dno důlku n Negativní reakce = viry se shluknou n Vypadá to jako hemaglutinace naruby Zapamatujte si: n HIT není aglutinace, ale neutralizace virového shlukování krvinek n HIT se liší od reakce ASLO především tím, že krvinky nejsou hemolyzovány, ale shlukovány. Stejné je naopak to, že specifická protilátka dokáže příslušnému efektu zabránit n HIT v našem příkladu je „už zase“ klasický nepřímý průkaz (na rozdíl od ASLO) Příklad 3: VNT (nepleťte si to s TNT J ) n Virus Neutralizační Test n Viry lze pěstovat na buněčných kulturách. Jsou to buněčné linie většinou embryonálních či nádorových buněk n Buněčná kultura bývá poškozena účinkem virů. Škodu můžeme pozorovat např. jako n změnu morfologie buněk v kultuře n změnu metabolismu à změna pH  změna zbarvení v důlku (při použití indikátoru) n Jsou-li přítomny protilátky, mohou tomuto vlivu na buňky zabránit Průběh protilátkové odpovědi – opakování n Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce n Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou Protilátky ostatních tříd n Protilátky třídy IgA se u některých infekcí vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální) n Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a infestací červy. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi n S protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje Reakce se značenými složkami n Na povrch se postupně navazují jednotlivé složky n Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje n Je-li to pravda, složka se naváže n Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec n Na konci řetězce je vhodné značidlo Promytí a jeho význam n Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní n Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch n Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení Průběh pozitivní reakce (možnost se třemi složkami – mohou být jen dvě) Průběh negativní reakce (možnost se třemi složkami) Průběh negativní reakce (možnost se třemi složkami) Typy značidel n Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence n Radioizotop je značidlem u reakce RIA n Enzym je značidlem u reakce ELISA n Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc. ELISA – proč je tak oblíbená n U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. n Nenáročnost z hlediska nákladů a nulové radiační nebezpečí je výhodou oproti radioimunoassayím n Možnost automatizace je velkou výhodou oproti imunofluorescenci ELISA – praktické provedení n Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry n Před vlastními důlky pacientů mohou být důlky: n Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) n K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola n Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s.právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) Vždy záleží na konkrétní reakci ELISA a jejím provedení. Někdy chybí blank, někdy není cut off přímo obsažen v.destičce, ale počítá se jako průměr negativních kontrol + konstanta. ELISA – ukázka (www.medmicro.info) Western blotting n Název – slovní hříčka (badatel Southern) n Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty n Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů Western blot – vzhled (obrázek z www.medmicro.info) Možnosti uspořádání složek bleděmodře vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta n Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) n Povrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) n Povrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) n Povrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) Konjugát je protilátka namířená proti lidské protilátce Význam konjugátu n Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) n Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG n Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky n Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek ELISA k detekci protilátky: 1. Pozitivní (hledá se IgM, IgM přítomna) Všechny složky se postupně navazují. Dojde k.enzymatické reakci – změně barvy v důlku ELISA k detekci protilátky: 2. Negativní I (hledá se IgM, žádné protilátky) V séru pacienta nejsou protilátky. Konjugát je odplaven, v důlku není žádná změna. ELISA k detekci protilátky: 3. Negativní II (hledá se IgM, přítomny IgG) V séru pacienta jsou jen IgG protilátky. Konjugát je odplaven, ke změně barvy důlku nedojde Imunofluorescence Přímá imunofluorescence n (Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) Nepřímá imunofluorescence n (Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce) Imunofluorescence schematicky ELISA, průkaz antigenu n U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá n Intenzitu zbarvení lze měřit spektrofotometricky n Za pozitivní se považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ n Například se u konkrétní se cut off může počítat třeba jako n (A1 + B1 + C1)/3 + 0,050 ELISA, průkaz protilátek n U nepřímého průkazu reakcí ELISA se zpravidla hodnotí zvlášť protilátky IgM a IgG n V daném případě se místo IgA používá IgM n Za pozitivní se opět považují hodnoty vyšší než referenčně daný tzv. „cut off“ n Takže se například použije vzorec (B1 + C1)/2 + 0,320 v případě IgA, resp. (B3 + C3)/2 + 0,320 v případě IgG n Výsledky mezi 90 % a 110 % cut off se často hodnotí jako „hraniční“, pod 90 % jako „negativní“, nad 110 % jako „pozitivní“ Přeji Vám hezký zbytek dne… (Obraz s názvem Protilátka)