Téma P01: Diagnostika stafylokoků K nastudování: Rod Staphylococcus. (z internetu, učebnic apod.) Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace. Úkol č. 1 Mikroskopie infekčního materiálu Popis (napište názvy útvarů a spojte je šipkami s objekty nakreslenými vlevo) V mikroskopu sledujte preparát obarvený podle Grama. Popište a zakreslete sledované útvary. Všímejte si přítomnosti bakterií (jejich tvaru, barvitelnosti a množství) dále také leukocytů, epitelií a vzájemného poměru mezi nimi. Tabulka pro souhrn výsledků úkolů 2 až 7 (k postupnému vyplnění): Kmen A B C D Gramovo barvení – Úkol č. 2 Kulti- vace (krevní agar) Úkol č. 3 Velikost Barva Tvar Profil Hemo- lýza Jiné Úkol č. 4: růst na KA + 10 NaCl Úkol č. 5: kataláza (pište „+“ či „–“) DÍLČÍ ZÁVĚR¨ Úkol č. 6a: Test Clump. faktor (/-) Úkol č. 6b: Plasma-koaguláz. test (+/-) Úkol č. 6c: Test hyaluronidázy (+/-) Úkol č. 7: STAPHYtest 16 KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol č. 2 Mikroskopie kultur mikroorganismů Kmen A Kmen B Kmen C Kmen D Obarvěte podle Grama čisté kultury předložených mikroorganismů. Výsledky pozorování zakreslete a zapište. Úkol č. 3 Růst na krevním agaru Vyplňte tabulku v řádku Úkol č. 3. Do „jiných“ napište to zajímavé, co se nevejde jinam. Úkol č. 4 Růst bakterií na krevním agaru s 10 % NaCl Zhodnoťte schopnost růstu předložených kmenů na krevním agaru s 10 % NaCl, který slouží jako selektivní půda pro stafylokoky. Zapište „+“ pokud kmen roste a „–“ pokud neroste. Úkol č. 5: Katalázový test Prokažte přítomnost enzymu katalasy. Setřete mikrobiologickou kličkou kolonie předložených kmenů a vneste je do kapky 3% H[2]O[2] na podložním sklíčku. Zaznamenejte reakci u všech kmenů. Do tabulky pište „+“ a „-“. Pozitivitu charakterizují _____________________, zatímco ____________________ je negativní. Nyní vyplňte řádek „Dílčí závěr“. Napište STAF, pokud se kmen ukázal býti stafylokokem, a JINÝ, pokud je to něco jiného. Úkol č. 6 Testy pro diferenciaci S. aureus 6a) Test na clumping faktor (test vázané plasmakoagulázy) Na podložní sklíčko kápněte kapku ředěné králičí plazmy. Pomocí sterilní mikrobiologické kličky v ní suspendujte vyšetřovaný kmen stafylokoka. Přítomnost plasmakoagulázy se projeví aglutinací bakteriálních buněk. Výsledek vyšetření zaznamenejte. Kmen ______ 6b) Plasmakoagulázový test (test volné plasmakoagulázy) Do 0,5 ml 10× ředěné králičí plazmy bylo suspendováno několik kolonií vyšetřovaného kmene stafylokoka. Suspenzi inkubujeme v termostatu při 37 °C. Výsledek se odečítá po 1, 2 a 24 hodinách. Jako pozitivní reakce se hodnotí, pokud dojde ke koagulaci králičí plasmy ve zkumavce, tj. dojde k zrosolovatění celého obsahu zkumavky, příp. alespoň části. Zapište a zakreslete výsledek této reakce u vybraných kmenů po 24 hodinách inkubace.. Negativní výsledek Pozitivní výsledek 6c) Detekce hyaluronidázy Na krevním agaru jsme naočkovali asi 2 cm široký pás Streptococcus equii, bakterie, která tvoří silné pouzdro s obsahem kyseliny hyaluronové. Kolmo k této čáře byla naočkována čára vyšetřovaného kmene stafylokoka. Pokud je příslušným kmenem stafylokoka hyaluronidasa produkována, difunduje do okolí a do druhého dne způsobí lýzu pouzdra Streptococcus equii. To se projeví půlkruhovou zónou „ztráty slizovitosti“ v pásu naočkovaného Streptococcus equii. Zakreslete výsledek reakce (včetně pozitivní a negativní kontroly) a popište. Úkol č. 7 Bližší určení stafylokoků pomocí biochemických testů Pro identifikací stafylokoků je určena sada biochemických testů. Podle návodu k použití odečtěte výsledky jednotlivých reakcí. Názvy testů i jejich výsledky pro jednotlivé kmeny zapište a na základě interpretačních tabulek zjistěte, o které druhy stafylokoků jde. VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A A + + + - - - + + - 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 0 3 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index VPT 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A B + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 7 Kód: Identifikace Staphylococcus ___________ % pravděpod. T index Úkol č. 8 Citlivost stafylokoků k antibiotikům Zjistěte citlivost předložených kmenů stafylokoků k vybraným antibiotikům, pomocí diskového difusního testu. Citlivost k předkládaným antibiotikům zhodnoťte na základě srovnání zjištěného průměru inhibiční zóny s příslušnou hraniční zónou. Seznam testovaných antibiotik a hodnoty jejich hraničních zón najdete v přiložené tabulce. Výsledky testu pro jednotlivá antibiotika (průměr inhibiční zóny i interpretaci) zapište. Antibiotikum (plný název, ne zkratka) S. aureus S. epidermidis Průměr zóny (mm) Interpretace Průměr zóny (mm) Interpretace Kontrolní otázky 1. Jaké jsou významné charakteristické vlastnosti rodu Staphylococcus (metabolické, morfologické a růstové)? 2. Jak odlišíme S. aureus od tzv. koagulázanegativních stafylokoků? S. aureus Koaguláza negativní stafylokoky 3. U kterých dalších stafylokoků, mimo S. aureus, se můžeme setkat s přítomností plasmakoagulázy? 4. Co je to clumping factor? 5. Jaká jsou nejvýznamnější protistafylokoková antibiotika? 6. Co je to MRSA a jaké přináší problémy při terapii stafylokokových infekcí?