Lékařská mikrobiologie Alena Ševčíková OKM, FN Brno 8.9.2008 Plán přednášek – zimní semestr • 8.9.08 - stručná historie mikrobiologie, základní vlastnosti baktérií, morfologie, fyziologie, druhy kultivace, typy kultivačních půd • 9.9.08 - mikroby a prostředí, dezinfekce, sterilizace, základy epidemiologie, bezpečnost práce v laboratoři • 10.9.08 - mikroby a makroorganismus, patogenita a virulence, průběh a formy infekce, základy klinické mikrobiologie Plán přednášek – zimní semestr • 11.9.08 – odběr, zasílání a zpracování infekčního materiálu, vyšetřovací metody v bakteriologii • 12.9.08 – základy imunologie, obecná virologie, virologické a sérologické vyšetřovací metody • 14.11.08 – rezistence, antibiotika, vyšetřování citlivosti • 28.11.08 – grampozitivní koky Mikrobiologie • Mikrobiologie (z řeckého micron = malý, biologia = studium života) je věda studující mikroorganismy Virologie – 20 - 200nm Bakteriologie - 1 μm Mykologie - cca 10 μm Parazitologie – 10 -150μm Virus • nejjednodušší živý útvar • bez buněčné stavby • obsahuje jediný typ NK (DNA nebo RNA) • množí se syntézou svých složek, nikoliv dělením • v této syntéze je závislý na ribosomech hostitelské buňky • priony - proteinové infekční částice, vyvolávající některá onemocnění CNS Bakterie, Archea • buňky prokaryotické • vždy jednobuněčné, netvoří tkáně • nukleoid (bakteriální obdoba jádra) –není obalen membránou • neobsahuje mitochondrie, ani endoplasmatické retikulum • součást buněčné stěny je peptidoglykan Buňky eukaryotické • Kvasinky a plísně • Jednobuněční prvoci, vícebuněční příživníci, členovci a červi (blecha, veš) • Rostliny • Živočichové Stručná historie • Mikroorganismy jsou všudypřítomné a jejich stáří je odhadováno na 3,5 miliardy let • Teprve před 2 miliardami let se objevily složitější formy života • Dinosauři vymřeli před 65,5 miliony let Stručná historie • Lidé již ve starověku tušili, že některé choroby jsou infekční a podezřívali z přenosu „neviditelné tvorečky“ Stručná historie Stručná historie Stručná historie • 1676 Antony van Leeuwenhoek sestrojil jednoduchý mikroskop a pozoroval „malá zvířátka“ v hlenu svých zubů • 1796 Edward Jenner zavedl očkování proti pravým neštovicím Stručná historie • Ignác Semmelweis (1818-1865) mytí rukou • 1857 Louis Pasteur zformuloval teorii, že zkvašení vína je způsobeno mikroby a předpokládal, že stejným způsobem by mikroby mohly vyvolávat choroby a současně s Robertem Kochem prokázali • 1876, že sněť slezinná může být vyvolána experimentálně vstříknutím bakterie Bacillus anthracis do těla zvířat Stručná historie • Joseph Lister 1827 – 1912 začal operovat pod sprškou kyseliny karbolové, aby zamezil infekci ran mikroby ze vzduchu - antisepse Érou Louise Pasteura a Roberta Kocha nastalo období označované jako zlatý věk mikrobiologie • Louis Pasteur (1822 – 1895) – očkování proti vzteklině, sněti slezinné, choleře drůbeže – příčina kvašení piva a vína, pasterizace – kultivace bakterií v tekutých půdách – objevil mikroby vytvářející spóry, anaeroby • Robert Koch (1843 – 1910) – zavedl izolaci čistých kultur na pevných půdách, barvení bakterií a mikrofotografii – podílel se na objevu původce cholery a izoloval původce tuberkulózy • Podle metod a postupů zavedených Pasteurem a Kochem byla postupně objevena většina původců bakteriálních infekcí • Zakladatelem virologie je považován Ivanovskij, který v roce 1892 popsal přenos mozaikové choroby tabáku • 1898 – objeven první živočišný virus • 1911 – první lidský virus, žlutá zimnice • 1915 – viry bakterií 1900 - 2000 Mikrobiologie – lékařská – zabývá se mikroorganismy, které jsou patogenní pro člověka, vyvolávají u něj onemocnění nebo se u člověka přirozeně vyskytují – veterinární – potravinářská – mikrobiologie potravin, jejich konzervace, využití v potravinářských technologiích Taxonomie věda zabývající se rozdělením a zařazením organismů podle určitých pravidel • Počet nově popisovaných mikroorganismů vzrůstá a je třeba je pojmenovat, uspořádat na základě vzájemných vztahů do taxonomických skupin a nově izolovaný kmen řádně identifikovat a zařadit do známého pojmenovaného taxonu Součástí taxonomie – Nomenklatura – názvosloví – Klasifikace - třídění – Identifikace – určování Klasifikace - třídění • Uspořádání mikroorganismů na základě vzájemných vztahů do taxonomických skupin, taxonů • Základním taxonem je bakteriální druh (species) –soubor kmenů sdílejících stálé vlastnosti a lišící se od kmenů jiné skupiny • Kmen je populace mikrobů pocházející z jediné mikrobiální buňky Nomenklatura – názvosloví • Pojmenování taxonu podle mezinárodně dohodnutých pravidel • Název bakterií se skládá ze jména rodového (rod, genus) a jména druhového (druh, species) – Streptococcus pyogenes – Rickettsia prowazekii – Kocuria kristinae, Yersinia aldovae Identifikace – určování • Postup, kterým zjistíme, že nově izolovaný kmen náleží do známého, pojmenovaného taxonu – morfologické znaky (tvar, velikost, uspořádání, barvitelnost buněk, vzhled kolonií) – fyziologické znaky (tvorba nebo štěpení různých sloučenin) – chemotaxonomické znaky (složení buněčné stěny, analýzy mastných kyselin) – genetické znaky a molekulární vlastnosti Základní morfologie bakterií • Velikost – většina patogenů 0,5 – 3 μm • Tvar a uspořádání – koky ve dvojicích, řetízcích, shlucích, tetrádách – tyčinky – spirály • Barvitelnost dle Grama – grampozitivní - modré – gramnegativní – červené • dle acidorezistence Streptococcus sp. - Staphylococcus sp. Stavba bakteriální buňky • Cytoplasma buňky obsahuje – nukleoid-jaderný ekvivalent, cirkulární DNA – ribosomy a inkluzní tělíska, vakuoly, – Plasmidy – malé molekuly DNA • Cytoplasmatická membrána • Buněčná stěna • Polysacharidová pouzdra nebo slizová vrstva – glykoprotein, chrání před fagocytózou • Bičíky – orgány pohybu a fimbrie – adheze bakterií k epitelu Cytoplasmatická membrána • Složena z dvojité vrstvy fosfolipidu a různých bílkovin • Bílkoviny se uplatňují – v transportu živin do buňky – v respiračních pochodech – v syntéze některých složek membrány, stěny i slizové vrsty – v sekreci látek z cytoplasmy do zevního prostředí (bakteriální toxiny, extracelulární enzymy) Buněčná stěna • Silná tuhá vrstva odolávající osmotickému tlaku a umožňující bakterii uchovat svůj tvar • Stěna grampozitivních bakterií je jednodušší a tvoří ji mohutná 20 nm silná peptidoglykanová struktura, protkaná řetězci kys.teichoové Buněčná stěna • Stěna gramnegativních je tenčí, ale složitější 15 nm – tenký peptidoglykan, proteiny tvořící poriny ve fosfolipidové dvojvrstvě, lipoproteiny, lipopolysacharidy, periplasmatický prostor (endotoxin, O antigen) Vnější vrstvy • Polysacharidové pouzdro (pneumokoky, klebsiely, hemofily) • Polypeptidové pouzdro (anthrax) • Slizová vrstva (Streptococcus mutans, koaguláza negativní stafylokoky) – biofilm • Bakteriální bičíky • Pili, fimbrie Bakteriální spory • Rody Bacillus a Clostridium reagují na vysychání či úbytek živin tvorbou spor – vysoce odolné útvary, mohou přežívat stovky let při nepříznivých podmínkách • Bakteriální endospory nepřijímají Gramovo barvivo – světlolomné útvary • Tvar, velikost a uložení spor jsou někdy typické pro různé druhy Clostridium tetani Odolnost spor • Vůči teplu, UV záření, vysychání, některým desinfekčním prostředkům (ethanol, fenol) • Spory jsou ničeny – Clostridium tetani při 100^o C za 90 min – C.botulinum Autoklávováním při tlaku 2 atm (121^o C) za 20 min – Oproti tomu vegetativní buňka – je zničena při 70^o C za 10 min Metabolismus bakterií • Katabolismus – štěpením složitějších sloučenin vzniká adenosintrifosfát (ATP) slouží jako pohotový zdroj energie • Anabolismus – biosyntéza • Většina procesů je katalyzována enzymy, které snižují aktivační energii chemických reakcí, aby probíhaly dostatečně rychle a nedošlo k narušení vnitřního prostředí Zdroj energie • Přeměna energie slunečního světla na energii chemickou - fototrofy - sinice • Získávání energie oxidací redukovaných látek chemotrofy – Bakterie redukující látky anorganické (chemolitotrofy) bakterie sirné a železité – Bakterie redukující látky organické (chemoorganotrofy) – patogeny Katabolické procesy – získávání energie • Fermentace – kvašení – bez přítomnosti kyslíku, proces je anaerobní – Alkoholové, mléčné, propionové • Respirace – uvolněné elektrony jsou přenášeny na dýchací řetězec Krebsova cyklu na cytoplasmatické membráně, proces je aerobní za přístupu vzduchu (po energetické stránce vydatnější) kyslík je konečným příjemcem elektronů – Výroba octa, kyseliny citronové • Obligátní intracelulární parazité – nedovedou sami získávat energii, potřebují živou hostitelskou buňku – viry, chlamydie Rozdělení mikrobů podle vztahu ke kyslíku • Aeroby: Pseudomonas, Vibrio, Mycobacterium • Anaeroby: – Obligátní,(striktní):Clostridium haemolyticum, Clostridium difficile – aerotolerantní: Clostridium perfringens • Fakultativní anaeroby: většina, např. enterobakterie, stafylokoky, enterokoky • Mikroaerofilní mikroby: lactobacily, kampylobaktery • Kapnofilní: zvýšená tenze C0^2: meningokoky, gonokoky Termostaty Anaerostaty Biosyntéza • Zdroj uhlíku – organické sloučeniny (monosacharidy, disacharidy, škrob, glykogen, pektin, chitin, celulóza, lipidy, proteiny, nukleové kyseliny • Zdroj dusíku – vzdušný N[2], amoniak • Síra, fosfor • Mg, Ca, K – vysoké koncentrace • Mn, Zn, Mo, Se, Co, Cu – stopové prvky • Růstové faktory – vitaminy, aminokyseliny Bakteriální růstový cyklus • Růst buňky – koordinovaná tvorba makromolekul a buněčných složek – po dosažení určité velikosti (iniciační perioda) je zahájena replikace chromosomu, vzniknou dvě kruhové molekuly dvojřetězcové DNA • Tvorba septa • Dělení buňky – každá dceřinná buňka získává svou kopii DNA a polovinu cytoplasmatického obsahu Generační doba • Délka růstového cyklu, je doba, za kterou se počet bakterií zdvojnásobí • Její délka je individuální vlastností buňky a závisí také na množství živin • Generační doba u Escherichia coli za optimálních podmínek je při 37^o C 20min, při 30^o C jedna hodina • Generační doba u Mycobacterium tuberculosis je 12 hodin Bakteriální růstový cyklus • Stacionární růstová křivka – Lag-fáze – Logaritmická, exponenciální fáze – Stacionární fáze – Fáze odumírání • Kontinuální kultivace – udržení populace v logaritmické fázi růst – v průmyslové mikrobiologii – růst bakterií v zažívacím traktu Typy růstu • Planktonický růst – v podobě izolovaných buněk Typy růstu • Růst bakterií v podobě biofilmu – Biofilmy jsou strukturovaná mikrobiální společenství, uložená v mezibuněčné hmotě a adherující k inertním i živým povrchům – Jsou více chráněny proti vysychání, desinfekčním látkám, ale také proti účinku fagocytů, protilátek a antibiotik Vznik biofilmu • Na umělých materiálech: intravenozní katetry, umělé srdeční chlopně, kloubní náhrady, nitroděložní tělíska, močové katetry (koagulázanegativní stafylokoky, Staphylococcus aureus, aktinomycéty) • Zubní povlak, zubní kaz, záněty středního ucha, osteomyelitida, zánět žlučových cest, endokarditida, záněty plic při cystické fibróze Podmínky pro kultivaci mikroorganismů • Voda – 80 % živé bakterie, 15% u spor – Nejvíce citlivé na vyschnutí jsou neisserie (gonokok) – Odolnější jsou zástupci kožní flóry – Původce tuberkulózy – vydrží několik týdnů – Vysoce odolné – nokardie, aktinomycety – půdní, plísně, spory, cysty prvoků, vajíčka červů Podmínky pro kultivaci mikroorganismů • Teplota – Minimální, optimální, maximální růstová teplota – Teplotní rozmezí růstu • 20-40^o C – většina lékařsky významných bakterií – Nejužší teplotní rozmezí má gonokok 30-38,5^o C – Schopnost množit se při 0^o C mají listerie, yersinie – Schopnost množit se při 8^o C mají salmonely, zlaté stafylokoky – Kolem 45^o C ještě rostou salmonely, kampylobaktery, Bacillus cereus Podmínky pro kultivaci mikroorganismů • Teplota optimální – 0 - 20^o C psychrofily – nepatogenní mikroby, žijící ve vodě a půdě – 20 - 40^o C mesofily – většina mikrobů významných pro lékařskou mikrobiologii – Nad 40^o C termofily, horké prameny, kompost, chlévská mrva, nepatogenní, Archaea – Nad 80^o C hypertermofily, podmořské sopečné oblasti, Archaea Podmínky pro kultivaci mikroorganismů • Hydrostatický tlak – Stoupá o 1atm na 10m vody – Do hloubky 2000m převažují mikroorganismy barotolerantní – V extrémních hloubkách žijí barofily Podmínky pro kultivaci mikroorganismů • Osmotický tlak – Většinou v hypotonickém prostředí chrání nikroby pevná buněčná stěna – V hypertonickém prostředí ztrácejí vodu, přestávají se množit, podléhají plasmolýze (princip konzervace potravin pomocí soli, cukru) • enterokoky tolerují 6,5% NaCl, stafylokoky 10% • Vibria bez přídavku 1% NaCl většinou nevyrostou Podmínky pro kultivaci mikroorganismů • Koncentrace vodíkových iontů – Většinou je optimální pH neutrální pH6-pH8 – Vibrio cholerae – vyhovuje zásadité prostředí pH 7,4 – 9,6, při kyselém rychle hynou – Enterokoky jsou vysoce tolerantní pH 4,8 – 11 – Při kultivaci v uzavřeném systému vznikají metabolity převážně kyselé, po vyčerpání nárazníkové kapacity růst se mikroorganismů zastavuje Podmínky pro kultivaci mikroorganismů • Oxidoredukční potenciál – Odráží poměr mezi oxidovanými a redukovanými látkami v daném prostředí – Oxidované prostředí vyhovuje aerobům, i když při svém metabolismu redox potenciál snižují a umožňují množení anaerobů – Anaeroby vyžadují redukované prostředí, nízký redox potenciál Pěstování bakterií • Tekuté kultivační půdy (Pasteur, Koch) • Kultivace na pevných agarových půdách (Walter Hesse) • 1887 Richard Petri zavedl skleněné misky s plochým víčkem – Petriho misky • 1914 – první komerčně připravované sušené kultivační půdy Podmínky pěstování bakterií • Dostatek vody, živin, růstových faktorů, optimální teplotu, vhodné složení atmosféry, odpovídající redox potenciál, optimální pH, vhodný osmotický tlak, ochrana před zářením, sterilita prostředí a jeho ochrana před kontaminací ^• Termostaty – většinou při 37^oC, vlhkost, případně se zvýšenou tenzí CO^2 • Anaerostaty Druhy kultivačních půd • Tekuté půd – Různé druhy bujónů (masopeptonový bujón, thioglykolátový bujón) • Použití k pomnožení malého množství mikrobů • Zákal, sediment, blanka – Cukrové půdy • Štěpením substrátu dochází ke změně pH roztoku a ke změně barvy přidaného indikátoru Druhy kultivačních půd • Pevné půdy - ztužení původně tekutého základu přidáním 1-2% agaru, (5%) • Výhoda - pěstování mikrobů v izolovaných koloniích • Bakteriální kolonie je společenství buněk vzniklé z původně třeba z jedné životaschopné mikrobiální buňky • Viditelnou kolonii tvoří několik set miliard buněk • Rozočkováním jedné kolonie získáme čistou mikrobiální kulturu Staphylococcus aureus na krevním agaru Znaky bakteriální kolonie • Velikost – v mm • Tvar – kulatý, laločnatý, plazící se • Profil – plochý, vypouklý, miskovitý • Okraje – rovné laločnaté • Povrch – hladký, drsný, lesklý, matný • Transparence – (ne)průhledná • Barva – bílá, žlutá, bezbarvá • Změny v okolí – zbarvení, hemolýza • Konsistence – hlenovitá, drobivá, vrůstající do agaru • Zápach – po jasmínu, Escherichia coli na MacConkey agaru Plazivý růst Protea hauseri a izolované kolonie Escherichia coli Typy půd • Základní – bujón, peptonová voda • Obohacené – krevní agar, čokoládový agar, Bordet-Gengouova půda (Bordetella pertussis, parapertusis), Šulova půda (nykobakteria) • Selektivní – obsahují inhibitor zabraňující růstu nežádoucí flóry, KA s 10% NaCl (stafylokoky), selenitová půda (salmonely), alkalická peptonová voda (vibria), antibiotické disky: bacitracin (hemofily), vankomycin-colistin (meningokoky) Černé kolonie vankomycin rezistentního enterokoka na selektivní půdě Campylobacter sp. na selektivní půdě Typy půd • Diagnostické půdy – sledujeme, zda mikrob dokáže využít přidaný substrát, – štěpení cukrů, např. glukozy, – Desaminace fenylalaninu (proteus) – Dekarboxylace aminokyselin (lysin, arginin, ornithin) – Štěpení močoviny, redukce nitrátu, – Tvorba H2S, indolu, acetoinu, využití citrátu – Průkaz enzymu - katalása, oxidáza, Pyr-test, ONPG – Chromogenní půdy, kombinované půdy Hajn, – Pestrá řada, komerční soupravy, Charakteristické znaky Salmonella sp. na půdě dle Hajna a na půdě dle Švejcara Identifikace 4 kmenů enterobakterií na Enterotestu 24 (Lachema) Chromogenní půda (žlutě roste Proteus sp., červeně Escherichia coli, modře Klebsiella sp.) Typy půd • Selektivně diagnostické – kombinují vlastnosti půd selektivních a diagnostických – Pro gramnegativní mikroby • Endova, MacConkeyho, XLD, SS, CIN, TCŽS – Pro grampozitivní mikroby Claubergova půda (původce záškrtu) • Slanetzův-Bartleyho agar (enterokoky) – Pro anaerobní kultivaci • VL bujón, thioglykolátový, Schaedlerův Salmonella sp. rostoucí na Endově půdě (průhledné kolonie) a na XLD (černě) Typy půd • Půdy ke zjišťování testů citlivost – MH – agar (Muellerův-Hintonové) – MH - bujón • Půdy k uchovávání kultur – Glycerolový sérový bujón • Půdy transportní – Amies Testy citlivosti Děkuji za pozornost