Serologické vyšetřovací metody Jana Bednářová OKM, FN Brno Serologické reakce Přímý průkaz ü průkaz antigenu ü průkaz nukleové kyseliny Nepřímý průkaz ü průkaz protilátek Nepřímý průkaz = průkaz specifických protilátek neboli průkaz serologický • serologické reakce – reakce mezi antigeny a protilátkami in vitro • Materiál: 5 - 7 ml srážlivé krve, likvor, punktát Přehled serologických metod • Precipitace • Aglutinace • Komplement fixační reakce (KFR) • Neutralizace • Reakce se značenými složkami: - imunofluorescence - enzymová imunoanalýza - Western blot (imunoblot) Precipitace • antigen koloidní povahy • precipitační neboli vločkovací testy na lues • VDRL, RRR, RPR kardiolipin + protilátky v séru precipitace Aglutinace • antigen korpuskulární povahy • antigen + hledaná protilátka viditelný shluk (aglutinát) • přímá, nepřímá (na nosičích) • průkaz protilátek u salmonelózy (Widalova reakce), yersiniózy, listeriózy, tularémie Aglutinace na nosičích • antigen navázaný na vhodnou částici: ü latex – latexová aglutinace ü erytrocyt – pasivní hemaglutinace • TPHA – T. pallidum hemagglutination Komplement fixační reakce ü komplex antigen + hledaná protilátka ü komplement ü indikátorový neboli hemolytický systém (beraní erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou) zábrana hemolýzy hemolýza pozitivní reakce negativní reakce Neutralizační reakce • protilátka brání biologickým účinkům antigenu • ASLO – průkaz antistreptolyzinu O přítomnost ASLO ve vyšetřovaném séru zábrana hemolýzy pozitivní reakce Imunofluorescence • jedna složka značena fluorescenčním barvivem, průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu • přímá – průkaz antigenu: T.pallidum • nepřímá – průkaz protilátek: syfilis, ehrlichióza, HHV6 Enzymová imunoanalýza • jedna složka značena enzymem, který rozloží přidaný substrát za vzniku barevného produktu • Výsledek: barevná reakce • Hodnocení: měření absorbance • ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) • průkaz antigenu: HBsAg, respirační viry, chlamydie • průkaz protilátek: univerzální použití Princip metody ELISA Western blot Antigen rozdělený na jednotlivé polypeptidy dle molekulové hmotnosti na nitrocelulózovém pásku • vazba hledaných protilátek ze séra na příslušné antigenní frakce • přidání protilátky značené enzymem • přidání substrátu • výsledná reakce – barevný proužek Interpretace serologických výsledků • průkaz protilátek svědčí pro setkání s antigenem (kdy ?), k diagnóze infekce většinou nestačí • vyjímka: syfilis, infekce HIV • dynamika imunitní reakce: setkání s antigenem průkaz protilátek • IgM – první protilátky, přetrvávají týden až několik měsíců, svědčí pro čerstvou infekci • IgA – přetrvávají o něco déle, svědčí pro čerstvou nebo nedávnou infekci • IgG – nejvyšší hladina měsíc po začátku onemocnění, mohou přetrvávat roky Serologický průkaz infekce • vyšetření dvou vzorků séra: akutní na začátku onemocnění, rekonvalescentní za 10 až 14 dní • průkazný nález: čtyřnásobný vzestup titru nebo serokonverze • vzorky nutno vyšetřit zaráz ! titr protilátek = nejvyšší ředění, v němž ještě došlo k prokazatelné serologické reakci PCR • polymerázová řetězová reakce • přímý průkaz NK bakterií, virů, kvasinek, parazitů • různé modifikace • výhody: vysoká specificita, rychlost, ATB nejsou kontraindikací vyšetření • nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace Princip PCR • opakované cykly tří jednoduchých reakcí: – denaturace dvojšroubovice hledané DNA na dvě izolovaná vlákna (94 °C) – annealing - připojení dvou krátkých syntetických nukleotidů (primery) na tato vlákna (54 – 65 °C) – prodlužování primerů v přítomnosti vhodných reakčních složek a enzymu Taq-polymerasy za vzniku dvou kopií hledané DNA (72 °C)