Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 4: Metody identifikace bakterií, principy biochemické identifikace Postavení v systému metod n Přímé metody (mikrob – část – produkt): n Mikroskopie – průkaz ve vzorku i id. n Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace n Biochemická identifikace – jen identifikace! n Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. n Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku n Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku n Nepřímé metody (protilátky) Obecný princip I n Jak jsme si řekli při povídání o fyziologii mikrobů, bakterie mají svůj metabolismus. n Průmyslová mikrobiologie využívá bakteriálního metabolismu (zejména fermentativního katabolismu) k výrobě různých látek, včetně řady potravin n Klinická mikrobiologie využívá vzájemných rozdílů v metabolismu mezi bakteriemi n Zajímají nás přitom mezidruhové rozdíly. Rozdíly mezi kmeny jsou spíše na obtíž Etanolová fermentace Obecný princip II n I mezi savci jsou rozdíly. Člověk neumí tvořit vitamin C, někteří savci ano n Bakterii předložíme určitý substrát a zkoumáme, zda ho bakterie pomocí svého enzymu změní v produkt. Produkt se musí lišit od substrátu skupenstvím či barvou. Neliší-li se, užijeme indikátor n Existuje přitom velké množství způsobů technického provedení tohoto typu testů. Samozřejmě že… n je velký rozdíl, jestli bakterie provádějí fermentaci nebo aerobní respiraci n je rozdíl, jestli bakterie štěpí spíše bílkoviny a aminokyseliny (například rod Proteus) nebo spíše cukry (například rod Klebsiella) n často je štěpení určitého substrátu znakem adaptace na určité prostředí (dobře adaptované enterobakterie štěpí laktózu, kterou nacházejí v našem střevě) Pro připomenutí… Jestlipak víte, že jste se s takovým biochemickým testem už vlastně setkali? Že ne? Ale ano, u kultivace. ENDOVA PŮDA Problémy n Rozdíly jsou i mezi kmeny, nejen mezi druhy n Málokdy pozorujeme, že 100 % či 0 % kmenů určitého druhu tvoří daný enzym n Častěji je to 90 %, 10 %, 70 %, 30 %… n Jak to třeba může vypadat v praxi: Janičkella tvoří lenkulázu v 90 % případů Evičkella tvoří lenkulázu v 10 % případů Lenkuláza-pozitivní mikrob = ??? typická Janičkella ??? atypická Evičkella ??? Problémy – řešení n Sledujeme-li jen jeden znak, je velká pravděpodobnost, že narazíme na atypický kmen a identifikace bude chybná n Je však velmi malá pravděpodobnost, že by se kmen choval atypicky např. v deseti různých testech najednou n Proto čím víc testů, tím větší pravděpodobnost, že se nepleteme Pravděpodobnost výsledku n Jak jsme si řekli, čím více testů použijeme, tím máme lepší šanci, že se nepleteme n Přesto tato šance nikdy není celých 100 % n Dá se vždy říci například, že náš hypotetický kmen je n na 99,3 % Janičkella elegans n na 0,5 % Evičkella pulcherrima n na 0,2 % něco úplně jiného n Je pak na zvážení identifikujícího, zda mu taková míra pravděpodobnosti stačí, nebo provede další rozlišující testy Nejen procento pravděpodobnosti, ale i index typičnosti kmene n Ve skutečnosti je výsledek biochemické identifikace zpravidla charakterizován dvěma čísly, nikoli jen jedním: n % pravděpodobnosti: např. že je 90% pravděpodobnost, že kmen opravdu je Janičkella elegans a ne něco jiného n Index typičnosti: míra shody s „ideálním kmenem“ Janičkella elegans. Pokud je kmen ideální, je T[in] = 1,00; pokud kmen např. netvoří lenkulázu, ačkoli 90 % janičkel ji tvoří, bude T[in] nižší než 1,00 Příklady n Kmen má identifikaci 99 %, index typičnosti 0,95. Ideální stav, pravděpodobně „je to ono“. n Kmen má identifikaci 99 %, ale index typičnosti jen 0,63. Může jít o atypický kmen (je dobré zjistit, který test „mluví proti identifikaci), ale také o chybu diagnostiky n Dva kmeny mají index typičnosti oba 1,00, procento pravděpodobnosti každý 49,5 % (jedno procento zbývá na „jiné“). To znamená, že je to určitě jeden z nich, ale bez rozlišujících testů nezjistíme, který to je. Jednotlivé testy, nebo kombinace? n Jednotlivý test lze použít tam, kde potřebujeme vzájemně rozlišit dvě významné skupiny (čeledi, rody…) a kde existuje test, který má jedna skupina téměř ve 100 % pozitivní a druhá téměř ve 100 % negativní n Kombinace jsou vhodné tam, kde testy mají více pravděpodobnostní charakter, a kde potřebujeme rozlišit více než dvě (někdy i desítky) skupin, rodů, druhů apod. Pohádka n Byl jednou jeden nemocný student Petr. Měl půjčené nějaké věci od spolužáků, a teď ležel s angínou (způsobenou Streptococcus pyogenes) a nemohl jim je vrátit. Poprosil tedy sestru, aby se stavila před praktikem v šatně na mikrobiologii, a spolužákům věci vrátila. Dal jí k tomu příslušné instrukce Co řekl Petr Šárce n Protokoly vrátíš Honzovi. Honza má zelené oči, blond vlasy a nosí červenou mikinu. n Skripta vrátíš Matějovi. Matěj má taky zelené oči, taky blond vlasy, ale nosí modrou mikinu. n CD s Ewou Farnou vrátíš Liborovi. Libor má blond vlasy a nosí modrou mikinu, ale má modré oči. n Fotky z kruhovky vrátíš Frantovi. Má modré oči a modrou mikinu, ale hnědé vlasy Šárka tedy musí sledovat několik znaků n Použít jen jeden znak (třeba oči) by pomohlo při rozlišení dvou studentů, kteří se právě tímto znakem liší. n Pokud je ale potřeba rozeznat studenty v rámci celé skupiny, je nutno většinou kombinovat více znaků n Aby bylo možno rozlišení provést, je nutno předpokládat stálost výskytu znaků (Libor si nesmí obléct zelenou mikinu, Franta si nesmí obarvit vlasy na blond Identifikační tabulka Kdyby Šárka potkala příšeru… n …která by byla napůl Honza a napůl Franta, nemohla by studenta identifikovat. n Stejně je to s bakteriemi. Abychom mohli identifikovat bakterie, musíme mít izolovaný kmen. n Z tohoto praktika existuje výjimka, o které se dozvíte na jaře až budeme probírat G- tyčinky. Možnosti praktického provedení n Rychlé testy (vteřiny až minuty) n Katalázový test n Testy s diagnostickými proužky (oxidáza) n Testy s inkubací (hodiny až dny) n Jednoduché zkumavkové testy n Složité zkumavkové testy n Sady jednoduchých zkumavkových testů n Testy v plastové destičce (miniaturizace) n Jiné testy (např. Švejcarova plotna) Katalázový test n Katalázový test: velmi jednoduchý, do substrátu (roztok H[2]O[2]) rozmícháme bakterie. Bublinky = pozitivita. Princip: 2 H[2]O[2] à 2 H[2]O + O[2] Testy s diagnostickými proužky n Testy s dg. proužky – Reakční ploškou se dotkneme kolonií. V případě pozitivity ploška změní barvu. Nejběžnější jsou tyto: n oxidáza – proužek zmodrá n INAC – proužek po několika minutách zmodrozelená n PYR – proužek po několika minutách, přikápnutí činidla a další minutě čekání zčervená n betalaktamázový strip – týká se testování některých faktorů rezistence (viz příště) Oxidázový test Jednoduché zkumavkové testy n Mohou probíhat v tekuté fázi, nebo v agaru. n V obou případech je ve zkumavce substrát, případně také indikátor. Substrát se může přidat i tak, že je substrátem napuštěna reakční ploška proužku (ONPG-test). n Pozitivita testu = změna zbarvení (v celém objemu, nebo jako prstenec u hladiny) Příklady jednoduchých zkumavkových testů n Arabinóza – tekutá. Zežloutnutí = pozitivní, zůstane zelená = negativní (pro enterokoky) n Simmons citrát – agarová. Zmodrání = pozitivní, zelená = negativní n ONPG a VPT – s přidáním proužku. U ONPG tekutina zežloutne, u VPT se vytvoří červený prstenec u hladiny Složité zkumavkové testy n V jedné zkumavce probíhá více reakcí n Např. test MIU. n M = motility – pohyb (zákal se rozlézá polotekutým agarem, nezůstává jen v místě vpichu) n I = indol (pozitivita = červený prstenec) n U = urea (štěpení močoviny indikuje zrůžovění celé půdy) n Nebo Hajnova půda, která detekuje štěpení glukózy, tvorbu plynu z glukózy, štěpení laktózy a tvorbu sirovodíku MIU n Motility – pohyb. Pohyblivé bakterie rostou nejen kolem vpichu, ale v celém objemu zkumavky. n Indol (tvorba). U bakterií tvořících indol se po přidání Kovácsova činidla vytvoří červený prstenec na styku činidla a půdy n Urea (močovina). Štěpení močoviny – celý objem půdy zrůžoví MIU by samozřejmě šlo dělat i jako tři jednotlivé testy: pohyb… …indol a ureu Hajnova půda n Červený vršek – laktóza negativní n Žlutý vršek – laktóza pozitivní n Červený spodek – glukóza negativní n Žlutý spodek – glukóza pozitivní n Černý spodek – bakterie tvoří sirovodík n Potrhání půdy či odsunutí nahoru – bakterie tvoří plyny při fermentaci glukózy Sady zkumavek n Složité zkumavkové testy mají své nevýhody. Často při pozitivitě jednoho testu není vidět, zda je pozitivní test jiný. Špatně se automatizují a vyžadují dobře zaškoleného pracovníka n Jednodušší, i když někdy dražší řešení, je sada několika jednoduchých zkumavkových testů n Lze ovšem i zkombinovat testy složité a jednoduché (např. Hajna + MIU + Simmons citrát + ornithin dekarboxyláza – v naší labor.) Miniaturizace: testy v plastových panelech n Miniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů à testy v důlcích plastových mikrotitračních destiček. Místo každé zkumavky je jeden důlek n Počet testů v sadách kolísá od sedmi (Neisseria Test) až po více než padesát n Liší se v technických detailech. Vždy je však substrát lyofilizovaný, bakterie se nejprve rozmíchá ve FR nebo suspenzním médiu a pak se kape či lije do důlků Provedení testů od firmy Pliva Lachema (u nás nejběžnější) n Výrobce dodává destičky s lyofylizovanými substráty, umístěnými na dně důlků v destičce n Pracovník připraví suspenzi bakterie ve FR nebo v.suspensním médiu n Do každého důlku se kápne kapka suspenze či dvě kapky n Zbytek suspenze se často ještě využije jako zkumavkový test s diagnostickým proužkem (ONPG, VPT) n Destička i zkumavka se inkubuje v termostatu NEFERMtest 24 Pliva Lachema: do jednoho rámečku lze vložit čtyři trojřádky (čtyři testy, určení čtyř různých kmenů) Zahraniční soupravy Vyhodnocení destičkových testů n Z takového testu dostaneme řadu výsledků – většinou ve tvaru „+“ (test pozitivní, substrát štěpen, došlo ke změně) nebo „-“ (test negativní, substrát nebyl štěpen, zbarvení zůstalo původní). n Příklad: + - + + + - - - - - - - - + + + + n Je několik způsobů, jak takovou řadu převést na „čitelný výsledek“ Možné způsoby hodnocení n Porovnání s tabulkou je možné jen u jednoduchých testů a jasných výsledků. n Přepočet na oktalové kódy plus vyhledání výsledku v seznamu kódů. Nejběžněji používáno n Výsledek se zadá do počítače, který „vyplivne“ vyhodnocení. Ne vždy praktické Počítačové hodnocení se používá hlavně tehdy, pokud už „čtení“ výsledku probíhá automaticky, např. na spektrofotometru. Oktalové kódy – co to je a proč n Matematicky vzato je to vlastně převedení dvojkové soustavy (zápis + + – – + + – – –, respektive 110011000) do osmičkové soustavy (zápis 630) n Z praktických důvodů se zpravidla uvnitř trojice sčítá opačně – normálně by při převodu z dvojkové do osmičkové či desítkové soustavy 1 1 0 měla být šestka a 0 1 1 trojka, v praxi to však počítáme většinou naopak Oktalové kódy – II n V praxi se tedy každé trojici výsledků přiřadí číslice od nuly po sedmičku – viz následující obrazovka n Pokud má test např. 17 reakcí, je na konci místo trojice jen dvojice, v tom případě číslice na konci může být jen 0, 1, 2, 3. Pokud by reakcí bylo 16 (19, 22…) bude na konci nula nebo jednička. Praktický příklad n Zaznamenají se pozitivní a negativní výsledky reakcí n Pod každou trojici se napíše 1 – 2 – 4 n Sečtou se pro každou trojici pouze číslice u „+“, nikoli u „ –“ (ty se přeškrtnou) Přepočítávání trojic Konkrétně u ENTEROtestu16 (17 testů) (530 063 = E. coli, 99,89 %, T[in]=1,00) Jiné identifikační testy n Kromě testů založených přímo na štěpení substrátu, existují i jiné podobné testy, které zkoumají vybavení bakterií určitými enzymy či faktory virulence. Například: n Test schopnosti koagulovat králičí plasmu n Test schopnosti aglutinovat králičí plasmu n Test schopnosti „odpouzdřit“ opouzdřený kmen (hyaluronidázový test) Plasmakoaguláza a hyaluronidáza (oba testy se užívají u stafylokoků) Diagnostické použití antibiotik n Jednou z možností je také testování in vitro citlivosti na určité antibiotikum v případě, že víme, že kmen X je ve 100 % citlivý a kmen Y je ve 100 % rezistentní. Ovšem ani tady těch „sto procent“ nebývá stoprocentních… n Příkladem je třeba optochinový test n Praktické provedení je stejné jako u testů citlivosti na antibiotika, které si probereme příště Optochinový test pozitivní a negativní Nashledanou Příště budeme pokračovat povídáním o antibiotikách