Přístrojové metody molekulární biofyziky Obsah přednášky • Biomolekulární vědy mají klíčový význam pro molekulární medicínu. Budeme se zabývat zařízeními pro studium struktury, měření koncentrace (in-vitro i in-vivo), a pro studium vlastností membrán • Nejběžnější zařízení založená na interakci elektromagnetického záření s makromolekulami – VIS, UV a IR spektrofotometry – Ramanovy spektrometry – Zařízení pro měření cirkulárního dichroismu – Zařízení pro rentgenstrukturní analýzu • Zařízení založená na jiných vlastnostech biomolekul (např. mechanických a elektrických) – Elektroforéza • Zařízení pro měření membránových potenciálů a koncentrace iontů v buňkách Nebudeme se zabývat…. • Zařízeními pro měření – Osmolární koncentrace (měření je založeno na kryoskopii), – Difuze – Viskozity (praktická cvičení) • Přístroji pro stanovení sekundární a terciární struktury bílkovin a nukleových kyselin pracujícími na elektrochemickém základě (je studována interakce makromolekul s elektrodami) • Nukleární magnetickou rezonancí (umožňuje např. zjistit, jak je v molekule chemicky vázaný vodík – zmíněno v přednášce o MRI) • Elektronovou spinovou rezonancí, • Centrifugami (jiná přednáška) atd. Biofyzika a biomolekulární výzkum Tento výzkum je orientován zejména na strukturální studie, které umožňují porozumět např.: Ø Specifičnosti enzymatických a imunologických reakcí Ø Účinkům některých léků (např. cytostatik) na molekulární úrovni. Ø Mechanismům pasivního i aktivního transportu Ø Buněčnému pohybu Ø …………….. Zařízení založená na interakci elektromagnetického záření s makromolekulami Druhy spektrofotometrů Ø Spektrofotometry jsou laboratorní přístroje používané pro měření koncentrace látek absorbujících nebo emitujících infračervené, viditelné nebo ultrafialové světlo. Mohou být též použity pro studium jejich chemické struktury. Ø Absorpční spektrofotometry: založeny na spektrální závislosti absorpce světla. Ø Emisní spektrofotometry: Zdrojem světla je sama analyzovaná látka, jež je injektována nebo rozprašována do bezbarvého plamene. Emitované světlo prochází optickým hranolem nebo mřížkou, takže můžeme získat celé emisní spektrum. Frekvence přítomné ve spektru umožňují identifikovat např. přítomné ionty. Ø Spektrofluorimetry: emise světla je vyvolána světlem o vlnové délce kratší než je vlnová délka světla emitovaného. Absorpční spektrofotometry: Lambertův-Beerův zákon Absorpční spektrofotometrie je založena na absorpci světla při průchodu vrstvou roztoku. Jeho koncentrace může být zjištěna pomocí Lambertova-Beerova zákona: I = I[0].10^-^e^cx c je koncentrace rozpuštěné látky, x tloušťka vrstvy, I[0] původní intenzita světla, I je intenzita světla po průchodu vrstvou. Konstanta e (epsilon, absorpční nebo extinkční koeficient) závisí na vlnové délce světla, na rozpuštěné látce a rozpouštědle. Její hodnoty pro běžné chemické sloučeniny lze nalézt v tabulkách. Tyto hodnoty jsou vždy udávány pro určitou vlnovou délku (obvykle absorpční maximum). Číselné hodnoty tohoto koeficientu závisejí na tom, jak je vyjadřována koncentrace rozpuštěné látky. Když použijeme mol.l^-1, hovoříme o molárním absorpčním koeficientu. Poměr intenzit světla prošlého a dopadajícího se nazývá transmitance (dříve transparence). Dekadický logaritmus převrácené hodnoty transmitance se nazývá absorbance A. S ohledem na L.-B. zákon je tedy absorbance přímo úměrná koncentraci rozpuštěné látky a tloušťce absorbující vrstvy roztoku. Druhy absorpčních spektrofotometrů Ø Podle konstrukce rozdělujeme spektrofotometry na jednopaprskové a dvoupaprskové. Ø U jednopaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází nejdříve srovnávacím a pak měřeným vzorkem (kyvety obsahující roztoky musí být pohyblivé). U dvoupaprskových spektrofotometrů jeden svazek světla prochází měřeným vzorkem a druhý srovnávacím vzorkem (blankem). Dvoupaprskové přístroje umožňují podstatně rychlejší měření, avšak jsou dražší. U jednoduchých přístrojů je nastavování vlnové délky světla ruční. U pokročilejších přístrojů se toto nastavování děje automaticky, což umožňuje přímo získávat absorpční křivky, tj. grafy závislostí absorbance na vlnové délce světla. Moderní UV/VIS/NIR spektrofotometr Absorpční UV spektrofotometrie Ø Ultrafialové (UV) světlo je absorbováno různými sloučeninami, zejména těmi, které mají konjugované dvojné vazby. Jak bílkoviny, tak nukleové kyseliny silně absorbují UV světlo, což lze využít pro jejich zkoumání. – Aminokyseliny tryptofan a tyrosin mají absorpční maxima při přibližně 280 nm. Fenylalanin při 255 nm. – Nukleotidy (dusíkaté báze) mají absorpční maxima v oblasti 260 - 270 nm. – Chromofory – jejich absorpční vlastnosti se mění podle chemického složení prostředí. Absorpční spektra aminokyselin Hypochromní efekt (HE) Ø Absorpce světla je ovlivňována dipólovými momenty chemických vazeb, které interagují s fotony. Stochasticky (náhodně) orientované dipólové momenty (denaturovaná bílkovina) absorbují světlo lépe než ve stavu uspořádaném (šroubovice). U bílkovin je HE způsoben peptidovými vazbami, které mají UV absorpční maximum kolem 190 nm. Ø Dvoušroubovice DNA absorbuje UV světlo lépe než DNA denaturovaná (neuspořádaná). Ø Helicita – relativní zastoupení uspořádaných částí makromolekuly Hypochromní efekt u kys. polyglutamové. Při pH 7 tento polypeptid tvoří stochastické (neuspořádané) klubko (1), při pH 4 získává šroubovicovou strukturu (2). Absorpční maximum peptidových vazeb je snížené vlivem jejich prostorového uspořádání. e je molární absorpční koeficient a l je vlnová délka UV světla. [dle: Kalous a Pavlíček, 1980] IR spektrofotometrie Ø Infračervené záření (IR) působí na rotační a vibrační stavy molekul. Složité molekuly mohou vibrovat nebo rotovat mnoha různými způsoby (módy). Různé chemické skupiny (-CH[3], -OH, -COOH, -NH[2] atd.) mají specifické vibrační a rotační frekvence, a proto absorbují IR světlo o specifických vlnových délkách. Ø Z tohoto důvodu mají infračervená absorpční spektra mnoho maxim. Změna chemické struktury se projevuje jako změna polohy těchto maxim ve spektru. Infračervené spektrum hexanu vyjádřené jako závislost transmitance na vlnočtu http://www.columbia.edu/cu/chemistry/edison/IRTutor.html Ramanova spektrometrie Ø Rayleighův rozptyl světla. Nastává interakce fotonů s molekulami, jež se projevuje jen velmi malou nebo žádnou změnou vlnové délky. Intenzita rozptýleného světla závisí na molekulové hmotnosti a také na úhlu rozptylu, což lze využít pro odhad tvaru makromolekul. Ø Ramanova spektrometrie. Při rozptylu fotonů nastává malá změna (posun) vlnové délky, způsobená malým poklesem nebo zvýšením energie rozptýlených fotonů během přechodu z původního do změněného vibračního nebo rotačního stavu interagující molekuly. Tyto stavy se mohou měnit v důsledku strukturálních změn molekul. Ø Proto změny v Ramanových spektrech (intenzita signálu v závislosti na posunu vlnové délky) odrážejí konformační změny molekul. Ramanova spektrometrie Optická rotační disperze Metodou optické rotační disperze (ORD) měříme závislost optické aktivity na vlnové délce světla. Tato metoda však byla nahrazena citlivější metodou cirkulárního dichroismu (CD), která poskytuje podobné informace. Cirkulární dichroismus (CD) Ø Měření optické aktivity (schopnosti stáčet rovinu polarizovaného světla). Konformační změny molekul mohou být sledovány jako změny optické aktivity při použití speciálního polarimetru. Ø U metody CD srovnáváme absorbance levotočivě a pravotočivě cirkulárně polarizovaného světla, jehož vlnová délka je blízká absorpčnímu maximu bílkoviny. Ø CD lze využít též pro studium struktury nukleových kyselin. Rentgenstrukturní analýza Krystalová mřížka působí na rentgenové záření jako optická mřížka na viditelné světlo. Nastávají ohybové jevy a na stínítku se objevuje difrakční obrazec. Tyto obrazce mohou být matematicky analyzovány, aby se získala informace o rozložení elektronů v molekulách tvořících krystal. Krystalogram B-DNA získaný v r. 1952 Rosalindou E. Franklinovou, na jehož základě Watson a Crick navrhli dvoušroubovicový model struktury DNA. Metody založené na měření mechanických a elektrických vlastností makromolekul Velikost a tvar makromolekul můžeme studovat na základě měření: Osmotického tlaku (velikost, přednáška ″Termodynamika a život″) Difuzního koeficientu (velikost, přednáška ″Termodynamika a život″) Viskozita (tvar, praktická cvičení) Sedimentace (velikost, přednáška ″Zařízení pro elektrochemickou analýzu. Pomocné laboratorní přístroje ″ Dále můžeme použít: Elektronovou mikroskopii (velikost a tvor, přednáška ″Mikroskopie″) Chromatografii – molekulárně síťový efekt u gelové permeační chromatografie (chemie) Elektroforézu (konec této části přednášky) Zařízení pro elektroforézu Elektrochemické vlastnosti koloidů Koloidy jsou roztoky, které obsahují částice o velikosti 10 – 1000 nm. Některé molekulární i micelární koloidy jsou polyelektrolyty s amfoterními vlastnostmi. Tyto amfolyty se chovají buď jako zásady nebo kyseliny v závislosti na pH prostředí. Vznik elektrické dvojvrstvy na povrchu koloidní částice Dva mechanismy: Ø Adsorpce iontů (i u hydrofobních koloidů) Ø Elektrolytická disociace (převažuje u hydrofilních koloidů) Dvojvrstva na povrchu částice se liší v koncentrovaných a zředěných elektrolytech. U zředěných elektrolytů můžeme v celé iontové atmosféře částice rozlišit stabilní, difuzní a elektroneutrální oblast. Elektrokinetický potenciál – z (zeta)-potenciál Elektroforéza Ø Elektroforéza – pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Při rovnoměrném přímočarém pohybu sférické částice o poloměru r, je elektrostatická síla působící na částici v rovnováze se silou tření, jež je dána viskozitou. Sílu tření lze vypočítat dle Stokesova vzorce: F = 6.p.r.h.v kde v je rychlost částice a h je dynamická viskozita prostředí. Ø Elektrické pole působí na částici silou: F = z.e.E kde z je počet elementárních nábojů nesených částicí, e je elementární náboj (1,602.10^-19 C) a E [V.m^-1] je intenzita elektrického pole v daném místě. Ø Rychlost částice je pak v důsledku rovnosti obou sil: Elektroforetická pohyblivost Ø Elektroforetická pohyblivost u nezávisí na intenzitě elektrického pole. Je definována jako podíl rychlosti částice a intenzity elektrického pole. Platí: Měření membránových potenciálů Ø Membránové potenciály se měří s pomocí skleněných mikroelektrod, tj. skleněných kapilár s velmi jemnou úzkou špičkou. Průměr otvoru na konci špičky musí být menší než 1 mm, aby nedošlo při zavádění do buňky k jejímu významnému poškození. Vnitřní prostor špičky kapiláry je naplněn roztokem KCl o koncentraci 3 mol.l^-1. Jako elektroda srovnávací se používá elektroda stříbrochloridová umístěná do mimobuněčného prostoru. Ø Pro skleněné mikroelektrody je charakteristický vysoký vnitřní odpor (kolem 10 MW), takže potřebujeme pro měření vysoce kvalitní zesilovače, abychom zamezili zkreslení měřeného napětí. Experimentální uspořádání pro měření membránových potenciálů kapilárními mikroelektrodami Metoda patch-clamp („terčíkový zámek“) Autor: Vojtěch Mornstein Obsahová spolupráce: Viktor Brabec, Carmel J. Caruana Grafika: Lucie Mornsteinová Poslední revize: červen 2009