Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 7: A. Antibiotika III (dokončení) B. Pokus na zvířeti C. Genetické metody v mikrobiologii Co nás dnes čeká n Z antibiotik už jsme si probrali n přehled antibiotik n povídání o mikrobiálních rezistencích a polyrezistetních kmenech n povídání o tzv. antibiotické politice n Na dnešek nám zbylo testování citlivosti bakterií n V další části přednášky si pak něco povíme o pokusu na zvířeti v mikrobiologii n A v ještě další části pak něco o využití genetických metod (hlavně PCR) A. Zjišťování sekundárních rezistencí in vitro (v laboratoři): Postavení v systému metod n CÍL 1: ODHALIT PATOGENA n Přímé metody (mikrob – část – produkt): • Mikroskopie – průkaz ve vzorku i id. • Kultivace – průkaz ve vzorku i identifikace • Biochemická identifikace – jen identifikace! • Průkaz antigenu – průkaz ve vzorku i id. • Průkaz nukleové kyseliny – zpravidla jen průkaz ve vzorku • Pokus na zvířeti – zpravidla průkaz ve vzorku n Nepřímé metody (protilátky) n CÍL 2: ZJISTIT CITLIVOST/REZISTENCI PATOGENA NA ANTIMIKROBIÁLNÍ LÁTKY U kterých mikrobů se provádí? n U virů se zatím neprovádí, i když u některých se léčí antivirotiky. Testování citlivosti na antivirotika je zatím v experimentální fázi. n U bakterií se provádí nejběžněji, i když jen u těch, které lze kultivovat (potřebujeme KMEN) n Z hub se provádí jen u kvasinek, u vláknitých hub testovat citlivost na antimykotika nelze n U parazitů se citlivost na antiparazitární látky netestuje Metody zjišťování citlivosti in vitro n Zjišťování citlivosti in vitro = v laboratoři n Nezaručí stoprocentní účinnost léčby n Přesto vhodné u většiny nálezů kultivovatelných patogenních bakterií Difúzní diskový test n Na MH (nebo jiný) agar se štětičkou plošně naočkuje suspenze baktérie n Pak se nanášejí tzv. antibiotické disky – papírky napuštěné antibiotikem n Atb difunduje (prostupuje) z disku agarem dál n Koncentrace atb klesá se vzdáleností od disku n Pokud mikrob roste až k disku, nebo má jen malou zónu, je rezistentní (necitlivý) n Je-li kolem disku dost velká zóna citlivosti (větší než stanovená hranice), je citlivý. Difúzní diskový test učeně – 1 Difúzní diskový test učeně – 2 Difúzní diskový test učeně – 3 Pamatujte si: n V praxi sice porovnáváme zóny (měříme zónu v milimetrech a porovnáváme s hodnotou referenční zóny), ale nepřímo vlastně porovnáváme koncentrace: MIC versus léčebná koncentrace (zvaná také breakpoint) Difusní diskový test po lopatě Difúzní diskový test v praxi: zóny se změří a porovnají s referenčními Někdy jsou příliš velké zóny E-testy n Podobné difúznímu diskovému testu n Místo disku se však použije proužek n V proužku stoupající koncentrace atb od jednoho konce ke druhému (speciální technologie, proto taky je to drahé jak prase). n Zóna není kruhová, ale vejčitá. n Test je kvantitativní n Na papírku je stupnice à jednoduché odečítání E-testy – vyhodnocení Hodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek Někde používají speciální velké misky Mikrodiluční test n Antibiotikum je v řadě důlků v plastové destičce, koncentrace postupně klesá n Nejnižší koncentrace, která inhibuje růst, představuje hodnotu MIC n V přiložené šabloně je zpravidla označen breakpoint. Je-li MIC nižší než breakpoint, je kmen citlivý. Je-li MIC vyšší, je rezistentní n Jedna destička se zpravidla použije pro jeden kmen, např. 12 antibiotik, každé v 8 různých koncentracích (přesněji: dvanácté jen v sedmi, rohový důlek vpravo nahoře je kontrola růstu) Mikrodiluční test – ukázka Příklad odečítání n E: MIC >32, breakpoint =16, závěr: rezistentní n F: MIC = 32, breakpoint = 16, závěr: rezistentní n G: MIC = 8, breakpoint = 32 závěr: citlivý n H: MIC £ 0,1, breakpoint = 8, závěr: citlivý Interpretace stanovení MIC n Ideální je nastolit stav aktivní spolupráce klinického oddělení a mikrobiologie n Pokud se stanovení MIC používá jen kvalitativně (jako „lepší diskový test“), je to škoda n Klinik by měl chtít vědět, jaký je poměr mezi MIC a breakpointem pro jednotlivá antibiotika, a při výběru ATB volit i podle tohoto poměru. n Na druhé straně, konečný výběr antibiotika je na klinikovi – mikrobiolog nezná další souvislosti (alergie, stav jater a ledvin pacienta apod.) Kdy nestačí „citlivost“ n U močových infekcí je důležitý breakpoint odvozený od koncentrací dosažitelných v moči, nikoli v séru. (U většiny močových infekcí se ovšem MIC nezjišťuje) n U abscesů, infekcí kostí a zejména u meningitid: breakpointy jsou vyjádřením koncentrace atb především v séru, jenže v různých místech těla mohou být mnohem nižší n Je také nutno počítat s tím, že mikroby mohou existovat ve formě biofilmu – nutno určovat hodnoty např. minimální biofilm eradikující koncentraci Určování MBIC a MBEC Jak se odečítá MBEC I Destičky A a B se přiloží k sobě a odečítají společně. Dvě destičky jsou nutné proto, že hodnoty v základní destičce, na rozdíl od testování MIC, zpravidla nestačí, takže je destičku nutno „nastavit“ Lze si celou dvojici destiček představit jako jednu destičku, kde je každé antibiotikum v šestnácti různých koncentracích Jak se odečítá MBEC II Zelené kroužky označují důlky s hodnotami MBEC pro atb ve druhém až pátém sloupci. Pro antibiotikum v prvním sloupci nelze hodnotu MBEC určit, je příliš vysoká (vyšší než sledované) Zjišťování faktorů rezistence n Někdy je lépe speciálními metodami zjišťovat přítomnost konkrétních faktorů rezistence, např. betalaktamáz. n Může se jednat o diagnostické proužky (chemický průkaz daného enzymu) nebo testy na jiném principu. n Používá se zejména tam, kde testy citlivosti nedávají spolehlivé výsledky (z různých důvodů, např. nepůsobí testovaná látka přímo, ale jeho metabolit, a podobně) Testování kmenů na produkci běžných betalaktamáz Betalaktamázový test ve formě diagnostického proužku (stripu) Tentýž test ve formě důlků v mikrotitrační destičce Testování na produkci ESBL (širokospektrých betalaktamáz) Výrazný ESBL producent Testování kmenů na produkci betalaktamáz typu KampC n Betalaktamázy KampC jsou druhem širokospektrých betalaktamáz. Na rozdíl od širokospektrých ESBL v uším slova smyslu jsou ale kmeny citlivé na cefalosporiny čtvrté generace n Písmeno K znamená „konstituční“, to znamená, že rezistence je trvalá vlastnost n Testuje se na běžném MH agaru a na MH s oxacilinem. Porovnává se rozdíl ve velikosti zón citlivosti čtyř antibiotik. Stejný kmen na MH a na MH s oxacilinem: porovnejte Detaily předchozích obrázků Betalaktamázy IampC n V tomto případě jde o takzvanou indukovanou betalaktamázu. Rezistence se projeví jen v případě současného působení kyseliny klavulanové. Betalaktamová antibiotika lze použít, ale opatrně (pokud je lze nahradit jinými, raději je nahradíme) n Projeví se tak, že v testu na průkaz ESBL kyselina klavulanová zónu nezvětšuje, ale naopak zmenšuje Betalaktamázy IampC Detekce indukované MLS rezistence u stafyolokoků n Linkomycin je sám ještě citlivý, rezistence však vzniká v přítomnosti erytromycinu. Doporučuje se v těchto případech nepoužívat raději ani jedno z obou antibiotik B. Pokus na zvířeti a C. genetické metody: Pro zopakování n Cílem mikrobiologických metod je zpravidla detekce patogena, popř. určení jeho citlivosti na antimikrobiální látky. n Patogena určujeme n Přímými metodami • detekce celého mikroba (jako morfologické či fyziologické jednotky) • detekce jeho části (antigenu, DNA) • detekce jeho produktu (například toxinu) n Nepřímými metodami: detekce protilátek Přehled metod – opakování n Přímé metody (práce se vzorkem či kmenem) n Mikroskopie (nativní preparát, barvení…) n Kultivace (na tekutých i pevných půdách) n Biochemické a podobné identifikační metody n Průkaz antigenu (pomocí protilátky) n Pokus na zvířeti (izolace, průkaz toxicity) n Průkaz nukleové kyseliny n Nepřímé metody n Průkaz protilátek (pomocí antigenu) B. Pokus na zvířeti n Pokus na zvířeti je jednou z nejstarších metod v.mikrobiologii. Byl neocenitelnou pomůckách v dobách, kdy ještě nebylo k dispozici tolik umělých kultivačních médií, o dalších metodách ani nemluvě. Dodnes se používá tam, kde ještě nenašel náhradu Myš botulinová Autorem tohoto a dalších obrázků je Petr Ondrovčík. Obrázek je graficky upraven. Historický význam pokusu na zvířeti n V dobách Kocha a Pasteura se zjišťovalo, který mikrob vlastně souvisí s kterou nemocí. V této době sehrála pokusná zvířata velice důležitou a nenahraditelnou roli n Proto také pokus na zvířeti („pokusném hostiteli“) má své významné místo v rámci tak zvaných Kochových postulátů. Myš tetanická Kochovy postuláty n Určitý mikrob je etiologickým agens (= původcem nemoci), pokud • je prokázán ve všech případech choroby a jeho rozložení v těle odpovídá pozorovaným poškozením; • je z hostitele vypěstován a v čisté kultuře udržován po několik generací; • takto vypěstovaným mikrobem lze napodobit onemocnění na jiném hostiteli; • je opět izolován z pokusně infikovaného hostitele. Zvíře jako měřítko virulence* n Porovnáváme-li virulenci* různých druhů mikroba nebo různých kmenů stejného druhu, potřebujeme tuto virulenci nějak vyčíslit. n K tomuto účelu lze použít například LD[50]. Je to ukazatel virulence kmene: schopnosti usmrtit n LD[50] = 50% letální dávka. Je to množství mikroba, které usmrtí přesně ݣokusných zvířat Myš vzteklá Použití zvířete n Zvíře tedy můžeme použít n jako kultivační médium, zejména tam, kde nelze použít kultivační médium neobsahující živé buňky (viry, rickettsie, chlamydie) n jako průkaz patogenního působení určitého kmene mikroba n jako průkaz toxicity mikrobiálního toxinu Etický pohled na pokus na zvířeti n Názory na pokusy na zvířatech se různí. Mnoho lidí by je chtělo úplně zakázat, většinou však nedovedou říci, jak je nahradit n Na druhou stranu je řada případů, kdy pokusy jsou prováděny zbytečně, to však není ani tak případ zdravotnictví, jako především kosmetického průmyslu n Legislativa pokusy na zvířatech povoluje, vyžaduje však splnění přísných pravidel Myš septická Etické podmínky pokusu na zvířeti n Každý chov pokusných zvířat podléhá schválení etické komise. Pro každý typ pokusu (ať už v rámci diagnostiky, nebo výzkumu) musí být schválen projekt pokusu. n V každém případě zvířata musí být chována za vhodných podmínek (teplota, vlhkost, kvalita vody, potravy, prostorové podmínky apod.) n Velmi přísné jsou požadavky na provedení pokusu a samozřejmě i způsob usmrcení Vědecké podmínky pokusu na zvířeti n Má-li být pokus na zvířeti eticky alespoň do jisté míry ospravedlnitelný, nesmí být zbytečný, musí mít tedy nějakou vypovídací hodnotu o daném případu. n Snažíme se tedy vždy nalézt u zvířete typické příznaky dané choroby. Pokud to lze, prokazujeme také, že zvíře neonemocní, pokud ho ochráníme specifickým způsobem, například podáním určité protilátky. n Každý pokus na zvířeti musí být pečlivě doložen a zdokumentován. Myš uhynulá Myš Králík Morče Krysa Jiná zvířata n V určitých případech je nutno použít zvláštní zvířata, protože jiná nelze použít. Tak například pro diagnostiku lepry se v určitých případech používá pásovec (na obrázku) n Mnohá zvířata se také používají jako zdroj séra pro sérologické reakce. Zde lze použít např. koňské či kravské sérum. C. Průkaz nukleové kyseliny n Stejně jako pokus na zvířeti je to metoda komplikovaná a nákladná. Obě metody tedy používáme většinou tam, kde běžně používané metody (mikroskopie, kultivace…) selhávají. n Na rozdíl od pokusu na zvířeti však jde o metodu progresivní a velice se rozvíjející n Průkaz NA je možný i z mrtvých buněk. To je výhodné u choulostivých mikrobů. Podařilo se např. i prokázat NA původce tuberkulózy na kosterních pozůstatcích z XI. století. Důležité upozornění n Nehodláme studenty učit principiální otázky týkající se molekulárních metod. K tomu jsou určeny jiné předměty n Naším cílem je seznámit studenty s.přehledem využitelnosti těchto metod v.lékařské mikrobiologii. n Existuje volitelný předmět VSMB081, který vede as. Růžička, kde lze získat hlubší poznatky o této problematice. Rozdělení metod průkazu NA n Metody bez amplifikace (genetické sondy). Jsou méně citlivé, to je někdy i výhoda n Polymerázová řetězová reakce (PCR) velmi citlivá, stačí i jedna molekula DNA. Lze ovšem uměle citlivost snížit. n Ligázová řetězová reakce (LCR) je velmi podobná (ale zavedla ji jiná firma) n Průkaz virové RNA je možný pomocí upravené PCR Použití metod průkazu DNA (RNA) v.klinické mikrobiologii n Tyto metody používáme zpravidla tam, kde mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není vůbec možný n Nehodí se příliš pro běžné patogeny přítomné všude. Pro svou velkou citlivost by ruče vyčenichaly kdejakou molekulu přilétlou z vnějšího prostředí (týká se především metod s amplifikací) n Metody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí, ani samospasitelné, jak si myslí pro změnu jiní Genové sondy bez amplifikace n Jsou nejstarší z tohoto typu reakcí n Používají se v diagnostice například chlamydiových infekcí n Jsou méně citlivé, což může být i výhoda (nezachytí se tak snadno nějaké kontaminace) Genová sonda Použití genové sondy Metody s amplifikací n U nás se nejčastěji používá PCR, tedy polymerázová řetězová reakce n Její vznik umožnilo získání termostabilní polymerázy z bakterie Thermus aquaticus z horkých pramenů (proto se této polymeráze říká Taq polymeráza). n Existují různé možnosti detekce jejích produktů (gelová elektroforéza, ELISA) LCR rusky J Základní schéma reakce PCR n V první fázi je nutno získat izolovanou DNA. Proces je poměrně složitý. n V druhé fázi probíhá vlastní amplifikace (pokud vzorek obsahuje úsek DNA odpovídající příslušnému primeru n Ve třetí fázi probíhá detekce produktu amplifikace n Gelovou elektroforézou nebo n Metodou ELISA (≠ serologická ELISA!!!) PCR proces Postup izolace DNA pro PCR PCR a teplota Proč je důležitá interní kontrola n Velmi běžným jevem je, že dochází k.tzv. inhibici reakce. Inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic) n Proto by měla být pro detekci vždy použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA + primery. Pozitivita IC je dokladem, že nedošlo k inhibici reakce n Ovšem pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (prohraje v.kompletici o nukleotidy). Thermocyklery Možné výsledky PCR Následující možnosti platí bez ohledu na způsob detekce (gelovou elektroforézou nebo ELISou) n Pozitivní výsledek vzorku svědčí o pozitivitě vzorku. Přitom výsledek IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být. n Negativní výsledek vzorku při pozitivním výsledku IC = negativní výsledek reakce n Vzorek i IC negativní = inhibice reakce Přehled interpretace Detekce výsledků PCR pomocí gelové elektroforézy n Gelová elektroforéza je jednou z.možností detekce produktu PCR n Produkty putují gelem od katody směrem k anodě a jsou zviditelněny pomocí UV-transluminátoru n Každý vzorek obsahuje také interní kontrolu (IC) n Kromě vzorků je použit také žebříček (ladder) jako měřítko Ukázka gelu (ladder, pozitivní kontrola, tři vzorky, negativní kontrola) Jiný příklad (upraveno dle www.medmicro.info) Druhá možnost – ELISA n V tomto případě se produkt reakce detekuje pomocí reakce ELISA. Vysvětlení principu této reakce je mimo rámec této přednášky. n Důležité je, že i v tomto případě hraje zásadní roli interní kontrola. Pokud je negativní reakce vzorku i kontroly, jde o inhibici reakce! Odběr a zasílání vzorku na PCR n Pokud komunikujeme se zařízením, které hodlá provést odběr vzorku na PCR, je nutno mít na paměti: n lze použít téměř jakýkoli vzorek, o kterém předpokládáme, že obsahuje mikroorganismy, po nichž pátráme n není nutno zajistit životaschopnost mikrobů (např. transportní půdou) n naopak je třeba omezit riziko inhibice reakce à nejlepší je suchý tampón nebo holý kusový vzorek bez nějakých úprav Interpretace vyšetření PCR n Vyšetření PCR je vždycky nutno interpretovat zároveň s ostatními vyšetřeními n Je potřeba vzít v úvahu, že je to přímý průkaz (neexistuje žádný „průkaz protilátek metodou PCR“, jak je někdy požadováno) n I pokud je PCR centralizováno (např. na genetice, na biochemii), mikrobiologické PCR by měl vždy interpretovat mikrobiolog. Nashledanou Příště budeme pokračovat povídáním o patogenitě a virulenci