Téma P03: Dg. některých dalších grampozitivních baktérií (enterokoků, listerií, korynebakterií, bacilů) K nastudování: Enterococcus, Listeria, Bacillus, Corynebacterium (ze skript, učebnic, internetu). Z jarního semestru: Mikroskopie, Kultivace, Biochemická identifikace Tabulka pro hlavní výsledky úkolů číslo 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Kulti- vace (krevní agar) Úkol 2 Velikost Barva Tvar Profil Změny agaru Jiné Katalázový test Úkol č. 3a Slanetz-Bartley Úkol č. 3b Žluč-eskulinová půda Úkol č. 3c Arabinózový test Úkol č. 4a EnCoccus test Úkol č. 4b Růst v ledničce Úkol č. 5a DEFINITIVNÍ ZÁVĚR* *U G+ tyčinek napište pouze rodové jméno. Druhové určení by vyžadovalo přesnější testy, které nemohou být v praktiku provedeny. Úkol č. 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte písmeny popsané kmeny. Obarvěte je podle Grama a výsledky zaneste do tabulky. Nezapomeňte na důležité detaily („tyčinky v palisádách“, „robustní, sporulující tyčinky“ a podobně). Aby nedošlo k záměně, popište sklíčka dermografem. U bakterií, které nebudou grampozitivní, neprovádějte další úkoly. Úkol č. 2: Morfologie kolonií G+ koků a tyčinek Popište kolonie jako obvykle. V popisu vynechte gramnegativní bakterie, ale prohlédněte si je pro srovnání. U kmenů, které jste identifikovali jako G+ tyčinky, se pokuste uhádnout, o jakou bakterii by mohlo jít, podle následující charakteristiky: Bacillus – velké, ploché, suché, plsťovité kolonie, „rozlézající“ se po povrchu agaru, někdy s výraznou hemolýzou, jindy zcela bez ní. Mikroskopicky velmi robustní tyčinky, někdy s nálezem centrálně až subterminálně uložených spór, jež mohou, ale nemusí bubřit tyčinku. Listeria – bezbarvé až našedlé kolonie, velmi podobné enterokokovým, bez hemolýzy nebo s hemolýzou, mikroskopicky drobnější než Bacillus, neuspořádané v palisádách, ale spíše v krátkých řetízcích. Corynebacterium (a blízké rody) – šedavé nebo bělavé kolonie podobné stafylokokovým, ale někdy i o hodně menší, většinou bez hemolýzy; v mikroskopii spíše menší než předchozí, ale kyjovité a uspořádané do palisád. Úkol č. 3: Některé běžné biochemické a kultivační testy a) Katalázový test Proveďte katalázový test pro všechny kmeny, které jsou G+. Všimněte si, že Listeria, Corynebacterium i Bacillus jsou pozitivní, ovšem některé koryneformní tyčinky jiné než vlastní Corynebacterium (např. Arcanobacterium) jsou kataláza negativní. b) Růst na Slanetz-Bartleyho půdě Na misce máte naočkované tytéž kmeny jako v úkolu 1. Pozitivní jsou ty, které nejen rostou, ale navíc mají typickou červenohnědou barvu. Na této půdě rostou pouze enterokoky. Výsledek zapište do tabulky. c) Růst na žluč-eskulinové půdě Na rozdíl od předchozí umožňuje žluč-eskulinová půda nejen růst rodu Enterococcus (to umožňuje rozlišit jej mezi G+ koky), ale také Listeria (diagnostická mezi G+ tyčinkami). Zapište výsledek do tabulky. Úkol č. 4: Vzájemné rozlišení enterokoků a) Arabinózový test pro druhové rozlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků Prověřte dva kmeny, které byly určeny jako enterokoky. Prohlédněte si zkumavky s výsledkem arabinózového testu. Žlutá barva znamená pozitivitu (typická pro Enterococcus faecium) a zelená negativitu (typická pro Enterococcus fecalis). b) Biochemický test k druhovému rozlišení enterokoků ze závažných klinických materiálů (je schopen najít více než ony dva nejdůležitější druhy) V závažných případech raději použijeme spolehlivější druhové určení než je orientační určení arabinosovým testem ve zkumavce. Použijeme biochemický test v plastové destičce, v našich podmínkách nejčastěji EN-COCCUStest. Povšimněte si, že i v něm je obsažen test štěpení arabinózy. Odečtěte u obou kmenů z předchozího úkolu biochemický mikrotest podle návodu.. Kmen: H G F E D C B A Kód: Identifikace: 1 2 4 1 2 4 1 2 % pravděpodobnosti: Index typičnosti: Kmen: H G F E D C B A Kód: Identifikace: 1 2 4 1 2 4 1 2 % of probability: Index typičnosti: Úkol č. No. 5 Další metody k diagnostice listerií a): Růst listerií při 4 °C Prohlédněte si kmen, který jste předběžně určili jako listerii, a který byl kultivován při chladničkové teplotě. Zapište výsledek testu (roste – neroste) do tabulky. b): Demonstrace růstu Listeria monocytogenes na chromogenní půdě Prohlédněte si obrázek nárůstu listerií na chromogenní půdě. Půda je specifická pouze pro tento druh. V klinické mikrobiologii se chromogenní půdy pro listerie příliš nevyužívají, mají však velký význam v potravinářství. Výsledek: Na půdě s názvem __________ má L. monocytogenes kolonie barvy ___________ Úkol č. No. 6: Testy citlivosti enterokoků a grampozitivních tyčinek na antibiotika Provedení: Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako Entecococcus fecalis, Enterococcus faecium, Listeria sp., a Corynebacterium sp.. Test na Bacillus sp. byste hledali marně – ve většině případů jsou bacily považovány za kontaminaci z prostředí a tudíž nebývají testovány. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivosti. Na kartičce máte napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a dubiózní (D). Kmen Antibiotikum (celý název) Æ zóny(mm) Interpr. Æ zóny(mm) Interpr. Æ zóny(mm) Interpr. Æ zóny(mm) Interpr. Úkol č. No. 7 Demonstrace Elekova testu Prohlédněte si obrázek výsledku Elekova testu k průkazu toxicity kmene Corynebacterium diphtheriae vypěstovaného z krku pacienta s pseudomembranosní (pablánovou) anginou. Zakreslete (včetně popisu). Kontrolní otázky: 1. Které grampozitivní tyčinky jsou sporulující? Jsou spóry vždy viditelné? 2. Proč v testované sadě vůbec nejsou obsaženy cefalosporiny? (Sada slouží primárně k testování enterokoků.) 3. Co jsou to VRE a proč nás zajímají? 4. Které bakterie (jiné než listerie) ještě rostou při chladničkové teplotě? 5. Co jsou to metachromatická granula a jaký význam má (či spíše mělo) jejich barvení v diagnostice záškrtu? 6. Jaké je využití Bacillus stearothermophilus a Bacillus subtilis v lékařské mikrobiologii? (Viz J05)