Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 3: Fyziologie bakterií, kultivační půdy Nejprve opakování z minula Množení bakterií n Množení bakterií je základním projevem jejich životaschopnosti n Každá bakterie má svou generační dobu (zpravidla hodiny, u některých dny) n Za jednu generační dobu jsou z jedné dvě, za desetinásobek je z jedné 1024 bakterií (teoreticky) a podobně n Ideální množení by existovalo pouze kdybychom neustále přidávali živiny a popř. kyslík a odebírali odpadní produkty Reálná růstová křivka n Fáze latence – bakterie jsme nechali kultivovat, ale ještě jich nepřibývá n Fáze exponenciální – růst se zrychluje n Fáze stacionární – rostou pořád stejně rychle n Zpomalení a zastavení růstu – došly živiny, je příliš mnoho odpadů, nebo bakterie samy regulují svůj počet pomocí „quorum sensingu“ Fyziologie bakterií n Tak jako každý organismus, i bakterie mají svůj katabolismus a anabolismus n Katabolismus může být trojí: n Fermentace – štěpení bez potřeby kyslíku. Málo energeticky výhodný, ale nepotřebuje kyslík n Aerobní respirace – z mála živin se získá hodně energie, je ale nutný kyslík n Anaerobní respirace – jiný akceptor elektronů Substráty n Fermentovat i respiračně odbourávat lze různé substráty. Substrátem může být polysacharid, monosacharid, aminokyselina, lipid apod. n Pro různé bakterie existují typické substráty, které umějí buďto fermentovat nebo respiračně odbourávat. To se využívá v diagnostice. n Typické substráty zpravidla souvisejí s adaptací mikrobů na určité prostředí. Třeba střevní mikroby umějí odbourávat molekuly, které se ve střevě běžně vyskytují. Příklad – ureázová aktivita helikobaktektera Podmínky n Pro kultivaci bakterií jsou nutné určité podmínky n Nestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit n Podmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí n Nepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se Když se mění určité faktory Kultivace bakterií obecně n Bakteriím musíme připravit přijatelné vnější podmínky – teplotu, vlhkost apod. n Aerobní a fakultativně anaerobní bakterie můžeme pěstovat za normální atmosféry n Striktně anaerobní bakterie vyžadují atmosféru bez kyslíku n Používáme různá kultivační média, sloužící k určitým účelům Pěstování anaerobních bakterií Smysl kultivace bakterií n Proč vlastně v laboratoři bakterie pěstujeme? n Abychom je udrželi při životě a pomnožili. K tomu slouží kultivace na tekutých půdách i na „pevných“ půdách (to jsou půdy, které netečou, jejich základem je většinou agarová řasa) n Abychom získali kmen – pouze pevné půdy n Abychom je vzájemně odlišili a oddělili – používají se diagnostické a selektivní půdy, sloužící k identifikaci Vzorek a kmen n Vzorek je to, co se odebírá pacientovi. Vzorek obsahuje buňky makroorganismu, různý počet druhů mikrobů (nula až třeba dvacet) a další příměsi n Kmen – izolát – je populace jedné bakterie, izolovaná ze vzorku na pevné půdě n Abychom získali kmen, musíme bakterii pěstovat na pevné půdě a dobře rozočkovat Mikrobiologické metody – rozdělení n Metody přímého průkazu n Přímý průkaz ve vzorku (pracujeme s celým vzorkem, například sputem, mozkomíšním mokem, močí apod.) n Identifikace kmene (pracujeme s jedním kmenem, který byl ze vzorku izolován) n Metody nepřímého průkazu – spočívají v průkazu protilátek proti mikrobovi Postavení kultivace v systému metod n Přímé metody (mikrob – část – produkt): n Mikroskopie – průkaz ve vzorku i identifikace n Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace n Biochemická identifikace – jen identifikace! n Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. n Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku n Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku n Nepřímé metody (protilátky) Pojem kolonie n Kolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) n V některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) n Popis kolonií má významné místo v diagnostice Praktická kultivace Kultivační podmínky – opakování n Pro kultivaci bakterií jsou nutné určité podmínky n Nestačí takové, aby bakterie přežívala. Musí být i schopna se množit n Podmínky musí být splněny, co se týče teploty, pH, koncentrace solí a mnoha dalších věcí. Některé jsou dány nastavením termostatu, jiné složením kultivační půdy. n Nepůsobí přitom jednotlivě, kombinují se Konkrétní kultivační podmínky klinicky významných bakterií n Většinou vyžadují teplotu kolem 37 °C, ovšem při různě širokém rozmezí. n Ale bakterie původem z vnějšího prostředí preferují nižší teploty, ptačí patogeny naopak vyšší (ptáci mají vyšší teplotu těla) n Většinou vyžadují koncentrace solí odpovídající fyziologickému roztoku n Ale bakterie zvyklé žít na zpocené kůži snášejí i vysoké koncentrace soli. n Většinou vyžadují pH kolem sedmi n Ale helikobakter, zvyklý žít v žaludku, snese i mnohem nižší pH. Je to dobře, nebo špatně, že různé bakterie jsou různě náročné? n Je to špatně, protože se špatně definují podmínky, které by vyhověli většině (neřkuli všem) klinicky významným bakteriím n Je to dobře, protože díky tomu můžeme i kultivaci využít v diagnostice (např. schopnost růst na půdě s 10 % NaCl dobře odliší stafylokoky Půdy obecně versus půdy v.klinické mikrobiologii n V průmyslové mikrobiologii či v některých jiných aplikacích se zpravidla používají chemicky přesně definované půdy. Víme, kolik je v nich čeho, a můžeme taky sledovat, kolik čeho přibylo nebo ubylo. n V klinické mikrobiologii nepotřebujeme vědět přesné složení. Často i složky půd jsou nedefinované (krvinky, extrakt z kvasnic). Tekuté půdy a pevné půdy n Základem tekutých půd je masopeptonový bujon (hovězí vývar + bílkovinný hydrolyzát). Používají se především k pomnožení. Výsledek se špatně hodnotí: v podstatě jen čirý bujon / zakalený bujon (roste /neroste) n Základem většiny pevných půd je tentýž bujon, ale doplněný výtažkem z agarové řasy. Bakterie na pevných půdách rostou pomaleji, ale zato velmi rozmanitě, a lze je rozočkovat. Různé vzorky – různá kultivace n Jak ovlivňuje typ vzorku typ kultivace? n Vzorky, kde je obvykle málo mikrobů se dávají jen do tekutých půd, kde se mikroby rychle pomnoží. Příklad: výtěr ze spojivkového vaku n Vzorky, kde může být hodně i málo mikrobů a i málo mikrobů je významných očkujeme na pevné i tekuté půdy. Příklad: stěry z ran n Vzorky, kde je většinou hodně mikrobů, popř. i fyziologická běžná flóra se očkují pouze na pevné půdy. Příklad: výtěry z krku Pro připomenutí: Pojmy vzorek a kmen n Vzorek je to, co se odebírá pacientovi. Vzorek obsahuje buňky makroorganismu, různý počet druhů mikrobů (nula až třeba dvacet) a další příměsi n Kmen – izolát – je populace jedné bakterie, izolovaná ze vzorku na pevné půdě n Abychom získali kmen, musíme bakterii pěstovat na pevné půdě a dobře rozočkovat Nejdříve si ale probereme půdy tekuté, i když jimi kmen nezískáme… Tekuté půdy Rozdělení tekutých půd n Tekuté půdy mnoho kategorií nemají. Vlastně jen dvě: n Půdy pomnožovací jsou nejběžnější a univerzální. Příkladem je bujón pro aerobní kultivaci a VL-bujón pro anaerobní kultivaci (VL = viande-levure, z.francouzštiny – obsahuje masokvasničný extrakt) n Půdy selektivně pomnožovací mají za úkol pomnožit určitou bakterii a potlačit množení jiných. Příkladem je selenitový bujón pro salmonely Pevné půdy Pevné (agarové) půdy n Abychom využili všech výhod, které pevné půdy nabízejí, musíme vzorek (kultivace vzorek kmen), ale i kmen (kultivace kmen  kmen) dobře rozočkovat. Klasickým způsobem rozočkování je tzv. křížový roztěr. V praxi se zpravidla natře např. na polovinu misky tamponem a pak se rozočkovává kličkou. Někdy se ještě doplňují různé čáry a disky – o nich jindy. Proč je potřeba mít izolované kolonie n Protože jen v tom případě lze identifikovat větší počet patogenů, které jsou ve směsi n Ale také proto, že pouze jednotlivé kolonie umožňují pozorovat typické vlastnosti kolonie. Sebelepší klaun vám nepředvede nic ze svého umění, držíte-li ho v kamrlíku nahečmaného na spoustu dalších klaunů. V případě směsi vytvoří každá bakterie svoje kolonie (při dobrém rozočkování) Postup očkování vzorku Výtěr z krku – reálný výsledek Pojem kolonie (opakování) n Kolonie je útvar na povrchu pevné půdy. Pochází z jedné buňky nebo malé skupinky buněk (dvojice, řetízku, shluku) n V některých případech můžeme z počtu kolonií odhadnout počet mikrobů ve vzorku – nebo přesněji počet „kolonii tvořících jednotek“ (CFU) n Popis kolonií má významné místo v diagnostice Co lze popisovat u kolonií n Velikost n Barva n Tvar (okrouhlý…) n Profil (vypouklý…) n Okraje (výběžky..) n Povrch (hladký, drsný) n Konzistence (suchá…) n Průhlednost n Vůně/zápach n Okolí kolonie* Pevné selektivní půdy n Účelem je selektovat (vydělit) ze směsi baktérií pouze určitou skupinu nebo skupiny n Příkladem je agar pro stafylokoky s 10 % NaCl n Někdy je selektivnosti dosaženo přidáním antibiotika. Krevní agar s.amikacinem je selektivní pro streptokoky a enterokoky Selektivita hypersolného agaru Půdy diagnostické n Nepotlačují růst žádného mikroba n Zato díky svému složení rozlišují mikroby podle určité vlastnosti n Příkladem je krevní agar ke sledování hemolytických vlastností a VL krevní agar (podobný, ale na anaeroby) n Zvláštním případem půdy chromogenní a fluorogenní Půdy s krví – základ klinické mikrobiologie n Všechny půdy s krvinkami (krevní agar, VL krevní agar, agar s pranými erytrocyty apod. – netýká se ale krevního agaru s 10 % NaCl, kde jsou krvinky lyzovány) jsou schopny rozlišit: Půdy chromogenní a fluorogenní n Chromogenní půdy obsahují barvivo, na které je navázaný specifický substrát à barevnost se ztrácí, není to už barvivo, ale chromogen n Bakterie schopná štěpit specifický substrát změní chromogen zpět na původní barvivo n Půda může obsahovat i více chromogenů (pro více druhů) n Fluorogenní půdy podobné, s.fluorescenčním barvivem Ukázka chromogenní půdy na kvasinky Princip chromogenní půdy Půdy selektivně diagnostické n Kombinují v sobě selektivní a diagnostické vlastnosti n Příkladem půda Endova: n Rostou pouze některé G- bakterie (selektivita) n Ty, co rostou, lze rozlišit na laktóza pozitivní (červené) a negativní (bledé Půdy XLD a MAL na salmonely Půdy selektivní, diagnostické a selektivně diagnostické – shrnutí Půdy obohacené a selektivně obohacené n Jsou určeny pro náročné mikroby n Obsahují různé nutriční faktory n Příkladem čokoládové a Levinthalovy agary pro neisserie a hemofily n Mohou být selektivně obohacené (GC agar), tedy kombinace selektivity a obohacení Půdy ke speciálním účelům n Sledování faktorů virulence (žloutkový agar pro histotoxická klostridia, půda s kongočervení pro stafylokokový sliz) n In vitro testování citlivosti na antimikrobiální látky: Müllerův-Hintonové agar; slouží zároveň ke sledování pigmentů bakterií Poznámka n V případě kultivačně náročných bakterií se i testování citlivosti provádí na obohacených půdách. Současné trendy v kultivaci n Navzdory rozvoji genetických metod si kultivace zachovává svou klíčovou úlohu při diagnostice zejména baktérií n Standardizace nutí přecházet od půd vyráběných „na koleně“ k půdám komerčně vyráběným n Chromogenní a fluorogenní půdy se i přes vyšší cenu zvolna prosazují Pěstování anaerobních bakterií Nashledanou Příště budeme pokračovat povídáním o biochemické identifikaci bakterií