Vyšetřovací metody v bakteriologii Jana Juránková OKM FN Brno Vyšetřovací metody v mikrobiologii • Přímý průkaz – průkaz přítomnosti bakterií nebo virů– bakteriologie, virologie • Nepřímý průkaz – průkaz reakce makroorganizmu na přítomnost bakterií nebo virů - sérologie Vyšetřovací metody v bakteriologii • Mikroskopie • Kultivace • Průkaz antigenů • Průkaz metabolitů • Průkaz nukleových kyselin Mikroskopie • Preparát nativní • Preparát barvený – Monochromatické barvení – Barvení podle Grama – Barvení podle Giemsy – Barvení podle Ziehl – Nielsena – Barvení spor – Barvení pouzder – Fluorescenční barvení Nativní preparát • Suspenze materiálu nebo kultury ve fyziologickém roztoku • Pro pozorování živých mikroorganizmů, posouzení jejich pohyblivosti • 100 – 400násobné zvětšení Nativní preparát - využití • Bakteriologie – sledování typického pohybu bakterií (listerie) • Parazitologie – průkaz střevních parazitů ve stolici • Mykologie – sledování růstu a množení kvasinek Nativní preparát Barvení podle Grama • Hans Christian Joachim Gram, 1884 • Dělí bakterie do dvou základních skupin – Grampozitivní G +, modrofialové – Gramnegativní G -, růžovočervené Barvení podle Grama • Barvitelnost podle složení buněčné stěny • Fixace plamenem • Postup barvení: – Krystalová violeť – 20 s – Lugolův roztok – 20 s – Oplach vodou – Odbarvení acetonalkoholem – 10 s – Safranin – 1 min Barvení podle Grama • Mikroskopie při 1000násobném zvětšení • Pozorování pomocí imerzního oleje mezi preparátem a objektivem Barvení podle Grama Grampozitivní Barvení podle Grama Gramnegativní Barvení podle Grama Význam • Diagnostické barvení – základ klasifikace a taxonomie bakterií • Možnost okamžité a racionální antibiotické terapie Barvení podle Giemsy • Původně podle Giemsy – Romanovského • Slouží k diferenciaci buněčných struktur • Použití hlavně v parazitologii – Mikrobiální obraz poševní – průkaz Trichomonas vaginalis • Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů • Fixace metanolem Barvení podle Giemsy • Azur a eosin rozpuštěný ve směsi glycerinu a metanolu • Ředěn neutrální destilovanou vodou • Roztok není stabilní, používá se vždy čerstvý Barvení podle Giemsy Barvení podle Ziehl - Nielsena • Barvení acidorezistentních tyčinek – Špatně barvitelné – Vysoký obsah lipidů v buněčné stěně • Nejčastěji Mycobacterium sp. Barvení podle Ziehl - Nielsena • Fixace teplem • Barvení karbolfuchsinem • Zahřátí • Odbarvení kyselým alkoholem • Oplach • Dobarvení malachitovou zelení Barvení podle Ziehl - Nielsena Barvení pouzder • Pouzdra pevně lnou k buněčné stěně • Faktor virulence • Nepřijímají běžná barviva • Negativní barvení tuší • Na tmavém pozadí světlé dvorce pouzder • Význam pro posouzení virulence bakterií (pneumokoky) Negativní barvení Fluorescenční barvení Pomocí fluoreskujícího barviva • Imunofluorescence – Na hledaný antigen se naváže protilátka označená fluoreskujícím barvivem • Pozorování pomocí fluorescenčního mikroskopu Fluorescenční barvení Kultivační průkaz • Základní mikrobiologický postup • Cílem je získat mikroba z klinického materiálu v čisté kultuře • Identifikovat ho • Určit citlivost k antimikrobním přípravkům Kultivační půdy • Dělení podle konzistence – Tekuté – k pomnožení bakterií – Polotuhé – ke sledování pohybu bakterií – Tuhé, pevné Kultivační půdy • Dělení podle funkce – Základní – masopeptonový bujon, krevní agar – Diagnostické – obsahují látky, které se mění vlivem metabolizmu bakterií (např. štěpení laktózy) – Selektivní – k výběrovému růstu bakterií, obsahují látky, které potlačují některé bakterie – Selektivně diagnostické Kultivační půdy • Dělení podle funkce (pokračování) – Transportní - k transportu bez množení – umožňují přežití bakterií při transportu – Pomnožovací – tekuté, k pomnožení bakterií ve vzorku, mohou být i selektivní Podmínky kultivace • Dostatečná vlhkost prostředí • Optimální teplota - 37° C (4° C, 40° C) • Optimální pH půdy – 7,2 – 7,4 • Vhodná izotonie média – 0,5 – 1% NaCl • Dostatek vhodných živin • Vhodné plynné prostředí Dělení bakterií podle vztahu ke kyslíku • Striktně aerobní • Fakultativně anaerobní • Striktně ananerobní • Anaerobní aerotolerantní • Mikroaerofilní • Kapnofilní Anaerostat Nádoba pro anaerobní kultivaci Termostat se zvýšenou tenzí CO[2] Kultivační půdy • Masopeptonový bujon • Krevní agar • Čokoládový krevní agar • Levinthalův agar • Endova půda • Sabouraudův agar • Desoxycholát – citrátový agar • Chromagary Pomnožovací bujóny Krevní agar Krevní agar a Endova půda Endova půda Masopeptonový bujón Chromagar Identifikace bakterií • Podle morfologie • Podle růstových vlastností • Podle biochemických vlastností – Selektivní půdy – Komerční diagnostické soupravy • Podle antigenní struktury – Latexová aglutinace Biochemické určení bakterií Biochemické určení bakterií Stanovení citlivosti na antibiotika • Disková difúzní metoda – Difuze antibiotik z disků do půdy a zábrana růstu bakterií • Diluční testy – Stanovení koncentrace antibiotika, která je ještě na mikroba účinná Disková difúzní metoda Diluční metoda Průkaz antigenů z materiálu • Latexová aglutinace • Rychlá vyšetřovací metoda např. mozkomíšního moku Latexová aglutinace Průkaz metabolitů • Těžko kultivovatelné bakterie • Rychlý průkaz – Např.infekce Helicobacter pylorii – průkaz produkce ureázy Průkaz nukleových kyselin • Průkaz přítomnosti mikroorganizmu v klinickém vzorku • Druhové identifikace izolovaného mikrobiálního kmene Děkuji za pozornost