Lékařská orální mikrobiologie Téma P ­ 12 Jméno: Kruh: Datum: P12, str. 1 Orální mikrobiologie III - biofilm Úkol č. 1: Nátěr zubního plaku, mikroskopie Podle pokynů vyučujícího zhotovte fixované preparáty zubního plaku - sterilní špachtlí setřete zubní plak. Natřete na podložní sklo, fixujte v alkoholu a obarvěte podle Grama. Pozorujte imerzním objektivem zvětšujícím 100× (celkové zvětšení tedy zpravidla 1000×). Výsledky pozorování zakreslete (všímejte si tvaru a barvy přítomných baktérií). Úkol č. 2: Nátěr mikroflóry dutiny ústní, mikroskopie Podle pokynů vyučujícího zhotovte fixované preparáty stěrů z bukální sliznice či hřberu jazyka. Natřete na podložní sklo, fixujte plamenem a obarvěte podle Grama. Pozorujte imerzním objektivem zvětšujícím 100× (celkové zvětšení tedy zpravidla 1000×). Výsledky pozorování zakreslete (všímejte si tvaru a barvy přítomných baktérií a přítomnosti dalších útvarů). Úkol č. 3: Vliv čištění zubů na orální biofilm Dobrovolník si vypláchne ústa roztokem předloženého barviva dle pokynů vyučujícího. Prohlédněte si výsledek. Zbarvená místa jsou pokryta biofilmem ­ zubním plakem. Popište místa, kde je zubního plaku přítomno největší množství a pozorování zakreslete. Lékařská orální mikrobiologie Téma P ­ 12 Jméno: Kruh: Datum: P12, str. 2 Úkol č. 4: Vliv přítomnosti sacharidů ve stravě na tvorbu zubního plaku Do jednotlivých důlků mikrotitrační destičky obsahující BHI médium suplementované 0 %, 2 %, 4%, 8 % glukózy byl inokulován kmen Streptococcus mutans. Po 2, 8, 16, 24 hodinách kultivace při 37 °C byly příslušné důlky třikrát promyty. Vrstva vytvořeného biofilmu, která zůstala pevně adherovaná na stěnách jamek mikrotitrační destičky, byla obarvena 20 minutovým působením genciánové violeti. Přebytečné barvivo bylo odstraněno z jamek opatrným promytím. Intenzita zbarvení jamek je měřena spektrofotometrem a odpovídá tloušťce vytvořené biofilmové vrstvy. Na přiloženém papíře jsou výsledky spektrofotometrického měření intenzity zbarvení důlků. Z předložených výsledků sestrojte grafy dynamiky tvorby biofilmu pro jednotlivá média. Úkol č. 5: Průkaz mikrobů kolonizujících katétry a) Kvalitativní metoda pomnožení v bujonu Vytažený centrální venózní katétr (CVK) byl ponořen do kultivačního média a kultivován 24 hodin. Poté bylo zakalené kultivační médium vyočkováno na krevní agar. Zhodnoťte nárůst mikroorganizmů na krevním agaru. b) Semikvantitativní metoda (Makiho metoda) Vytažený CVK byl válen po povrchu krevního agaru, který byl poté kultivován. Zhodnoťte nárůst mikroorganizmů a spočítejte narostlé kolonie. Za signifikantní se považuje množství kolonií >15, menší množství se považuje spíše za kontaminaci. Je-li kolonií evidentně více než 100, nepočítejte a napište ,,> 100". c) Kvantifikace pomocí sonifikace katétru Vytažený CVK se ponoří do 10 ml fyziologického roztoku a poté vystaví účinku ultrazvuku, který rozrušuje strukturu biofilmu a jednotlivé bakteriální buňky tak z biofilmu uvolňuje. 100 mikrolitrů takto vzniklé suspenze se naočkuje přímo na krevní agar a rozočkuje sterilní kličkou po celém povrchu krevního agaru. Na připravené Petriho misce spočítejte množství kolonií narostlých na krevním agaru a vypočítejte počet bakterií adherujících na povrch katétru. Je-li kolonií evidentně více než 100, napište ,,> 100". Výsledky: 3a 3b 3c Odhad počtu mikrobů Kterým z uvedených postupů je možno detekovat a kvantifikovat bakterie nejen z biofilmu, přítomného na povrchu katétru, ale i v jeho lumen? _________________________________________________ Které metody umožňují kvantifikovat množství bakterií adherovaných na povrchu katétru? __________________________________________________________________________________________ Lékařská orální mikrobiologie Téma P ­ 12 Jméno: Kruh: Datum: P12, str. 3 Kontrolní otázky: 1. Co to je biofilm? 2. Jaké jsou hlavní složky biofilmu? 3. Jaký je význam orálního biofilmu z hlediska tvorby zubního kazu? 4. Na kterých dalších onemocněních se biofilm podílí? 5. Co komplikuje léčbu biofilmových infekcí? 6. Jaký má smysl kvantifikace mikroba izolovaného z katétru? 7. Jaké jsou předpokládané příčiny vyšší rezistence biofilmu k antibiotikům?