Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 2: Morfologie bakterií, mikroskopie Morfologie a fyziologie, mikroskopie a kultivace Morfologie bakteriální buňky n Z čeho se skládá každá bakterie n Nepovinné složky bakteriální buňky n Jaké jsou tvarové možnosti bakterie n Jaké jsou možnosti uspořádání bakterií n Zvláštní formy života bakterií – spory Z čeho se skládá bakteriální buňka n Stočený chromozom coby předchůdce jádra n Ribozomy, nutné k proteosyntéze n Cytoplasma, prostředí uvnitř buňky n Cytoplasmatická membrána n Buněčná stěna n Vakuoly, buněčné inkluze – dočasná záležitost n Plasmidy n Bičíky a fimbrie n Pouzdro, biofilm Buňky Streptococcus pneumoniae Chromozom a ribozomy n Chromozom kruhového tvaru n Ribozomy jiné než v eukaryotních buňkách n Bakteriální „jádra“ nejsou viditelná v optickém mikroskopu n Kromě chromozomu je genetická informace i v plasmidech (často virového původu) Jak může buňka přijít k plasmidu n Existují v zásadě tři způsoby: transdukce, transformace a konjugace n Pro různé bakterie je typický ten nebo onen, anebo žádný způsob n Je to i prakticky významné – plasmidy kódují třeba i rezistenci na antibiotika Cytoplasma a cytoplasmatická membrána n Jak v cytoplasmě, tak i na cytoplasmatické membráně probíhá řada chemických procesů n Na membráně především ty, které využívají rozdílu např. v koncentraci určitých iontů vně a uvnitř buňky n Membrána zároveň chrání buňku před chemickými a jinými vlivy Buněčná stěna n Grampozitivní bakterie mají buněčnou stěnu tlustou a jednoduchou n Gramnegativní bakterie mají buněčnou stěnu tenkou a složitější n Některé bakterie mají jinou buněčnou stěnu (mykobakteria – acidoresistentní, v buňce jsou mykolové kyseliny) n Některé bakterie (mykoplasmata) buněčnou stěnu vůbec nemají Základem každé buněčné stěny je peptidoglykan (murein) Grampozitivní buněčná stěna Gramnegativní buněčná stěna Fimbrie (pili), curli a bičíky n Mnohé bakterie jsou schopny pohybu n K pohybu slouží hlavně bičíky n Fimbrie mohou vedle pohybu sloužit např. i k adhezi bakterie na povrch, ke konjugaci a podobně n Curli jsou podobné jako pili, ale zakroucené n Bičíky bakterií jsou úplně jiné než bičíky eukaryotních organismů Bakterie s bičíky (Escherichia coli) Pouzdro a biofilm n Pouzdro obklopuje jednotlivou bakterii, popř. dvojici. Není to už integrální součást bakteriální buňky, spíš nánosy molekul (většinou polysacharidů), které buňku chrání n Biofilm je souvislá vrstva, vzniklá z bakterií, jejich pouzder a dalšího materiálu. Biofilm je mnohem odolnější než jednotlivá bakterie, žijící v tzv. planktonické formě Stádia vývoje biofilmu Kontakt planktonické bakterie s povrchem + navázání na tento povrch adhese, růst a shlukování buněk do mikrokolonií produkce polymerické hmoty (matrix, nebuněčná složka) Vytvoření trojrozměrné struktury známé jako biofilm (Z prezentace dr. Černohorské) Neobarvené pouzdro n V barvení dle Burriho byly nabarveny bakterie na červeno a pozadí pak dobarveno tuší, tuší se pak pouzdro tam, kde se nic neobarvilo Sporulace n Sporulace je něco jako zimní spánek, ale dovedený oproti zimnímu spánku zvířat k mnohem větší dokonalosti n Spory přežijí velmi vysoké teploty, vyschnutí, desinfekci a podobně n Spora vzniká jako endospora: buňka se rozdělí, ale neoddělí úplně: jedna část se mění ve sporu, která je zavzata do té druhé buňky n Nepleťme si spory bakterií a spory hub! Spory jsou biochemicky neaktivní, samy o sobě se nebarví Tvarové možnosti bakterií n Koky (kulaté, protáhlé, ploché) n Kokotyčinky n Tyčinky (rovné, zahnuté, s oblými či špičatými konci, tlusté, tenké) n Vláknité bakterie (zvláštní případ tyčinek) n Spirální bakterie – spirochety n Beztvaré bakterie, např. mykoplasmata Zprohýbaná tyčinka – helikobakter Spirochety Ještě jednou spirochety Možnosti uspořádání bakterií n Jednotlivě n Dvojice n Čtveřice, skupiny po 8 n Shluky n Řetízky n U tyčinek: palisády (||||||), řetízky (-----) Koky v řetízcích (elektronová mikrofotografie Enterococcus sp.) Řetízky v Gramově barvení Mikroskopie bakterií n Bakterie jsou dobře viditelné v elektronovém mikroskopu, v praxi se nevyužívá n V optickém mikroskopu jsou viditelné mizerně. Lépe je vidíme, pokud se pohybují n Nemůžeme však spoléhat na pohyblivost bakterií. Zviditelníme je proto jinak: fixujeme je a obarvíme některou z barvících metod Práce s mikroskopem n S mikroskopem zpravidla pracuje mikrobiolog (MUDr., RNDr., Mgr.), avšak i laborant by měl znát základy mikroskopické techniky, včetně údržby mikroskopu n Laborant často připravuje mikroskopické preparáty, musí je umět připravit tak, aby byly dobře viditelné. Nejde jen o samotné barvicí metody, ale i přípravu nátěru (nesmí být příliš řídký, příliš hustý, při fixaci se nesmí spálit aj.) Části mikroskopu – dopadající světlo n Světlo prochází ze zdroje světla přes kolektor a kondenzor. Kvalitu a množství paprsků ovlivňuje n intenzita napětí zdroje světla n irisová clona kolektoru (v dolní části mikroskopu) n nastavení výšky kondenzoru n nastavení clony kondenzoru (apertura) n Výška kondenzoru se obvykle nastaví při zaclonění. V jednom okamžiku okraj clony přestane být modrý a začne být červený – to je ten správný moment. Pak se clona zase rozevře. Zvětšovací optika n V mikrobiologii používáme zpravidla binokulární mikroskop s vyjímatelnými okuláry zvětšujícími 10× n Objektivy se používají 4×, 10×, 20×, 40×, 60× a imerzní objektiv zvětšující 100×. „Imerzní“ znamená, že mezi preparát a objektiv se kápne imerzní olej, jehož index lomu je bližší indexu lomu skla, než v případě vzduchu Zaostřování a vlastní mikroskopie n Aniž bychom se dívali do okuláru, přiblížíme makrošroubem preparát k objektivu na co nejtěsnější vzdálenost n Nyní, již pod kontrolou zraku preparát opatrně oddalujeme, nejdříve makrošroubem, pak i mikrošroubem, až se dostaneme na příslušnou hladinu ostrosti n V některých případech (hlavně u nativních preparátů) není jedna hladina ostrosti, ale je nutno stále přeostřovat na „dno“ a „hladinu“ prostoru vyplněného tekutinou Čištění mikroskopu n Po každém použití imerzního oleje je nutno očistit objektiv gázou s alkoholéterem (méně vhodný, leč použitelný, je benzín) n Občas je nutno očistit i neimerzní objektivy, zejména pokud jsou potřísněny např. olejem n Při potřísnění je také nutno otřít mikroskopický stolek, zde stačí čtvereček buničité vaty s benzínem. Nečistota často ulpívá pod zařízením pro uchycení sklíčka Jednoduché barvení n K jednoduchému barvení můžeme použít kde co, například methylenovou modř n V laboratorní praxi se zpravidla nepoužívá, můžeme ho však doporučit např. při telefonické konzultaci vzdálenému klinickému pracovišti n Fixovaný preparát se přelije jedním barvivem, a po zaschnutí se pozoruje Pohádka (teda, ono to má i reálný základ J) n Byl jednou jeden Dán, a ten se jmenoval Christian Gram. Barvil si bakterie a byl naštvaný. Občas nabarvil vzorek od pacienta, jenže kromě bakterií si obarvil i epitelie, a to se mu nelíbilo. „Hnusné epitelie, zakrývají mi bakterie!“, nadával. n A tak začal bádat. Hledal nějaký postup, při kterém by bakterie zůstaly nabarvené, ale epitelie by barevné nebyly… Pokračování na další obrazovce Pokračování pohádky n Přišel na to, že když vzorek obarví krystalovou nebo genciánovou violetí, a pak vazbu barviva na buněčnou stěnu posílí Lugolovým roztokem, neodbarví se bakterie ani alkoholem. Zato epitelie se odbarví. „Hurá“, zakřičel, když to zjistil. n Jenže záhy zjistil, že s epiteliemi se mu odbarví i část bakterií. „Do pr…kýnka“, zabručel, vypil zbytek alkoholu, co měl na odbarvování, a svou práci mrštil do kouta… A pohádka končí… n O nějakých dvacet let později jistý mladý badatel našel v koutě jedné badatelny zaprášenou práci pana Christiana Grama. n Jak si to tak pročítal, pokyvoval hlavou a říkal si –hm, nebylo to špatné, jen to chtělo něco přidat. n A tak na závěr procesu Gramova barvení přidal dobarvení safraninem (nebo Gabbetem čili karbolfuchsinem). Sice obarvil na červeno nejen odbarvené bakterie, ale i epitelie, ale to mu vůbec nevadilo. Vždyť o přítomnosti epitelií ve vzorku může být užitečné vědět! n A tak vzniklo Gramovo barvení v dnešní podobě. Prof. Hans Christian Gram Gramovo barvení – princip 1 n Grampozitivní bakterie mají ve své stěně tlustší vrstvu peptidoglykanu mureinu. n Díky tomu se na ně pevněji váže krystalová nebo genciánová violeť… n …a po upevnění této vazby Lugolovým roztokem… n …se neodbarví ani alkoholem. n Gramnegativní bakterie se naopak odbarví alkoholem a dobarví se pak na červeno safraninem. Gramovo barvení – princip 2 Vsuvka: Lugolův roztok je směs I[2] a KI Jean Guillaume Auguste Lugol (18. 8. 1786 – 16. 9. 1851) byl francouzský lékař. Narodil se v Montaubanu. Studoval medicínu v Paříži a promoval v roce 1812. Roku 1819 se stal ordinářem v Nemocnici svatého Ludvíka, kde působil až do důchodu. Zajímal se o tuberkulózu a měl přednášku na Královské akademii věd v Paříži, kde se zastával čistého vzduchu, cvičení, studených koupelí a léků. Publikoval čtyři knihy o tuberkulózním onemocnění a jeho léčbě (1829, 1830, 1831, 1834). Navrhl, že by se jeho jódový roztok mohl používat k léčbě tuberkulózy. To tehdy vzbudilo velkou pozornost. I když se Lugolův roztok k léčbě TBC nehodil, byl zato Plummerem s úspěchem použit k léčbě thyreotoxikózy. http://en.wikipedia.org/wiki/Jean_Guillaume_Auguste_Lugol Čtyři hlavní skupiny bakterií podle Gramova barvení Směs G+ a G- bakterií Další barvicí metody n Barvení podle Giemsy – spíše na parazity n Barvení dle Ziehl-Neelsena na acidorezistentní bakteria n Barvení pouzder dle Burriho n Barvení fluorescenčními barvivy Fluorescenční barvení Speciální mikroskopické techniky n Mikroskopie v zástinu – používá se u světlolomných objektů (např. spirochet). Na objekt dopadají paprsky zešikma a do oka dopadnou POUZE ty, které se na něm zlomí n Anglicky se jí říká „darkfield microscopy“ – mikroskopie v temném poli. Pozadí je tmavé, bakterie světlá n Mikroskopie ve fázovém kontrastu využívá fázový posun paprsku Zástinová mikroskopie Nashledanou Příště budeme pokračovat povídáním o fyziologii bakterií a kultivačních půdách